Name: במבחנת תמלול מבחנים ויישומם ותרופות דיסקברי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: למדו מבחן תמלול מבחנת לחקר שלבי הרגולציה המורכבים בזמן תמלול. השיטה מאפשרת הדמיה ישירה של מוצרי התמלול לאורך ציר זמן מג'ל ריצוף RNA אחד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו מכירה במענק קריירה מוקדמת של הפקולטה מאוניברסיטת ניוקאסל (CM).

זהירות: ניסויים כרוכים בשימוש של איזוטופ רדיואקטיבי 32 P ולא עבודה צריכה להתבצע עד שכל תנאי הבטיחות המתאימים מולאו. באופן כללי אנשים נדרשים להשתתף בקורס בטיחות ועוברים בפועל בפיקוח לפני ניסויים באמצעות ריאגנטים רדיואקטיבי. אנא בציוד מגן אישי (מד מינון thermoluminescent, משקפי מגן, כפפות, מעילים במעבדה חדר קרינה, מכנסיים באורך מלא, סגורות נעליים) בעת ביצוע התגובה. 1. הכנת חומרי Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את הנדרש חלבונים עבור assay תמלול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך הניסוי המתואר כאן, overproduce ולטהר E. coli RNAP במעבדה כמתואר 11, או להשיג ממקור מסחרי (רשימת חומרים). הערה: שניהם מספקים תוצאות דומות. שיטות אחרות לטיהור RNAP שכותרתו יליד או זיקה יכולות לשמש גם 12,13. גורמי Sigma / נוסה ניתן להשיג גם דescribed בעבודה קודמת 14,15. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) מים מטופלים הערה: לחילופין, RNase ללא מים ניתן להשיג ממקורות מסחריים (רשימת חומרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל diethyl pyrocarbonate (DEPC) עד 1 ליטר של מים מטוהרים (0.1% v / v) ומערבבים לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים וטיפים DEPC החיטוי פעמיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תבנית ה- DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר פלסמיד pSG1154 16 ו / או pIA226 17 באמצעות ערכת טיהור פלסמיד (רשימת חומרים) על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגביר את תבנית עבור מבחני שעתוק נגר (שבר 360 נ&quot;ב המקיף באזור P xyl האמרגן), להרכיב תגובת PCR על הקרח כולל 25 μl תערובת 2x PCR (חומרים רשימה), 2 μl כל אחד פריימרים (5 מיקרומטר) : 5&#39;-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 &#39;(קדימה) 5&#39;-CCCATTAACATCACCATC-3&#39; (הפוכה), 1 μl pr פלסמיד pSG1154eparation (250 מיקרומטר) ו -20 μl מים מטוהרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> או לחלופין, עבור מבחני שעתוק סיבוב בודד, להגביר שבר 447 נ&quot;ב המקיף באזור האמרגן λ P R מ pIA226 17. הגדרת תגובת PCR על הקרח באמצעות 25 μl תערובת 2x PCR, 2 μl כל אחד פריימרים (5 מיקרומטר): 5&#39;-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 &#39;(קדימה) 5&#39;-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3&#39; (הפוכה), 1 μl pIA226 17 הכנה פלסמיד (250 מיקרומטר) ו -20 μl מים מטוהרים). הערה: תבנית זו נעדרת ציטוזין עד לתפקיד +26 NT, המהווה את נוקלאוטיד -26 מאתר תחילת שעתוק. לכן, שעתוק באמצעות תבנית זו תאפשר ייזום, אישור אמרגן השתהות בבית +26 NT להקים קומפלקס התארכות שעתוק יציב (EC) כאשר ATP, UTP בלבד GTP נוכחי התגובה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תגובת PCR עם התנאים הבאים: 95 °; צלזיוס למשך 30 שניות, 50 ° C למשך 30 שניות, 72 ° C למשך 30 שניות, חוזרות במשך 30 מחזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את המוצר באמצעות ערכת ניקוי PCR (רשימת חומרים) על פי הוראות היצרן ו elute חיץ שעתוק 100 μl עבור assay שעתוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ריכוז ה- DNA תבנית באמצעות fluorospectrometer (רשימת חומרים). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת NTP הערה: NTPs ניתן להשיג ממקורות מסחריים שונים (רשימת חומרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים NTPs (≥99% טהור) במים DEPC שטופלו לעשות 1 M מלאי, aliquot 1 מ&quot;ל של התמיסה לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל (50 μl בצינור אחד) ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזמין α- 32 P UTP (3,000 Ci / mmol) לפני הניסוי. 32 P יש זמן מחצית חיים קצר של 14.29 ימים. הערה: UTP שימוש שכותרתו אלפא ימנע השוואת עוצמת להקות עם אורך שונה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין סולם RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב את המעקבing התגובה בטמפרטורת החדר: 0.5 מיקרוגרם Mix תבנית רנ&quot;א (רשימת חומרים), 80 pH7.5 חיץ HEPES מ&quot;מ, 12 מ&quot;מ MgCl 2, 10 mM NaCl, 10 מ&quot;מ DTT, 2 מ&quot;מ ATP / CTP / GTP, 0.5 מ&quot;מ UTP, 2 μl α- 32 P UTP, 0.5 μl RNAP T7 (רשימת חומרים), DEPC שטופלו מים עד 20 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תגובה להמשיך ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. להשתמש מיד או לאחסן ב -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. הכנת RNA רצף ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הצלחות מן מנגנון ג&#39;ל רצף (רשימת חומרים) פעמים עם אתנול 70% ומים מטוהרים, ולהרכיב את התא עם מסרק ושני מפרידים. הערה: צלחת אחת יכולה להיות מצופים מגיב siliconizing (רשימת חומרים) כדי להקל על הסרת ג&#39;ל שלב 4.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים אוריאה 33.6 גרם ב -22 מ&quot;ל מים 16.4 מ&quot;ל של 5x טריס / Borate / EDTA חיץ (TBE) (54 גרם טריס (hydroxymethyl) aminomethane; 27.5 גרם חומצת בור; 10 מ&quot;ל של 1 M ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), pH 7.4 ב 1 מי L) באמצעות בוחש מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 16 מ&quot;ל של 40% Acrylamide / bis-acrylamide פתרון (19: 1) לפתרון אוריאה ולסנן דרך פילטר 0.45 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 514 μl 10% (w / v) persulfate אמוניום מוכן טרי במים ואחריו 51.4 μl N, N, N &#39;, N&#39; -Tetramethylethylenediamine (TEMED) לפתרון מסוננים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפוך את הפתרון ג&#39;ל כדי למנוע אוורור יתר ולהזריק מייד בצורה חלקה לתוך התא רצף מראש ארז הממוקם אופקי מחור ההזרקה התחתון. תשמור על עצמך כדי להימנע בועות במהלך הזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר 1-1.5 שעות עד הג&#39;ל מוגדר לחלוטין לפני השימוש ב assay שעתוק. הג&#39;ל ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר למשך יומיים או שלושה, כאשר עטוף רקמה מים רטוב על החלק העליון של התא רצף. </li></ol></li></ol> בתגובה שעתוק 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay השהיית תמלול התארכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כינונה של קומפלקס התארכות שעתוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של אנזים הליבה rnab (1 מיקרומטר המניות חיץ שעתוק) לצינור 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של גורם סיגמא-70 מטוהרים (σ 70; 3 מיקרומטר המניות חיץ שעתוק) אל RNAP דגירה על קרח למשך 10 דקות כדי ליצור RNAP holoenzyme. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 תבנית ה- DNA מטוהרים μl 500 ננומטר (האמרגן R P λ מהמוצר pIA226 PCR) במאגר שעתוק אל holoenzyme RNAP לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי ליצור המתחם פתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת של מרכיבי התגובה אחרת צינור 1.5 מ&quot;ל באמצעות 5 μl של חיץ שעתוק 10x (רשימת חומרים: 400 מ&quot;מ טריס- HCl, 1.6 KCl M, 100 מ&quot;מ MgCl 2, 10 mM DTT, 50% גליצרול, pH 7.9 ב DEPC שטופלו מים), 2 μl של 250 מיקרומטר אחד GTP ו UTP, 1 μl של 1 מ&quot;מ ATP, ו 1 μl של α- 32 P UTP (3,000 Ci / mmol). מוסיפים מים מטופלים DEPC ל -41 μl. לאטה: מעכב RNase (רשימת חומרים) שניתן להשתמש בהם כדי למזער את זיהום RNase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את פתרון תערובת הצינור המכיל המתחם הפתוח לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי ליצור את מורכבות התארכות שעתוק עצר +26 NT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התגובה לטמפרטורת החדר (~ 21 ° C) ולהוסיף 1 μl של 2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ריפמפיצין לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של 0.1 מ&quot;מ מטוהרים נוסה לתערובת התגובה דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של 250 מיקרומטר CTP לתוך התערובת לתגובה ליצור נפח סופי של 50 μl ולמדוד את זמן התגובה באמצעות טיימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 5 μl של פתרון התגובה לתוך 2 μl של חיץ טעינת ג&#39;ל RNA (לפוראמיד 95%, 0.05% bromophenol כחול cyanol קסילן 0.05%) ב 30, 60, 120, 240, 480, ו -1,200 שניות כדי להרוות את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך 32 P UTP טיפים וצינורות בתוך המשך פסולת רדיואקטיביתainer. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמלול ייזום Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כינונה של הקומפלקס להרחיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל מטוהרים σ 70 כדי 0.5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1.1.1 כדי 3.1.1.3 באמצעות 0.5 מיקרומטר (במקום 3 מיקרומטר) מטוהרים σ 70, ואת תבנית ה- DNA (באזור האמרגן P xyl ממוצר pSG1154 PCR). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכוב של assay ייזום שעתוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את מעכבי שנועדו למנוע היווצרות RNAP holoenzyme כדי אנזים הליבה RNAP לפני תוספת של σ 70 (אחרי 3.1.1.1 שלב), ואחריו צעדים 3.1.1.2 ו 3.1.1.3 לבחון האם מעכב הוא מסוגל לשבש holoenzyme היווצרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לאחר שלב 3.1.1.2, להוסיף מעכב לבחון האם הוא מסוגל לעכב תחרותי σ 70 קשירה RNAP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משתמש באותה הכמות של DMSO, הממס של המעכב, במקום מעכב היםטוק בתגובות שליטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלמת התגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים הפרין במים לריכוז מלאי של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו המניה ב -20 ° C. הערה: הפרין הוא מתחרה של ה- DNA שיכול לעקל RNAP שלא יצר מורכבות פתוחות. לאחר במתחם הפתוח נוצר, הפרין לא יכול להיכנס לאתר DNA המחייב של RNAP ומעכב שעתוק מתסביך פתוח מראש יצר. לכן, הפרין נדרש רק עבור מבחני יחיד עגול; זה אינו נחוץ עבור מבחנים רבים-עגולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת התגובה באמצעות 5 μl של 10x חיץ שעתוק (רשימת חומרים), 1 μl של 1 מ&quot;ג / פתרון הפרין מ&quot;ל, 1 μl של 10 מ&quot;מ כל ATP, GTP, ו CTP, 2.5 מ&quot;מ UTP, ו 1 μl של α- 32 P UTP (3,000 Ci / mmol). מוסיפים מים מטופלים DEPC 45 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את תערובת התגובה עם מורכבות שעתוק פתוחות, הספין הדופק לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 10 μl של תגובה כהlution לתוך 5 μl של חיץ טעינת ג&#39;ל RNA (לפוראמיד 95%, 0.05% bromophenol כחול cyanol קסילן 0.05%) כדי להרוות את התגובה. </li></ol></li></ol></li></ol> ריצה ופיתוח 4. RNA ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרצת ג&#39;ל denaturing polyacrylamide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הג&#39;ל על 50 מעלות צלזיוס ו -50 W במאגר 1x TBE כ 1.5 שעות עד לטמפרטורה של ג&#39;ל למאגר יציב ב -50 ºC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם דגימות ב 90 ºC למשך 30 שניות ולהעביר אותם על טעינה לפני קרח על הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות טען לתוך הבורות העליון של ג&#39;ל לצד נתיב אחד המכיל 2 סולם RNA μl (1: 100 דילול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הג&#39;ל על 50 וואט ו -50 ºC במאגר 1x TBE עד לצבוע בכחול bromophenol מגיע ~ 2/3 למטה הג&#39;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הג&#39;ל הטיפולי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב לאט ובזהירות להפריד את הצלחת העליונה מתא הרצף. להקדיש תשומת לב רבה כדי למנוע את שבירת ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cut chromatograpHY נייר (רשימת חומרים) כדי להתאים את גודל ג&#39;ל מלמעלה צבע כחול bromophenol. השתמש מונה גייגר כדי לאשר את המיקום המשוער של תעתיקי רנ&quot;א שכותרתו רדיואקטיבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לכסות את הג&#39;ל עם נייר הסינון, ולחץ בחוזקה עד הג&#39;ל שומר על נייר הסינון. חותכים וזורקים את החלק התחתון של הג&#39;ל פסולת רדיואקטיבית כמו NTPs מאוגדים עד לבסיסו של ג&#39;ל, אשר יכול להיות חם מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח פיסה בגודל דומה של נייר סינון על מיטת הייבוש של מכונת ואקום ייבוש, ובזהירות להניח את הנייר מצופה-ג&#39;ל על זה עם הצד ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את ג&#39;ל עם בניילון יבש ב 60 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוטפים את הצד השני של נייר הסינון מצופה ג&#39;ל בניילון נצמד, ומניחים על צלחת זרחן photostimulable במקרה הדמיה, עם זמן חשיפה מתאימה, אשר יכול לנוע בין 1 hr לילה תלוי יעילות התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת צלחת זרחן באמצעותסורק תרמי על פי הוראות היצרן. לקבוע את עוצמת הלהקה יחסית באמצעות תוכנת ImageJ פי הוראות התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מונה גייגר לבדוק את זיהום רדיואקטיבי באזור העבודה, לנגב את הפריטים החשודים ואזור עם רקמות חומר ניקוי ולהיפטר הרקמה בתוך המיכל לרשות. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+by+RNA+polymerase%3A+recognition+of+regulatory+signals+during+RNA+chain+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation.</a> J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).</li>
<li>Burgess, R. R., Anthony, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+sigma+docks+to+RNA+polymerase+and+what+sigma+does%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).</li>
<li>Gusarov, I., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+intrinsic+transcription+termination+by+N+and+NusA%3A+the+basic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms.</a> Cell. 107 (4), 437-449 (2001).</li>
<li>Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NusA+N-terminal+domain+is+necessary+and+sufficient+for+enhancement+of+transcriptional+pausing+via+interaction+with+the+RNA+exit+channel+of+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase.</a> J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).</li>
<li>Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+RNA+polymerase+and+the+elongation+factor+NusA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA.</a> RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).</li>
<li>Artsimovitch, I., Henkin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+approaches+to+analysis+of+transcription+termination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro approaches to analysis of transcription termination.</a> Methods. 47 (1), 37-43 (2009).</li>
<li>Decker, K. B., Hinton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+regulation+at+the+core%3A+Similarities+among+bacterial%2C+archaeal%2C+and+eukaryotic+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases.</a> Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).</li>
<li>Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+easy+to+stop+RNA+polymerase%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Is it easy to stop RNA polymerase?</a> Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).</li>
<li>Murakami, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+bacterial+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structural biology of bacterial RNA polymerase.</a> Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).</li>
<li>Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+transcription+as+a+target+for+antibacterial+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).</li>
<li>Yang, X., Ma, C., Lewis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vector+system+that+allows+simple+generation+of+mutant+Escherichia+coli+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase.</a> Plasmid. 75, 37-41 (2014).</li>
<li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+large+scale+purification+of+Escherichia+coli+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase.</a> J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).</li>
<li>Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-overexpression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+subunits+allows+isolation+and+analysis+of+mutant+enzymes+lacking+lineage-specific+sequence+insertions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).</li>
<li>Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+transcription+inhibitor+of+RNA+polymerase+holoenzyme+formation+by+structure-based+drug+design%3A+From+in+silico+screening+to+validation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation.</a> ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).</li>
<li>Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase-induced+remodelling+of+NusA+produces+a+pause+enhancement+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex.</a> Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).</li>
<li>Lewis, P. J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+vectors+for+controlled+expression+and+dual+labelling+of+protein+fusions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis.</a> Gene. 227 (1), 101-110 (1999).</li>
<li>Artsimovitch, I., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pausing+by+bacterial+RNA+polymerase+is+mediated+by+mechanistically+distinct+classes+of+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).</li>
<li>Vassylyev, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+bacterial+RNA+polymerase+holoenzyme+at+2.6+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution.</a> Nature. 417, 712-719 (2002).</li>
<li>Artsimovitch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+transcription+regulation+by+alarmone+ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp.</a> Cell. 117 (3), 299-310 (2004).</li>
<li>Bordier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+rifampicin-resistant+RNA+synthesis+by+rifampicin-RNA+polymerase+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+lett%22%5BJournal%5D)">Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes.</a> FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).</li>
<li>Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+assay+to+measure+the+real-time+kinetics+of+nucleotide+incorporation+during+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation.</a> J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בכל היצורים, שעתוק הוא תהליך מוסדר בחוזקה. מבחני שעתוק במבחנה פותחו כדי לספק פלטפורמה לבדיקת ההשפעות של גורמי שעתוק, מולקולות קטנות ומעכבי שעתוק. במאמר בשיטה זו, assay שעתוק חיידקים כללי תוארה. מבחני תמלול בשילוב עם ג&#39;ל אלקטרופורזה רצף של תמלילים חשובים מאוד עבור מחקרים מכניסטית, מאחר שהם מאפשרים הדמיה של כל מוצרי השעתוק לאורך ציר זמן. כתוצאה מכך, בשיטה זו היא מסוגלת לזהות את ההשפעה של שינויים קלים בתנאי תגובה ומגלה מנגנון מתקבל על דעת של פעולה. יתר על כן, הו...

תמלול הוא התהליך שבו RNA מסונתז מתבנית DNA ספציפית. בתאים איקריוטיים ישנם שלושה RNAPs ברורים: RNAP שאני מעתיק מבשרי rRNA, RNAP השנייה אחראי לסינתזה של mRNA ו RNAs הגרעיני הקטן מסוים, ואת הסינתזה של 5S rRNA ו tRNA מבוצעת על ידי RNAP III. אצל חיידקים, יש רק אחד RNAP אחראי שעתוק של כל סוגי RNA. ישנם שלושה שלבים של שעתוק: ייזום, התארכות והפסקה. תמלול הוא אחד התהליכים המוסדרים הגבוה ביותר בתא. כל שלב במחזור שעתוק מייצג מחסום להסדרת ביטוי גנים 1. לקבלת החניכה, RNAP יש לשייך גורם סיגמא לגבש holoenzyme, אשר נדרש לכוון את האנזים לאתרים ספציפיים בשם היזמים 2 כדי ליצור תסביך האמרגן פתוח. בהמשך לכך, חבילה גדולה של גורמי שעתוק האחראים o תקנהf RNAP פעילויות במהלך שלבי התארכות והפסקה. גורם השכפול נבחן כאן הוא החלבון השמור ביותר וחיוני, נוסה. הוא מעורב בויסות שהשהית שעתוק והפסקה, כמו גם סיום אנטי במהלך סינתזת rRNA 3-5. במבחנה מבחני שעתוק פותחו כלים רבי עוצמה כדי ללמוד את הצעדים הרגולטוריים מורכבים במהלך שעתוק 6. באופן כללי, שבר ליניארי של DNA כולל אזור האמרגן נדרש כתבנית עבור שעתוק. תבנית ה- DNA בדרך כלל מופק על ידי PCR או על ידי ליניאריזציה פלסמיד. חלבונים NTPs מטוהרים (כולל רדיואקטיבי אחד NTP למטרות זיהוי) מתווספים אז המוצר ניתח בעקבות התקופה הנדרשת של דגירה. שימוש בתבניות מתאימות ותנאי תגובה, בכל שלבי שעתוק נבחנו באמצעות גישה זו אשר אפשרה אפיון מולקולרי מפורט של transcription לעומת מחצית המאה הקודמת 7. בשילוב עם מידע על המבנה 3-הממדי של RNAP זה גם יכל לחקור את המנגנון המולקולרי של עיכוב שעתוק על ידי אנטיביוטיקה מובילה אנטיביוטי, ולהשתמש במידע זה בפיתוח תרופות חדשות, שיפור 8-10. בעבודה זו אנו מספקים דוגמאות לאופן מבחני שעתוק יכולים לשמש כדי לקבוע את מנגנון הוויסות ידי התארכות שעתוק / גרם סיום נוסה, ואיך את מנגנון הפעולה של עופרת מעכב ייזום שעתוק רומן ניתן לקבוע.

<table><tbody><tr><td>השג את החלבונים הנדרשים לבדיקת</td><td></td><td></td><td></td> שעתוק</tr><tr><td>E. coli RNAP</td><td>Epicentre</td><td>S90250</td><td></td></tr><tr><td>הכנת מים שטופלו ב-DEPC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דיאתיל פירוקרבונט (DEPC)&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>מים ללא RNase&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמביון מים ללא נוקלאז</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr> אשף <tr><td>הכנת</td><td></td><td></td><td></td>תבנית DNA</tr><tr><td>&nbsp; בנוסף&nbsp;SV Minipreps מערכת טיהור DNA</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>ACCUZYME Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25028</td><td></td></tr><tr><td>PCR פריימרים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אשף SV ג'ל ומערכת ניקוי PCR&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300 פלואורוספקטרומטר</td><td>תרמו מדעי</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NTP הכנה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>U1006</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>G3776</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>C9274</td><td></td></tr><tr><td>rNTPs בטוהר גבוה GE</td><td>Healthcare</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-32P UTP&nbsp;</td><td>פרקיןאלמר&nbsp; &nbsp;</td><td>BLU007C001MC</td> הכנת סולם RNA <td>תרכובת רדיואקטיבית</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תערובת תבנית סמן RNA מושלמת של Novagen 0.1&ndash; 1 kb</td><td>Millipore</td><td>69003</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAP</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>הכנת</td><td></td><td></td><td></td>ג'ל</tr><tr><td>Sequi-Gen GT תא רצף חומצות גרעין&nbsp;</td><td>ביו-רד&nbsp; &nbsp;</td><td>165-3804</td><td></td></tr><tr><td>סיגמקוט&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>אוריאה SL2</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>טריס(הידרוקסימתיל)אמינומתאן&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td></td><td></td>154563</tr><tr><td>חומצה בורית&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>40% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich </td><td>T9281</td><td></td></tr><tr>בדיקת <td></td><td></td><td></td><td>שעתוק</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>ריפמפיצין&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>קסילן ציאנול&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>הפרין&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>84020</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNasin Ribonuclease</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>מאגר שעתוק&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריס בייס</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>גליצרול DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td>נייר סינון <td>G5516</td><td></td></tr><tr><td></td> Whatman&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> נייר כרומטוגרפיה 3 מ"מ Chr</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr>מטהר <td></td><td></td><td></td><td>רדיואקטיבי</td></tr><tr><td>דקון 90</td><td>דקון</td><td>דקון 90</td><td></td></tr> טיפול <tr><td>בג'ל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>טייפון Trio+ הדמיה</td><td>GE Healthcare מדעי החיים</td><td>63-0055-89</td><td></td></tr></tbody></table>

במבחנת תמלול מבחנים ויישומם ותרופות דיסקברי

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

במבחנת מבחני שעתוק פותחו בשימוש נרחב במשך שנים רבות כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים שעתוק. תהליך זה דורש RNA פולימראז רב למקטע תלוי DNA (RNAP) וסדרה של גורמי שעתוק שפועלים כדי להשפיע על פעילותם של RNAP במהלך ביטוי גנים. רצף ג&#39;ל אלקטרופורזה של תמלילי רדיואקטיבי משמשת כדי לספק מידע מכניסטית מפורט על איך תמורת שעתוק ומה פרמטרים יכול להשפיע על זה. במאמר זה נתאר את הפרוטוקול ללמוד כיצד גורם התארכות החיונית נוסה מסדיר ששהייה תעתיק, כמו גם שיטה לזיהוי סוכן אנטיבקטריאלי מיקוד ייזום שעתוק באמצעות עיכוב של היווצרות holoenzyme RNAP. שיטות אלה יכולים לשמש כפלטפורמה לפיתוח גישות נוספות כדי לחקור את מנגנון הפעולה של גורמי התעתוק אשר עדיין אינו ברור, כמו גם Agen אנטיבקטריאלי חדשts מיקוד שעתוק אשר מהווה יעד תרופה מנוצלים במחקר ופיתוח אנטיביוטי.

יעילות השעתוק יכול להיקבע על ידי מדידת רמת הקרינה הלהקות בנקודות זמן שונות. את assay השהיה כדי לבדוק את הפונקציה של גורם נוסה לאפשר הדמיה של הפסקה, פיטורין, לבין נגר מוצרים (איור 1 א). בנוכחות של תחום N-terminal של נוסה (נוסה NTD; שאריות חומצת אמינו 1-137), חזות של מוצרי RNA התעכבה באופן משמעותי לעומת ניסוי השליטה החסר נוסה. מחיקת שאריות חומצת אמינו 104-137 (Helix 3) של שהבר נוסה, או יישונה אלאנין של סדרה של חומצות אמינו (שאריות K3...

בכתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול לבחינה תפקודית של שעתוק ופעילות מעכבת של חומרים אנטיבקטריאליים המכוונים לשעתוק חיידקים.

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

המטרה הכללית של בדיקת השעתוק in vitro זו היא לחקור את השלבים הרגולטוריים המורכבים במהלך השעתוק, באמצעות אספקת פלטפורמה לבדיקת השפעותיהם של גורמי שעתוק, מולקולות קטנות ומעכבי שעתוק. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בביולוגיה מולקולרית, כגון המנגנונים המדויקים הקשורים לבקרת שעתוק, תפקודם של גורמי שעתוק בעלי מנגנונים לא ידועים, והשפעותיהם של מעכבי שעתוק רגילים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ויזואליזציה ישירה של כל תוצרי השעתוק לאורך ציר זמן מג'ל ריצוף RNA בודד.התחילו את הפרוצדורה על ידי ניקוי כפול של לוחות ממכשיר ג'ל לריצוף באמצעות 70% ethanol ומים מזוקקים. הרכיבו את התא עם מסרק ושני מפרידים. המסמיכו 33.6 grams של urea ב-22 milliliters של מים וב-16.4 milliliters של תמיסת TBE buffer בריכוז פי חמישה באמצעות מערבל מגנטי.הוסיפו 16 milliliters של תמיסת אקרילאמיד 40%אקרילאמיד, תמיסת אקרילאמיד זו לתמיסת השתן (urea), וסננו דרך מסנן של 0.45 micrometer. הוסיפו לתמיסה המסוננת 514 microliters של תמיסת 10%ammonium persulfate שהוכנה טרי. לאחר מכן הוסיפו 51.4 microliters של TEMED.הפוך בעדינות את תמיסת הג'ל כדי למנוע אוורור מרובה, והזרק באופן מיידי וחלק מחור ההזרקה התחתון אל תוך תא ריצוף (sequencing cell) מילוי-מראש הממוקם באופן אופקי. הקפד להימנע מיצירת בועות במהלך ההזרקה. הש

in-vitro-transcription-assays-and-their-application-in-drug-discovery

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

פיתחנו assay כמותיים-DNA מחייבת, המבוסס על ELISA למדוד אינטראקציות עם גורם שעתוק ה-DNA. סגוליות גבוהה לחלבון Runx2 הושג עם oligonucleotide DNA לזיהוי קונסנסוס ונוגדנים חד שבטיים ספציפיים. איתור Colorimetric עם תגובת מצע נוגדנים בשילוב אנזים היה פיקוח בזמן אמת.

כמותי Assay לחקר חלבון: אינטראקציות-DNA, רגולטורים גלו תעתיק של ביטוי גנים, ולזהות חומרים אנטי סרטניים רומן

גליום (III) 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) והאנלוגי Freebase להציג cytotoxicity תא מייקרו הנמוך. כתב יד זה מתאר תגובת RNA שעתוק, RNA הדמיה עם ג'ל מוכתם ברומיד ethidium, ו- RNA כימות עם ספקטרוסקופיה UV-Vis, על מנת להעריך עיכוב שעתוק על ידי corroles ומדגימה שיטה פשוטה של ​​הערכת נכסי מועמד אנטי-סרטני.

<em&gt; במבחנה</em&gt; אנזימתי Assay למדוד תמלול עיכוב על ידי גליום (III) ו- H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-טריס corroles (pentafluorophenyl)

כאן, ניטור בזמן אמת של חילוף החומרים של תאי הגידול, בשילוב עם מודל ממברנה כוריו-אלנטואית של עובר עוף (CAM) של גרורות, משמשים להערכת מטרות/סוכנים אנטי-סרטניים חדשים על יכולתם לעורר רגישות לתאי גידול לכימותרפיה הפוגעת ב-DNA.

הערכת היעילות של תרופות למלחמה בסרטן רגישות<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

כאן אנו מתארים בדיקת גן מדווח מבוססת תאים ככלי רב ערך לסינון ספריות כימיות עבור תרכובות המווסתות מנגנוני בקרה פוסט-שעתוק המופעלים באמצעות 3' UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

עמידות לתרופות לטיפולים ממוקדים היא נרחבת והצורך לזהות מנגנונים של התנגדות - לפני או אחרי הופעה קלינית - היא קריטי להדרכת אסטרטגיות ניהול קליניות חלופיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגזירה כמה קווים עמידים לתרופות במבחנה עם רצף לזרז גילוי המנגנונים אלה.

הטמעה של<em&gt; במבחנה</em&gt; תרופות מבחני התנגדות: למקסם את הפוטנציאל לחשיפת מנגנוני התנגדות קלינית רלוונטיים

בעבודה זו אנו מספקים זרימת עבודה ניסיונית כיצד ניתן לזהות משפרים פעילים ולאמת אותם בניסוי.

חיזוי ותיקוף של גן בקרה אלמנטים הופעל במהלך החומצה הרטינואית מושרה גזע עובריים התמיינות תאים

אנו מציגים במחקר הנוכחי הוא assay קרינה מבוססת רומן באמצעות לימפוציטים נגזר עכבר מהונדס. Assay זה מתאים להקרנה תפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות קטנות ניחן קיבולת אחד עיכוב או קידום ההפעלה הלימפוציטים.

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את התקנת תרגום mRNA ב-poxvirus תאים נגועים באמצעות מבחנה מבוסס RNA המבוסס לוציפראז כתבת הכתב. ניתן להשתמש באותו שיטת לימוד בקרת תרגום על ידי cis-אלמנטס של mrna, כולל 5 '-אזור בלתי מתורגם (utr) ו-3 '-utr. ניתן גם לבדוק מצבי שונה של ייזום תרגום באמצעות שיטה זו.

ב מחוץ לחוק העתק RNA-מבוססי לוציפראז העיתונאי שיטת המחקר בקרת תרגום ב Poxvirus-תאים נגועים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבחירה חוץ גופית של מדכאי שעתוק מהונדסים (ETR) עם יעילות השתקה גבוהה, ארוכת טווח, יציבה, על המטרה ופעילות נמוכה מחוץ למטרה. תהליך עבודה זה מאפשר לצמצם רפרטואר ראשוני ומורכב של תעודות סל מועמדות לרשימה קצרה, המתאימה להערכה נוספת במסגרות רלוונטיות מבחינה טיפולית.

במבחנה בחירת מדכאי שעתוק מהונדסים להשתקה אפיגנטית ממוקדת

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מתרביות תאים ex vivo או in vitro לעיבוד מקדים של נתוני תמלול לסינון תרופות מבוסס תמלול חסכוני.

בדיקת תרופות מבוססת תמלול חסכונית

למדו מבחן תמלול מבחנת לחקר שלבי הרגולציה המורכבים בזמן תמלול. השיטה מאפשרת הדמיה ישירה של מוצרי התמלול לאורך ציר זמן מג'ל ריצוף RNA אחד.

במבחנת תמלול מבחנים ויישומם ותרופות דיסקברי

גלה סרטונים נוספים