גיבוש ליפידים אוטומטי bilayer ממברנה באמצעות סרט polydimethylsiloxane רזה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתאר שיטה שניתן להשתמש בה כדי לחקור היווצרות דו-שכבתית אוטומטית של שומנים באמצעות סרט דק של פולידימתילסילוקסן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הננו-חיישנים לגבי אינטראקציות ממברנה-חלבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיווצרות שכבת השומנים היא אוטומטית וניתנת לשחזור.

כדי להתחיל, הכינו את תמיסת החיץ על ידי שילוב אשלגן כלורי, טריס הידרוכלוריד ו-EDTA במים מזוקקים. לאחר מכן, התאם את ה-PH של התמיסה ל-8.0. לאחר מכן, סנן את התמיסה באמצעות פילטר 0.2 מיקרון, וחיטוי התמיסה ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר מכן, הכינו את תמיסת השומנים לצביעה מוקדמת על ידי המסת 3% מהשומן בתערובת המורכבת משני חלקים undecane ושמונה חלקים hexadecane בנפח. מערבבים את התמיסה למשך הלילה בעזרת מסובב. כמו כן, הכינו את תמיסת השומנים להיווצרות הממברנה על ידי המסת 0.1% מהשומן באותה תערובת של שני חלקים undecane ושמונה חלקים hexadecane בנפח.

מערבבים את התמיסה הזו למשך הלילה גם על מסובב. על מנת להכין סרט דק PDMS, מערבבים תשעה חלקים פרה-פולימר עם חומר ריפוי חלק אחד בכוס ערבוב. הכניסו חמישה גרמים של התערובת הזו לצלחת פטרי, וסובבו את המנה בטמפרטורה של 800 סל"ד למשך 10 שניות, ליצירת סרט בעובי של 200 עד 250 מיקרון.

לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי לתוך מייבש ואקום ומשכו ואקום של 100 מיליטור למשך שעתיים כדי להסיר את בועות האוויר שנותרו. לאחר מכן, אופים את הסרט הדק בתנור במשך חמש שעות בחום של 70 מעלות צלזיוס כדי לפלמר את ה-PDMS. לאחר הקירור, חותכים את הסרט הדק המפולמר לשני סנטימטר על שני סנטימטרים, ומשתמשים באגרוף בקוטר 500 מיקרון כדי ליצור צמצם קטן במרכז הריבוע.

לאחר מכן, השתמש במיקרופיפטה כדי לצבוע מראש את הפתחים במיקרוליטר אחד של תמיסת השומנים 3%. כדי ליצור את תא ממברנת השומנים השחורים, תכנן שני בלוקים סימטריים לתא באמצעות תוכנת ציור תלת מימד. לאחר מכן, ייצרו את החדר באמצעות בלוק של PTFE ומכונת CNC.

כדי להרכיב את החדר, הנח את הסרט הדק PDMS הצבוע מראש בין שני גושי ה-PTFE, כך שהצמצם על הסרט הדק PDMS מרוכז עם החור בתא. השתמש בזכוכית כיסוי ובשומן ואקום כדי לאטום את הקצוות החיצוניים של החדר. לאחר האיטום, יש לשתק את החדר המורכב באמצעות אגוזים וברגים.

חשוב לוודא שהתא אטום היטב כך שלא תהיה דליפת נוזלים. בעזרת פיפטה, הפקידו 0.5 מיקרוליטר מתמיסת השומנים 0.1% על צמצם הסרט הדק PDMS, המורכב עם החדר. לאחר מכן, הנח את החדר בסביבה מקוררת מתחת ל-10 מעלות צלזיוס ואחסן אותו עד שהוא נחוץ.

ליצירת קרום שומנים שחור עם הרכבה עצמית מזורזת, משוך את החדר מהמקרר והוסף שני מיליליטר מתמיסת החיץ לכל צד של החדר. הניחו את החדר בצד למשך 10 דקות עד שמבשר הממברנה הקפואה מפשיר. לאחר מכן, הנח את החדר על מיקרו מניפולטור כדי לשלוט במדויק בגובה ביחס למקור האור והמיקרוסקופ.

בעזרת תאורת סיבי הלוגן אופטיים, האירו צד אחד של החדר כדי להאיר את הצמצם של הסרט הדק PDMS. בצד השני, מקם מטרה פי 20 בקו אחד עם הצמצם והתבונן במרכז שבו הצבע הופך בהיר יותר מהטבעת. למדידה חשמלית, הכינו אלקטרודות כסף כלוריד על ידי הנחת חוט כסף בעובי 208 מיקרומטר בתמיסה של נתרן היפוכלוריט למשך דקה אחת לפחות.

לאחר מכן, חבר את האלקטרודות למגבר מיקרואלקטרודה. לאחר מכן, הנח את אלקטרודות כלוריד הכסף בכל צד של החדר, כך שיהיו בתמיסת החיץ. באמצעות תוכנת אלקטרופיזיולוגיה, החל צורת גל משולש של 10 מילי-וולט על פני הממברנה כדי לרכוש גל מרובע.

רשום את המאפיינים החשמליים של הממברנה על ידי לחיצה על כפתור ההקלטה. המשך להקליט עד שנצפה גל מרובע אחיד. לאחר מכן, הפסק להקליט על ידי לחיצה על סמל הריבוע השחור.

ניתן להשתמש בשתי שיטות כדי לשלב גרמיצ'דין A בשכבת השומנים הדו-שכבתית. ראשית, ניתן להוסיף גרמיצ'דין A ישירות לתמיסת השומנים לפני פיזור תמיסת השומנים על הצמצם של הסרט הדק PDMS. שנית, ניתן להוסיף תמיסת גרמיצ'דין A לתא כאשר נוצרת שכבת שומן דו-שכבתית.

כדי לצפות בפעילויות תעלת גרמיצ'דין A, יש למרוח 100 מילי-וולט על פני הממברנה בקצב דגימה של 5 קילו-הרץ כדי למדוד את פוטנציאל ההחזקה של הממברנה. רשום את המאפיינים החשמליים כפי שנעשה בעבר, על ידי לחיצה על כפתור ההקלטה. כאשר מוצגות פעילויות ערוץ יונים, המשך להקליט עד שנצפו קפיצות זרם שונות כדי לאשר שילוב ערוץ יונים.

לאחר האישור, צא מההקלטה על ידי לחיצה על סמל הריבוע השחור. בסיום ההקלטה, סנן את הנתונים עם מסנן בסל נמוך ב-100 הרץ באמצעות תוכנת אלקטרופיזיולוגיה. שימו לב לקפיצות הנוכחיות בנתוני פוטנציאל ההחזקה המסוננים.

קפיצות אלה מייצגות דימריזציה של תעלת יונים של גרמיצדין A. כאשר מבשר הממברנה הקפואה הובא לטמפרטורת החדר להפשרה, היווצרות השומנים הדו-שכבתית מקלה על מיצוי ממס הידרופובי לתוך הסרט הדק PDMS. רצף תמונות זה מראה את היווצרות שכבת השומנים הדו-שכבתית, שמרכיבה את עצמה כאשר היא מתחממת מצורתה הקפואה.

כאן, המוליכות החשמלית ממחישה את השילוב והדימריזציה של גרמיצ'דין A.עם דימריזציה, הגרמיצ'דין A יוצר תעלת יונים ורמות המוליכות קופצות ל-28 פיקוסימנס, מה שעולה בקנה אחד עם תוצאות הדיווחים הקודמים ומראה שילוב מיידי של אנטיביוטיקה זו בשכבה הדו-שכבתית. טכניקת היווצרות הממברנה שלנו מספקת כלי רב עוצמה למחקרי קרום תא וננו-תעלות בניגוד לטכניקות קונבנציונליות בעלות פוטנציאל מוגבל ליישום מעשי. המערכת שלנו אינה דורשת מומחיות להיווצרות ממברנה או לשילוב תיעול יונים, מה שהופך אותה למתאימה היטב ליישומי סינון תרופות וביו-חישה.