Name: מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: למד למדוד פעילות פגוציטוזה ופרץ חמצוני בגרנולוציטים ומונוציטים בדם אנושי. שיטה זו פשוטה וניתנת להתאמה למחקר בתחום האימונולוגיה ופיזיולוגיית המאמץ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות זאק שו, קייסי ג&#39;ון, ולין Cialdella-קם על סיועם במהלך אופטימיזציה של הליך זה.

<ol><li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+pistachios+on+performance+and+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+immune+dysfunction%2C+and+metabolite+shifts+in+cyclists%3A+a+randomized%2C+crossover+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial.</a> PLoS One. 9, e113725(2014).</li>
<li>Knab, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+freeze-dried+juice+blend+powder+on+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+function+in+cyclists%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Physiol+Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists.</a> Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).</li>
<li>Konrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+effect+of+ingesting+a+quercetin-based+supplement+on+exercise-induced+inflammation+and+immune+changes+in+runners%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Sport+Nutr+Exerc+Metab%22%5BJournal%5D)">The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners.</a> Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammation+responses+to+a+3-day+period+of+intensified+running+versus+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling.</a> Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+supplementation+affects+blood+granulocyte+and+monocyte+trafficking+but+not+function+after+2.5+h+of+running%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running.</a> Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).</li>
<li>Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cell+response+to+acute+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cell response to acute muscle injury.</a> Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li>
<li>Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+burst+of+circulating+neutrophils+following+traumatic+brain+injury+in+human%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human.</a> PLoS One. 8, e68963(2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+flow+cytometry+technique+to+evaluate+changes+in+granulocyte+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+to+obesity+and+moderate+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+Relat+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">Immune response to obesity and moderate weight loss.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+in+female+elite+rowers+and+non-athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Immune function in female elite rowers and non-athletes.</a> Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li>
<li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).</li>
<li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li>
<li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PLoS One. 7, e32621(2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כתב יד זה מספק פרוטוקול צעד אחר צעד עבור קביעת שני אינדיקטורים של גרנולוציט ותפקוד מונוציטים. זיהינו כמה צעדים חיוניים להצלחת assay זה. צעד אחד כזה הוא הדגירה-באמבט קרח המתרחשת באופן מיידי לפני תוספת של חיידקים. קירור יסודי של כל הדגימות יהיה למזער את השפעת הטמפרטורה על פעילות phagocytosis ו OB. עוד צעד קריטי הוא התוספת של חיידקי מדגם זה. A 8: 1 חיידקים: יחס תָא בַּלעָן מייצר תוצאות אופטימליות; אולם חוקרים אחרים עשויים למצוא כי היחס הזה יצטרך להיות שונה כדי להפיק תוצאות מתאימות. ש...

Phagocytosis גרנולוציט ו מונוציטים / פרץ חמצוני (OB) assay פעילות היא טכניקה פשוטה, ישר קדימה אשר משמש לעתים קרובות כדי לאסוף מידע על תפקוד מערכת החיסון המולדת לאחר פעילות גופנית ממושכת ואינטנסיבית. 1-4 כאשר לומדים את התגובה של המערכת החיסונית גירוי, גרנולוציטים ומונוציטים הם בעלי העניין מיוחד משום שהם ממלאים תפקיד מרכזי בהגנת מארח הם תאי החיסון הראשונים לצבור באתר של זיהום. 5 נויטרופילים, סוג של גרנולוציט, הם התאים הראשונים כדי translocate לתוך שריר ניזוק רקמות לאחר פעילות גופנית אינטנסיבית. 6 Phagocytosis ופעילות OB הם האמצעים הנפוצים ביותר של פונקצית גרנולוציט ו מונוציטים, 7 והם העדיפו כאינדיקטורים תפקוד תא חיסון מולד בגלל תפקידם המרכזי בשניית תהליך ההדבקה ואת תהליך התיקון. Assay המתואר ב utili כתב היד הזהzes זרימה בסיסית cytometer לספק קביעה כמותית של גרנולוציט ו phagocytosis מונוציטים ופעילות OB בדם כולו. השימוש של דם מלא בטכניקה זו יש יתרון משום שהוא מאפשר assay להתנהל ללא הליך טיהור גוזל זמן. assay זה יכול בקלות להיות שונה כדי להתאים מגוון של עיצובי מחקר ויכולות מעבדה. לדוגמה, ליאו et al. מנוצל בטכניקה דומה כדי להראות פעילות OB נויטרופילים הוא גדל phagocytosis נויטרופילים הוא ירד בעקבות פגיעה מוחית טראומטית. 8 בדוגמה נוספת, McFarlin et al. תיאר שינוי אלגנטי של טכניקה זו המשתמשת allophycocyanin (APC ), מצומדות CD66b וסימון CD45 APC מצומדות טנדם בעל ביצועים גבוהים עם cytometry זרימה מבוסס תמונה לסווג גרנולוציטים מבחינת פעילויות phagocytosis ו OB שלהם. 7,9 קבוצת המחקר שלנו השתמשה עיבודים שונים של טה זוchnique כאינדיקטור תפקוד מערכת החיסון המולדת באוכלוסיות משקל יתר, ואתלטי במשך כמעט 20 שנה. 10,11 הטקסט להלן יספק את הקורא עם הוראות צעד-אחר-צעד לביצוע assay זה ולהאיר אזורים שהקורא עשוי להתאים כדי לענות על הצרכים של המחקר שלהם.

<table><tbody><tr><td>צינורות 12 x 75 מ"מ, עם מכסה</td><td>VWR</td><td>20170-579</td><td>תזדקק ל-2 צינורות לכל דגימה ("H" ו-"F") בתוספת 3 צינורות לכל אצווה (לבקרות בדיקה; "F", "H" ו-"דם בלבד").</td></tr><tr><td>PBS (פי 10), pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק עליון 0.2 ומיקרו; מסנן אצטט תאית M (קיבולת 500 מ"ל)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>09-741-07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז, אבקה</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון (נטולת מים, נבדקה בתרבית תאים, נבדקה בתרבית תאי צמחים)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט טריביסיק דיהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S4641-25G</td><td></td></tr><tr><td>דיהידרואתידיום (הידרואתידין) (HE)</td><td>Life Technologies</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>טכנולוגיות חיים</td> נטולות מים <td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>סטפילוקוקוס זהוב&nbsp;( זן עץ ללא חלבון A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC)</td><td>Life Technologies</td><td>S2851</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;( זן עץ ללא חלבון A) BioParticles, ללא תווית</td><td>Life Technologies</td><td>S-2859</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td> <td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>שואב אבק 4.0 מ"ל המכיל 7.2 מ"ג K2EDTA, VWR מיובש בריסוס</td><td></td><td>BD367861</td><td>תזדקק לצינור איסוף דם 1 K2EDTA לכל דגימה.</td></tr><tr><td>שואב אבק 4.0 מ"ל המכיל 68 יחידות USP ליתיום הפרין, VWR מצופה בריסוס</td><td></td><td>BD367884</td><td>תזדקק לצינור איסוף דם ליתיום הפרין אחד לכל דגימה.</td></tr><tr><td>קולטר Ac&middot; T 5diff CP</td><td>בקמן קולטר</td><td>6605705</td><td>כלומר, מנתח המטולוגיה</td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff שטיפה</td><td>בקמן קולטר</td><td>8547167</td><td></td></tr><tr><td>קולטר Ac&middot; T 5diff פיקס</td><td>בקמן קולטר</td><td>8547171</td><td></td></tr><tr><td>קולטר Ac&middot; T 5diff WBC ליז</td><td>בקמן קולטר</td><td>8547170</td><td></td></tr><tr><td>קולטר Ac&middot; T 5diff Hgb Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547168</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; כיול T 5diff Cal</td><td>בקמן קולטר</td><td>7547175</td><td></td></tr><tr><td>קולטר Ac&middot; T 5diff קונטרול פלוס</td><td>בקמן קולטר</td><td>7547198</td><td></td></tr><tr><td>AcT 5diff מדלל</td><td>בקמן קולטר</td><td>8547169</td><td></td></tr><tr><td>200 ומיקרו; l קצות פיפטה באורך מורחב</td><td>VWR</td><td>37001-526</td><td></td></tr><tr><td>מחבת קרח מבודדת</td><td>VWR</td><td>89198-980</td><td>לאמבטיית מי קרח.</td></tr><tr><td>מתלה צינור מתכת פתוח</td><td>VWR</td><td>60916-702</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine</td><td>Serum Life Technologies</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>TQ-Prep תחנת עבודה</td><td>בקמן קולטר</td><td>6605429</td><td>כלומר, תחנת עבודה אוטומטית להכנת ליז תאים</td></tr><tr><td>מערכת ריאגנטים ImmunoPrep</td><td>בקמן קולטר</td><td>7546999</td><td>כלומר, מערכת ריאגנטים לתיקון RBC lyse/WBC</td></tr><tr><td>Cytomics FC500 MCL מערכת ציטומטריית זרימה עם תוכנת CXP</td><td>בקמן קולטר</td><td>626553</td><td></td></tr><tr><td>נוזל נדן IsoFlow</td><td>בקמן קולטר</td><td>8547008</td><td></td></tr><tr><td>קולטר קלנץ</td><td>בקמן קולטר</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>פלואורוספירות בדיקת זרימה&nbsp;</td><td>בקמן קולטר</td><td>6605359</td><td>i.e., יישור ואימות נוזלים פלואורוספירות</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>FlowJo</td><td></td><td>כלומר, תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>Excel Software</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td>i.e., תוכנת גיליון אלקטרוני</td></tr></tbody></table> אלקטרוני

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים phagocytosis חמצוני בדם אנושי

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

ניתן להשתמש בבדיקת הגרנולוציטים והמונוציטים פגוציטוזיס ופעילות פרץ חמצוני (OB) כדי לחקור את מערכת החיסון המולדת. כתב יד זה מספק את המתודולוגיה הדרושה כדי להוסיף בדיקה זו לארסנל אימונולוגיה של פעילות גופנית. השלב הראשון בבדיקה זו הוא הכנת שני אליקוטים ("H" ו-"F") של דם מלא (הפרין). לאחר מכן, דיהידרואתידיום מתווסף ל-H aliquot, ושני האליקוטים מודגרים באמבט מים חמים ואחריו אמבט מים קרים. לאחר מכן, Staphylococcus aureus (S. aureus) מתווסף ל-H aliquot ו-S. aureus שכותרתו פלואורסצאין איזותיוציאנט מתווסף ל-F aliquot (חיידקים: פגוציטים = 8:1), ושני האליקוטים מודגרים באמבט מים חמים ואחריו אמבט מים קרים. לאחר מכן, טריפן כחול מתווסף לכל אליקוט כדי להרוות את הקרינה החוץ-תאית, והתאים נשטפים במי מלח עם פוספט. לאחר מכן, תאי הדם האדומים עוברים ליזה, ותאי הדם הלבנים מקובעים. לבסוף, ציטומטר זרימה ותוכנת ניתוח מתאימה משמשים למדידת פגוציטוזיס גרנולוציטים ומונוציטים ופעילות OB. בדיקה זו נמצאת בשימוש כבר למעלה מ-20 שנה. לאחר מאמץ כבד וממושך, ספורטאים חווים עלייה משמעותית אך חולפת בפגוציטוזיס וירידה ממושכת בפעילות OB. העלייה בפגוציטוזיס לאחר פעילות גופנית קשורה לדלקת. בניגוד לאנשים במשקל תקין, פגוציטוזיס גרנולוציטים ומונוציטים מוגברת באופן כרוני אצל משתתפים הסובלים מעודף משקל והשמנת יתר, ונמצאת בקורלציה צנועה עם חלבון מגיב C. לסיכום, בדיקה זו המבוססת על ציטומטריית זרימה מודדת את פעילות הפגוציטוזיס וה-OB של פגוציטים ויכולה לשמש כמדד נוסף לדלקת הנגרמת על ידי פעילות גופנית והשמנת יתר.

יש תרגיל ממושך ואינטנסיבי השפעה עמוקה על תפקוד מערכת חיסון מולד, כולל תפקוד תא רוצח טבעי, בתגובה בתיווך ציטוקינים מקרופאג זיהום ויראלי, ו גרנולוציט ו phagocytosis מונוציטים ופעילות OB. מחקרים רבים מצביעים על כך מגביר phagocytosis גרנולוציט ו מונוציטים משמעותי שלאחר אימון, המשקף את הדלקת הנגרמת על ידי ניזק לשרירי דרישות מטבוליות. לעומת זאת, גרנולוציט ופעילות מונוציטים OB פוחתת שלאחר אימון ועלול להיות אינדיקטור אחד חיסוני של רגישות מוגברת לזיהום. לדו...

מטרת כתב היד הזה היא להציג שיטה למדידת פגוציטוזיס מונוציטים וגרנולוציטים ופעילות פרץ חמצוני בדגימות דם אנושיות.

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

המטרה הכללית של בדיקה זו היא למדוד פגוציטוזה ופעילות של פרץ חמצוני (oxidative burst) של גרנולוציטים ומונוציטים בדם מלא. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון כיצד התערבות תזונתית מסוימת משפיעה על התגובה החיסונית לפעילות גופנית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שמדובר בבדיקה פשוטה וישירה שניתן להתאימה בקלות למשאבי המעבדה הזמינים ולהאינטרסים המחקריים.השתמשנו במדד זה לתפקוד החסינות המולדת במהלך שני העשורים האחרונים ברבים מהניסויים שלנו בפעילות גופנית, ונשתף חלק מהנתונים הללו בהמשך הסרטון. לפני תחילת הפרוצדורה, השתמשו במנתח המטולוגי לביצוע ספירה מלאה של תאי דם (CBC) עם ניתוח דיפרנציאלי של תאי דם לבנים בדגימות הדם, בהתאם להוראות היצרן. רשמו את ספירת תאי הדם הלבנים בתאים למילליליטר ואת אחוזי הנויטרופילים והמונוציטים עבור הדגימות.לאחר מכן, עבור כל מבחנה ניסויית ומבחנת ביקורת, השתמשו בטיפ פיפטה ארוך כדי להעביר 100 microliters מכל דגימת דם מלא ממבחנת איסוף הדם עם ליתיום הפרין לתחתית של מבחנה בנפח 12 על 75 millimeter המסומנת באופן מתאים. לאחר העברת כל הדם, הוסיפו 10 microliters של תמיסת העבודה HE למבחנות המסומנות בדיו אדום ובאות H, כולל מבחנת הביקורת של ה-HE. הסירו את הפקקים מהמבחנות.ערבבו את הדגימות קצרות במיקסר Vortex, והעבירו את המבחנות לאמבט מים בטמפרטורה של 37-degree Celsius במעמד מתכת פתוח עם ניעור עדין מדי חמש דקות. לאחר 15 דקות, העבירו במהירות את המעמד ואת המבחנות לאמבט מי קרח למשך 12 דקות עם ניעור עדין מדי חמש דקות. בסיום הדגירה, הוסיפו את הנפח המתאים של תמיסת עבודה של S.aureus לא מסומנת למבחנות המסומנות בדיו אדום ובאות H, כולל מבחנת הבקרת HE.ערבבו את המבחנות קצרות במכשיר וורטקס כשהפקקים סגורים. לאחר מכן, הוסיפו את הנפח המתאים של תמיסת עבודה של S.aureus המסומנת ב-FITC למבחנות המסומנות בדיו שחור ובאות F, כולל מבחנת הבקרת FITC, וערבבו את הדגימות קצרות בוורטקס. לאחר מכן, דגרו את כל המבחנות במקלחון מים בטמפרטורה של 37-degree Celsius למשך 20 דקות, תוך써 ניעור מדי חמש דקות, ולאחר מכן קיררו את המבחנות במי קרח למשך דקה אחת.לאחר הנחת הדגימות בטמפרטורת החדר, השתמשו בפיפט רפטיטור (repeater pipette) כדי להוסיף 100 µL של תמיסת עצירה (quench solution) קרה מהקרח לכל המבחנות וערבבו את הדגימות במערבל Vortex. החזירו את הדגימות לאמבט הקרח. לאחר דקה אחת, השתמשו בפיפט הרפטיטור כדי להוסיף 1 mm של PBS קר מהקרח לכל אחת מהמבחנות.לאחר מכן, ערבבו את המבחנות במערבל vortex והוסיפו לדגימות 2 milliliters נוספים של PBS. כעת, סבבבו את התאים בצנטריפוגה ושאבו את הנוזל העליון. בעזרת פיפט רפטיטור (repeater pipette), הוסיפו למבחנות 50 microliters של FBS קר בקרח.לאחר ערבוב ב-vortex, העבירו את כל המבחנות למתקן סיבובי (carousel). השתמשו בתחנת עבודה אוטומטית להכנת ליזיס של תאים כדי לפרק את כדוריות הדם האדומות ולקבע את כדוריות הדם הלבנות בהתאם להוראות היצרן. כדי לנתח את תוצאות הבדיקה באמצעות ציטומטריה של זרימה (flow cytometry), פתחו את תוכנת הרכישה של מערכת הציטומטריה של זרימה וצרו פרוטוקול חדש.בחר ב-FITC עבור הפרמטר FL1 לבדיקת הפגוציטוזה וב-HE עבור הפרמטר FL2 לבדיקת פעילות הפרץ החמצוני. צור תרשים נקודות של פיזור קדמי לעומת פיזור צדי (forward versus side scatter), היסטוגרמה של FL1 והיסטוגרמה של FL2. לאחר מכן, צור אזורים פוליגונליים עבור אוכלוסיות תאי הדם הלבנים, הגרנולוציטים והמונוציטים בתרשים הפיזור הקדמי לעומת הצדי, וצור אזורים ליניאריים בהיסטוגרמות.כעת הרץ את דגימת ביקורת השלילה של דם בלבד, ולאחריה את דגימות ביקורת החיוביות של HE ו-FITC, תוך בדיקה של ההיסטוגרמות וכוונון מתחי שפופרת הכפלה פוטו-אלקטרית (photomultiplier tube) של ערוצי FITC ו-PE לפי הצורך. לאחר מכן, התחל ברכישת הנתונים עבור דגימות הביקורת. לאחר תקופת התstabilization של 15 דקות, טען את הדגימות הניסוייות למתגלגל (carousel) בהתאם לסדר המופיע ברשימת העבודה והתחל בניתוח דגימות המחקר.כדי להעריך את הפעילות הפגוציטית של הדגימות, ראשית רכז את כל קבצי נתוני מצב הרשימה (list mode) של הדגימות המסומנות ב-F ושל הביקורות לתוך תיקייה אחת, וגרור את הקבצים אל מרחב הדגימות בתוכנת הניתוח של ציטומטריית הזרימה. לחץ לחיצה כפולה על דגימת ביקורת והשתמש בבורר השערים הפוליגוני (polygon gate selector) כדי להגדיר שער עבור כלל אוכלוסיית תאי הדם הלבנים, תוך הקפדה לכלול את כל התאים בשולי הגרף. סמן שער זה כ-WBC.לחץ לחיצה כפולה על שער ה-WBC והשתמש בבורר השער האליפטי כדי לקבוע את שער הלימפוציטים. תייג את השער בהתאם וגרור את אחוז נתוני השער הצידה כדי שהתאים ייראו בבירור. לאחר מכן, השתמש בבורר השער הפוליגוני כדי לקבוע את שער הגרנולוציטים ושער המונוציטים.סמנו כל שער באופן תואם וגררו את אחוז נתוני השער הצידה. לחצו פעמיים על דגימת בקרת ה-FITC ולאחריה על שער הגרנולוציטים, והשתמשו בתפריטי הבחירה כדי להגדיר את ציר ה-X כ-FL1 ואת ציר ה-Y כפיזור צדי, או SS. השתמשו בבורר השער המרובע כדי להגדיר שער שלילי לפגוציטוזה ושער חיובי לפגוציטוזה. סמנו את השער החיובי לפגוציטוזה של אוכלוסיית הגרנולוציטים.לאחר מכן לחצו על Workspace ועל Add Statistic. סמנו את Geometric Mean ואת FL1 כדי להפיק את עוצמת הפלואורסצנציה של הגרנולוציטים החיוביים לפגוציטוזה ולחצו על Add. לאחר מכן בחרו ב-frequency of parent statistic ולחצו על Add כדי להפיק את אחוז הגרנולוציטים החיוביים לפגוציטוזה.כדי להחיל הגדרות אלו על כל דגימות המחקר, סמנו את כל השערים (gates) והסטטיסטיקות שנוצרו בדגימת הבקרה של ה-FITC, וגררו אותם לאזור All Samples בחלונית הקבוצות. שמרו את העבודה כקובץ WSP באותה תיקייה המכילה את תיקיית נתוני ה-list mode. כעת לחצו על הדגימה הניסויית הראשונה במערך הנתונים וודאו ששער תאי הדם הלבנים מתאים כראוי להתפלגות התאים בכל אחת מהדגימות, תוך התאמת שולי השער במידת הצורך.כעת לחצו על שער תאי הדם הלבנים במדגם הניסויי הראשון ואשרו כי שערי הגרנולוציטים, המונוציטים והלימפוציטים מתאימים להתפלגות התאים בכל אחד מהמדגמים, תוך התאמת השערים במידת הצורך. לאחר שמירת הקובץ, לחצו על סמל עורך הטבלה, וגררו כל נתון סטטיסטי רלוונטי אל תוך הטבלה. לחצו על Create Table כדי להציג את הנתונים בפורמט של גיליון אלקטרוני ושמרו את העבודה כקובץ XLSX.לאחר מכן, חזרו על האנליזה עבור דגימות הפעילות של פרץ חמצוני המסומנות ב-H ועבור קובצי נתוני מצב הרשימה של הבקרה, כפי שהודגם זה עתה. כפי שמוצג בניסוי מייצג זה, הפגוציטוזה של S.aureus המתווכת על ידי גרנולוציטים עולה באופן מיידי ו-1.5 שעות לאחר רכיבה של 75 קילומטרים, וחוזרת לרמה רגילה עד למחרת בבוקר. פעילות הפרץ החמצוני של הגרנולוציטים יורדת למשך 21 שעות לפחות לאחר רמה זו של פעילות.בנוסף, קיים מתאם צנוע בין פגוציטוזה של גרנולוציטים לבין רמות של C-reactive protein בסרום, כפי שנצפה בניתוח זה של 106 נשים עם משקל עודף או השמנה, דבר המצביע על כך שפגוציטוזה גבוהה של גרנולוציטים ומונוציטים בנבדקים במצב מנוחה עשויה להעיד על דלקת מערכתית. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו עבור כ-30 דגימות תוך שבע שעות, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לקרר את הדגימות באופן מלא לפני הוספת החיידקים, כדי לסייע במיזעור שונות בלתי מוסברת בין הדגימות.בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון כימות ציטוקינים, כדי לקבוע את השפעת ההתערבות שלך על התגובה הדלקתית. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום האימונולוגיה לבחון את ההשפעות של מגוון שינויים באורח החיים ותפקוד מערכת החיסון המולדת בבני אדם. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכוש הבנה טובה כיצד למדוד פגוציטוזה של גרנולוציטים ומונוציטים ופעילות של פרץ חמצוני באמצעות ציטומטר זרימה.יש לזכור כי עבודה עם דם אנושי עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, בעת ביצוע הליך זה.

measuring-granulocyte-monocyte-phagocytosis-oxidative-burst-activity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים שיטה לכימות הפאגוציטוזה של נבגי פטריות פתוגניים המסומנים בתווית FITC על ידי לויקוציטים אנושיים. נבגים פגוציטוזים מובחנים מנבגים הנצמדים לתאים באמצעות צביעה נגדית, ולאחר מכן ניתוח ציטומטרי של זרימה.

מדידה ציטומטרית של זרימה כמותית של פגוציטוזה של נבגים פטרייתיים על ידי פגוציטים אנושיים

סרטון זה מדגים את הבדיקה כדי לאשר פעילות פגוציטית על ידי תאים בדם אנושי באמצעות ציטומטריית זרימה. הגרנולוציטים והמונוציטים מאשרים את פעילותם הפאגוציטית על ידי הצגת פלואורסצנטיות ירוקה ואדומה, המאשרת את נוכחותם של חיידקים שנבלעו ופעילות התפרצות חמצונית בהתאמה.

בדיקה להערכת פגוציטוזה ופעילות פרץ חמצוני בגרנולוציטים ומונוציטים

סרטון זה מציג בדיקת מונוציטים חד-שכבתית המשתמשת במונוציטים ראשוניים מדם היקפי כדי להעריך פגוציטוזה בתיווך קולטן Fcγ עם תאי דם אדומים מסוג פולי D נגד נוגדנים R2R2.

בדיקה לחקר פגוציטוזה מונעת קולטן Fcγ במונוציטים מונושכבות

מקרופאגים הנגזרות מונוציטים הם תאים חשובים של מערכת החיסון המולדת. כאן, אנו מתארים קלים...

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

כדוריות דם לבנות וטסיות דם יכולים לשמש כסמן לבריאות bioenergetic הכללי של אדם ולכן יש לו את הפוטנציאל לפקח על תהליכים פתולוגיים ואת ההשפעה של טיפולים. כאן אנו מתארים שיטה לבודד ולמדוד את תפקוד המיטוכונדריה ופרץ חמצוני בתאים אלה.

Bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם

שיטה זו מדגימה טכניקה להערכת תפקוד גרנולוציטים על ידי מדידה בו-זמנית של פגוציטוזיס של חיידקים והתפרצות חמצונית. ציטומטריית זרימה מבוססת תמונה אפשרה זיהוי של שלוש תת-קבוצות נפרדות של גרנולוציטים מופעלים שכולן נבדלות ביכולתן התפקודית היחסית.

טכניקת cytometry הזרימה מבוססת תמונה כדי להעריך את השינויים בפונקצית granulocyte במבחנה

בדיקת המונוציטים החד-שכבתית (MMA) היא בדיקה במבחנה המשתמשת במונוציטים ראשוניים מבודדים המתקבלים מדם מלא היקפי של יונקים כדי להעריך פגוציטוזיס בתיווך קולטן Fcγ (FcγR).

שימוש Assay מונוציטים חד שכבתי להערכת Fcγ קולטן בתיווך Phagocytosis

כאן נתאר שיטות באמצעות דיסק מסתובב קונפוקלית לאירועים phagocytic יחיד תמונה על-ידי מקרופאגים הצפק תושב העכבר. ניתן להאריך את הפרוטוקולים לתאים אחרים phagocytic.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

המופילוס אינפלואנזה משרה דלקת בדרכי הנשימה. מאמר זה יתמקד בשימוש בציטומטריה של זרימה ובמיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להגדיר תגובות חיסוניות של פאגוציטים ולימפוציטים בתגובה לחיידק זה.

הערכת תגובות חיסוניות נשימתיות לשפעת המופילוס

פיתחנו שיפורים ושיטות מעודכנות לבדיקת מונוציטים-חד-שכבתיים (MMA) הקיימת, שבה נעשה שימוש במקרופאגים כדי לעזור לחזות טוב יותר את הרלוונטיות הקלינית של נוגדנים של כדוריות אדומות ברפואת עירוי ואימונולוגיה. בדיקה זו נקראת בדיקת מונוציטים-מקרופאגים (M-MA).

חיזוי מובהקות נוגדנים של כדוריות דם אדומות באמצעות בדיקת מונוציטים-מקרופאגים

עבודה זו מתארת פרוטוקול מתוקנן במבחנה לכימות והשוואה של שיעורי הפגוציטוזיס של תאי דם אדומים קסנוגניים (אנושיים) ואלוגניים (חולדות) על ידי מקרופאגים מבודדים של חולדות.

הערכה כמותית של פגוציטוזיס של אריתרוציטים אלוגניים וקסנוגניים על ידי מקרופאגים של חולדות במבחנה

למד למדוד פעילות פגוציטוזה ופרץ חמצוני בגרנולוציטים ומונוציטים בדם אנושי. שיטה זו פשוטה וניתנת להתאמה למחקר בתחום האימונולוגיה ופיזיולוגיית המאמץ.

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

גלה סרטונים נוספים