פרוטוקול מפורט לאפיון לקו הסלולרי Murine C1498 דגם Associated לוקמיה העכבר שלה

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לאפיין תאי C1498 עכבריים ואת הלוקמיה החריפה שהם גורמים לה לאחר הזרקה תוך-ורידית בעכברים. היתרון המרכזי של פרוצדורה זו הוא שהלוקמיה המיאלומונוציטית העכברית המושרה לאחר הזרקת תאי C1498 מציגה מאפיינים רבים של המחלה בבני אדם. מודל חיות זה יכול לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ההמטולוגיה, כגון מהם המנגנונים המובילים להתפתחות לוקמיה ולליקוי חיסוני.

ההשלכות של מודל חיות זה חלו על הטיפול בלוקמיה, שכן הוא מאפשר בדיקה של סוכני כימותרפיה ואימונותרפיה חדשים. התחילו בהעברת עכברה נקבה קונגנית C57 black 6 בגיל חמישה עד שישה שבועות אל תוך תא זרימה למינרית סטרילי. לאחר מכן, מקמו את בעל החיים במכשיר ריסון.

בשלב הבא, טענו מזרק של 1 ml המצויד במחט gauge 29 עם 100 µL של תאים. אחזו בזנב מקצהו הדיסטלי וחטאו את עור הזנב באמצעות גזה ספוגה ב-70% ethanol. המשיכו להזריק באיטיות 1x10⁶ תאים לתוך וריד זנב צדי.

לאחר שכל התאים הוזרקו, הוציאו את המחט והפעילו לחץ עדין באתר ההזרקה באמצעות גזה סטרילית. לאחר מכן, החזירו את בעל החיים לכלובו תוך ניטור קפדני במהלך מספר השבועות הבאים. כעבור 17 עד 19 ימים, הכניסו צינור נימי לזווית הפנימית של העין של בעל החיים הלוקמי תחת הרדמה.

יש לשאוב 100 עד 200 µL של דם מהסינוס האורביטלי אל תוך צינור נימי. הוצא את הצינור ועצור את הדימום על ידי לחץ עדין של ספוג גזה סטרילי על העין. לאחר מכן, העבר את הדם לשפופרת EDTA ושמור את השפופרת על קרח עד לביצוע בידוד התאים חד גרעיניים.

כדי לבודד את התאים המונונוקלאריים מן הדם, יש להוסיף תחילה PBS מועשר ב-1 mM EDTA עד לנפח סופי של 500 µL. לאחר מכן, העבירו את הדגימה לשפופרת מיקרוצנטריפוגה. בשלב הבא, השתמשו במזרק של 1 mL המצויד במחט בכיול 30 G כדי להניח בזהירות שכבה של 500 µL של תמיסת הפרדה מתחת לדם, תוך הקפדה לא לערבב את השכבות.

הפרידו את התאים באמצעות סנטריפוגציה והעבירו בעזרת פיפטה את שכבת התאים המונונוקליאריים הלבנה והעכורה למבחנת מיקרו-סנטריפוגה חדשה. לאחר מכן, שטפו את התאים החיסוניים ב-1 milliliter של PBS. סנטריפוגו אותם ותלה את המשקע ב-600 microliters של FACS buffer לצורך צביעה ואנליזה באמצעות ציטומטריה של זרימה.

כדי לבודד את מחית העצם, הנח את העכבר על גבו על לוח פלסטיק ואבטח את גפיו. חטא את בעל החיים באמצעות 70% ethanol. לאחר מכן, חתוך כל רגל בחלק העליון של ה-femur מעל המפרק ומשוך בעדינות את ה-tibias כדי לנתק אותן מה-femurs.

השתמשו בפינצטה ובמספריים כדי להסיר את העור והשרירים מהעצמות, והעבירו את העצמות לצלחת פטרי על קרח. השתמשו במספריים כדי להסיר את הקצוות. לאחר מכן, הכניסו מחט במידה 26 G המחוברת למזרק של 10 milliliter המכיל חמישה milliliters של PBS קר לקצה של כל עצם בנפרד, ושטפו את מחbullying העצם אל תוך הצלחת.

העבירו את תרחיף התאים דרך קצה המחט מספר פעמים כדי לפרק את תאי מח העצם. לאחר מכן, סננו את התאים דרך מסנן 70 מיקרון חד אל תוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר כדי לקבל תרחיף של תאים בודדים. סבבו את התאים בצנטריפוגה ותלו את המשקע ב-2 מיליליטר של בופר ליזיס.

מלאו מיד את המבחנה בעד 50 milliliters של PBS קר וסבבו את התאים בצנטריפוגה. לאחר מכן, השביו את משקע מחך הגרם בריכוז של 1x10⁶ תאים ל-milliliter בבופר FACS קר. כדי להכין את תאי מחך הגרם לצביעה, הניחו תחילה שקופיות בתוך תאים חד-פעמיים עם כרטיסי סינון המחוברים מראש, והניחו את התאים בתוך ציטוסנטריפוגה.

הוסיפו 100 µL של FACS buffer לכל תא בכרטיס הסינון וסבבו את השקופיות בצנטריפוגה למשך זמן קצר. בסיום הסבוב, הוסיפו 100 µL של תאים לכל תא וסבבו את התאים בצנטריפוגה. לאחר מכן, הוציאו בזהירות את השקופיות מהתאים לייבוש באוויר.

לצביעת תאי מחית העצם, טבול את השקופיות בצנצנת קופלין המכילה תמיסת May-Grunwald למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבר את השקופיות לצנצנת עם תמיסת בופר ב-pH של 6.8 למשך דקה אחת. לאחר מכן, העבר את השקופיות לתמיסת Giemsa R למשך 10 דקות.

לאחר מכן בצעו שטיפה של 10 שניות עם מים בניוטרליות pH. לאחר השטיפה, הניחו לשקיפות להתייבש באוויר והנחו טיפה אחת של תמיסת קיבוע (mounting medium) על כל דגימה. לאחר מכן, הניחו קצה אחד של זכוכית כיסוי על השקיפות והורידו בזהירות את זכוכית הכיסוי על התאים, תוך לחיצה עדינה להסרת בועות אוויר.

בהשוואה לבעלי החיים בביקורת, בעלי החיים שהוזרקו בתאי C1498 מראים חדירה מאסיבית של תאי C1498 למח העצם שלהם, כפי שנצפה במראה דמוי-בלאסט של התאים. תאי C1498 החודרים למח העצם מראים פנוטיפים מונוציטיים וגרנולוציטיים המעידים על תאים מונובלאסטיים ומיילובלסטיים בהתאמה, המאפיינים לוקמיה מיילו-מונוציטית חריפה. ניתוח של תדירות התאים המונונוקליאריים בדגימות דם מעכברי ה-C1498 באמצעות ציטומטריית זרימה מצביע על כך שכחומש מאוכלוסיית תאי הדם הלבנים הכוללת מורכב מתאים לוקמיים.

שכיחות תאי T ותאי B לימפוציטים דומה בין קבוצת הביקורת לבין בעלי החיים שהוזרקו ב-C1498. עם זאת, שכיחות תאי מונוציטים נצפתה ברמות גבוהות יותר בעכברים שהוזרקו ב-C1498, מאפיין של לוקמיה מיאלומונוציטית חריפה. בעת ביצוע הליכי הציטוכימיה וצביעת May-Grunwald Giemsa, חשוב לזכור לשמור על ערכי pH, טמפרטורות וזמני אינקובציה מתאימים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לאפיין לוקמיה מיאלומונוציטית חריפה. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום ההמטולוגיה לבחון את טבעה של לוקמיה חריפה ספונטנית או מושרית במודלים אחרים של בעלי חיים.