פרוטוקול מפורט לאפיון לקו הסלולרי Murine C1498 דגם Associated לוקמיה העכבר שלה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפיין תאי עכברים C1498 ואת הלוקמיה החריפה שהם גורמים לאחר הזרקה תוך ורידית בעכברים. היתרון העיקרי של הליך זה הוא שהלוקמיה המיאלומונוציטית של העכברים הנגרמת לאחר הזרקת תאי C1498 מציגה מאפיינים רבים של המחלה האנושית. מודל בעלי חיים זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההמטולוגיה כגון מהם המנגנון המוביל להתפתחות לוקמיה וחסר חיסוני.

ההשלכות של מודל בעלי חיים זה משתרעות על הטיפול בלוקמיה מכיוון שהוא מקל על בדיקה של חומרים כימותרפיים ואימונותרמיים חדשים. התחל בהעברת עכבר קונגני C57 שחור 6 בן חמישה עד שישה שבועות למכסה זרימה למינרי סטרילי. לאחר מכן, הניחו את החיה במסננת.

לאחר מכן, טען מזרק מילילטר אחד המצויד במחט בגודל 29 עם 100 מיקרוליטר תאים. אחוז בזנב הקצה הדיסטלי וחטא את עור הזנב עם גזה ספוגה באתנול 70%. המשך להזריק לאט אחת פעמים 10 לתאים השישיים לווריד זנב לרוחב.

לאחר שכל התאים נמסרו, הסר את המחט והפעל לחץ עדין למראה ההזרקה עם גזה סטרילית. לאחר מכן החזירו את החיה לכלוב שלה עם ניטור קפדני במשך השבועות הקרובים. 17 עד 19 יום לאחר מכן, הכנס צינור נימי לקנתוס המדיאלי של העין של החיה הלוקמית המורדמת.

100 עד 200 מיקרוליטר דם יישאבו מהסינוס האוריבטלי לתוך צינור הנימים. הסר את הצינורית ושלוט בדימום באמצעות מריחה עדינה של ספוג גזה סטרילי על העין. לאחר מכן, העבירו את הדם לתוך צינור EDTA ואחסנו את הצינור על קרח עד לבידוד התא החד-גרעיני.

כדי לבודד את התאים החד-גרעיניים בדם, יש להוסיף תחילה PBS בתוספת EDTA מילימולרית אחת עד לנפח סופי של 500 מיקרוליטר. לאחר מכן, העבירו את הדגימה לצינור מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן, השתמש במזרק מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 30 כדי לשכב בזהירות 500 מיקרוליטר של תמיסת הפרדה מתחת לדם, תוך הקפדה לא לערבב את השכבות.

הפרד את התאים על ידי צנטריפוגה והשתמש בפיפטה כדי להעביר את שכבת התא החד-גרעיני הלבן האטום לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש. לאחר מכן, שטפו את תאי החיסון במיליליטר אחד של PBS. צנטריפוגה אותם והשעיה מחדש של הגלולה ב-600 מיקרוליטר של מאגר FACS לצביעה, וניתוח על ידי ציטומטריית זרימה.

כדי לבודד את מח העצם, הניחו את העכבר על גבו על לוח פלסטיק ואבטחו את גפיהם של בעלי החיים. לחטא את החיה עם אתנול 70%. לאחר מכן, חתכו כל רגל בחלק העליון של עצם הירך מעל המפרק ומשכו בעדינות את השוקה כדי לנתק אותם מעצם הירך.

השתמש במלקחיים ובמספריים כדי להסיר את העור והשרירים מהעצמות, והעביר את העצמות לצלחת פטרי על קרח. השתמש במספריים כדי להסיר את הגפיים. לאחר מכן הכנס מחט בגודל 26 המחוברת למזרק של 10 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר PBS קר לקצה עצם אחת בכל פעם ושטוף את מח העצם לתוך הצלחת.

העבירו את תרחיף התאים דרך קצה המחט מספר פעמים כדי לשבש את תאי מח העצם. לאחר מכן, סנן את התאים דרך מסנן חדש של 70 מיקרון לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר כדי לקבל תרחיף תא בודד. צנטריפוגה את התאים והשעיה מחדש של הגלולה בשני מיליליטר של מאגר ליזה.

מלאו מיד את הצינור בעד 50 מיליליטר PBS קר וצנטריפוגה את התאים. לאחר מכן, השעו מחדש את גלולת מח העצם באחת מ-10 עד שישית תאים למיליליטר במאגר FACS קר. כדי להכין תחילה את תאי מח העצם לצביעה, הנח שקופיות לתאים חד פעמיים עם כרטיסי סינון מחוברים מראש והנח את התאים לתוך ציטוצנטריפוגה.

הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר FACS לכל תא כרטיס סינון וצנטריפוגה קצרה את השקופיות. בסוף הסיבוב מוסיפים 100 מיקרוליטר תאים לכל תא ומצנטריפוגות את התאים. לאחר מכן, הסר בזהירות את השקופיות מהתאים לייבוש אוויר.

כדי להכתים את תאי מח העצם, טבלו את השקופיות בצנצנת קופלין המכילה תמיסת מאי-גרונוולד למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבירו את השקופיות לצנצנת תמיסת חיץ עם pH של 6.8 למשך דקה אחת. לאחר מכן, העבירו את השקופיות לתמיסת Giemsa R למשך 10 דקות.

לאחר מכן שטיפה של 10 שניות עם מים ניטרליים pH. לאחר הכביסה, הניחו לשקופיות להתייבש באוויר ומרחו טיפה אחת של אמצעי הרכבה על כל דגימה. לאחר מכן, הנח קצה אחד של כיסוי על המגלשה והורד בזהירות את זכוכית הכיסוי על התאים ולחץ בעדינות כדי להסיר בועות אוויר.

בהשוואה לחיות ביקורת, בעלי החיים שהוזרקו לתאי C1498 מציגים חדירה מסיבית של תאי C1498 במח העצם שלהם, כפי שנצפה על ידי המראה דמוי הפיצוץ של התאים. מח העצם החודר לתאי C1498 מדגים פנוטיפים מונוציטים וגרנולוציטים המעידים על תאים מונובלסטיים ומיאלובלסטיים בהתאמה, האופייניים ללוקמיה מיאלומונוציטית חריפה. ניתוח זרימה ציטומטרי של תדרי התאים החד-גרעיניים בדגימות דם מהעכברים שהוזרקו C1498 מצביע על כך שכרבע מכלל אוכלוסיית תאי הדם הלבנים מורכבת מתאי לוקמיה.

תדרי הלימפוציטים T ו-B דומים בין בעלי חיים שהוזרקו ל-C1498. עם זאת, תדירות מונוציטים נצפית ברמות גבוהות יותר בעכברים שהוזרקו C1498, מאפיין של לוקמיה מיאלומונוציטית חריפה. בעת ביצוע הציטוכימיה והליכי מאי-גרונוולד גימסה חשוב לזכור לשמור על ערכי ה-pH, הטמפרטורות וזמני הדגירה המתאימים.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לאפיין לוקמיה מיאלומונוציטית חריפה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ההמטולוגיה לחקור את טבעה של לוקמיה חריפה ספונטנית ומושרית במודלים אחרים של בעלי חיים.