ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להבדיל תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לתאי שריר לב (cardiomyocytes) ביעילות גבוהה ובחזרתיות. ניתן להגדיל את קנה המידה של פרוטוקול זה בביוראקטור או להתאימו להבדלה של שורות תאים הרגישות לתרבית של תאים בודדים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במידול מחלות לב באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים.

היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם שהיא חסכונית ובעלת יעילות גבוהה, הדירות ויכולת יישום הן עבור תאי גזע עובריים אנושיים והן עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים. המדגימה שלנו היום היא Hananeh Fonoudi, כיום סטודנטית לדוקטורט במכון ויקטור צ'אנג למחקר לבבי (Victor Chang Cardiac Research Institute), המגיעה אלינו ממכון רויאן (Royan Institute). לפני הציפוי, השתמשו במברשת ניקוי ובמים מזוקקים כדי להסיר ביסודיות כל אבק או שאריות תרבית מבקבוק ספינר של 100 milliliter עם מטוטלת זכוכית.

בשלב הבא, מלאו את הבקבוק ב-70% ethanol. לאחר 30 דקות, שטפו את הבקבוק במים מזוקקים ומלאו אותו בנתרן הידרוקסיד בריכוז five molar. למחרת בבוקר, שטפו את הבקבוק תחת מים זורמים במשך חמש דקות ומלאו אותו בחומצה כלורית בריכוז one molar.

לאחר 15 דקות, שטפו את הבקבוק תחת מים זורמים למשך חמש דקות נוספות, ולאחר מכן בשני שטיפות עם מים מזוקקים פעמיים. הניחו את הבקבוק במabilis-ביולוגית לייבוש. לאחר מכן, הוסיפו לבקבוק 1.5 milliliters של תמיסת סיליקוניזציה, וסובבו את הבקבוק באופן אופקי כדי לכסות את כל המשטחים בסיליקון.

חממו את הבקבוק המצופה בתנור ייבוש למשך שעה אחת ב-100 °C. לאחר שהבקבוק התקרר, שטפו אותו שלוש פעמים למשך 15 דקות במים דאיוניים. לאחר מכן, עקרו את המכל באוטוקלאב ב-121 °C למשך 20 דקות.

לאחר מעבר של ספרואידים לא מובחנים, תוך שימוש בשיטת מעבר של תא בודד לפחות שלוש פעמים, השתמשו בפיפט של 5 ml כדי להעביר את כל הספרואידים הלא מובחנים לשפופרת קונוסית של 15 ml. שטפו את הבארים ב-1 ml של מצע גידול לתאי גזע עובריים אנושיים כדי לאסוף ספרואידים שנותרו, ואיחדו את מי השטיפה עם הספרואידים שנאספו. המתינו חמש דקות לסדימנטציה של הספרואידים ליצירת משקע רפוי.

לאחר מכן, שאבו את הנוזל העליון (supernatant), תוך הקפדה שלא להסיר ספרואידים כלשהם. בשלב הבא, שטפו את הספרואידים ב-1 milliliter של PBS למשך חמש דקות, והדגירו אותם ב-5 milliliters של Trypsin EDTA בטמפרטורה של 37 °C. לאחר ארבע עד חמש דקות, עצרו את התגובה באמצעות 1 milliliter של מצע גידול לתאי גזע עובריים אנושיים, והשתמשו בפיפט P1000 כדי לפרק את הספרואידים לתליה של תאים בודדים.

לאחר ספירה בשיטת הדחה של trypan blue, השהו מחדש את התאים בריכוז של 200,000 תאים למיליליטר, במצע מותנה (conditioned medium) מועשר ב-basic fibroblast growth factor וב-ROCK inhibitor, והעבירו 100 מיליליטר של תגלי התאים לבקבוק ביו-ריאקטור מסליקון. הניחו את הבקבוק על המערבל במהירות של 35 RPM. לאחר 24 שעות, הגבירו את מהירות הערבול ל-40 RPM.

לאחר 48 שעות, הפסיקו את הערבוב למשך חמש עד עשר דקות עד שכל הספרואידים שנוצרו מחדש ישקעו לתחתית הבקבוק, והחליפו מחצית מהמצע במצע מותנה (conditioned medium) המועשר ב-basic fibroblast growth factor. לאחר מכן, הפעילו מחדש את מערבל הניעור ב-40 RPM למשך 24 שעות נוספות, והחליפו מחצית מהמצע באותו תהליך מדי יום במהלך שלושת הימים הבאים. ביום החמישי, הפסיקו את פעולת המערבל למשך חמש עד עשר דקות.

לאחר מכן, העבירו את כל הספרואידים למבחנה של 50 מיליליטר ב-50 מיליליטר של מצע או פחות. השליכו את שארית המצע מהבלילה, תוך הקפדה ששום ספרואיד לא יישאר בתוך הכלי. לאחר מכן, הסירו בזהירות את העלייה (supernatant) מהספרואידים ששקעו, ושטפו את צבירי התאים ב-25 מיליליטר של PBS עם סידן ומגנזיום.

לאחר חמש עד עשר דקות, הסר את תמיסת השטיפה, ותלה את הספרואידים מחדש ב-40 milliliters של מצע RPMI-B27 המועשר עם מעכב glycogen synthase kinase-3, מעכב ROCK ו-polyvinyl alcohol. העבר את כל הספרואידים בחזרה לבקבוק הביוריאקטור. לאחר מכן, הוסף מצע RPMI-B27 טרי עד לנפח כולל של 100 milliliters, והפעל מחדש את הערבול ב-40 RPM.

לאחר 24 שעות, בצע את אותו התהליך להחלפת המצע למצע RPMI-B27. לאחר 24 שעות נוספות, בצע את אותו התהליך והחלף את המצע למצע RPMI-B27 בתוספת IWP2, purmorphamine ו-SB43. השאר למשך 48 שעות.

פעימות ראשונות נצפות בדרך כלל לאחר שבעה ימים. לצורך בידול מהיר של שורות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שלא הותאמו לתרבית תאים בודדים, יש לטפל תחילה בתרבית של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בהסמיכות של 70% עד 80%, הגדלה על תאי פיברובלסטים עובריים של עכבר, ב-5 milliliters של תמיסת דיסוציאציה למשך 30 עד 60 שניות. יש להשאיר את תמיססת הדיסוציאציה רק עד להפוכת תאי ה-MEFs לצורה עגולה ועד ששולי המושבות של ה-hPSC הופכים ברורים.

אם התאים יישארו זמן רב מדי, הם לא יבצעו דיפרנציאציה תקינה. במועד המתאים, החליפו במהירות את תמיסת הדיסוציאציה ב-75 milliliters של collagenase type IV, ודגרו את התאים למשך חמש עד 15 דקות ב-37 degrees Celsius, תוך בדיקת התרבית תחת המיקרוסקופ מדי כמה דקות. כאשר מושבות שלמות יתחילו להיפרד, החליפו את ה-collagenase ב-1.5 milliliters של מצע גידול לתאי גזע עובריים אנושיים, והשתמשו בפיפט P1000 כדי להפריד בעדינות מושבות תאים שלמות מתחתית הצלחת.

יש לנתק את התאים בזהירות כדי שהמושבות לא יתפרקו לחלקים קטנים. לאחר מכן, השתמש בפיפט של 5 ml כדי להעביר את התאים לשפופרת קונית של 15 ml, ושטוף את הבארות עם 1 ml של מצע גידול לתאי גזע עובריים אנושיים, תוך איסוף כל התאים הנותרים לשפופרת ה-15 ml. לאחר חמש דקות של שיקוע, החלף בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) בשני מיליליטרים של מצע גידול טרי לתאי גזע עובריים אנושיים בתוספת basic fibroblast growth factor.

באמצעות פיפט חדש של 5 mL, העבירו את התאים לפלטה בעלת הידבקות נמוכה במיוחד (ultra-low attachment plate), והדגירו את המושבות למשך 6 עד 12 שעות. בתום ההדגרה, השתמשו בפיפט של 5 mL כדי להעביר בזהירות את צבירי המושבות למבחנה חדשה של 15 mL, ואספו את הצבירים שנותרו באמצעות שטיפה עם מצע RPMI-B27. לאחר שהמושבות שקעו, החליפו את הנוזל העליון (supernatant) במצע RPMI-B27 טרי המועשר במעכב glycogen synthase kinase-3, והעבירו בזהירות את המושבות לפלטות מצופות בלמינין להידבקות בטמפרטורה של 37 °C.

לאחר 24 שעות, החליפו את המצע למצע RPMI-B27. לאחר 24 שעות נוספות, החליפו את המצע למצע RPMI-B27 המכיל IWP2, purmorphamine ו-SB43. פעימה ראשונה נצפית בדרך כלל לאחר שבעה ימים.

עד כה, פרוטוקול ההבחנה בתליה סטטית נבדק על חמישה קווי תאי גזע עובריים אנושיים וארבעה קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים, מה שהוביל ליצירת יותר מ-90% של ספרואידים פועמים מכל קו, דבר המדגים את רמת השחזור הגבוהה של פרוטוקול זה בין קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שונים. הספרואידים העוברים הבחנה מראים התנהגות דומה בסביבת ביו-ריאקטור של תליה מעורבבת כפי שמוצגת במערכת הסטטית, כאשר כ-100% מהספרואידים נצפו כפועמים ביום 10. למעשה, חתכים של ספרואידים פועמים שנאספו ביום 30 חושפים ביטוי ציטופלזמי וגרעיני של cardiac troponin T ושל גורם השעתוק הלבבי NKX2.5, בהתאמה.

בנוסף, כאשר ספרואידים לא מובחנים מוחלפים בצבירי תאים לא מובחנים, מופיעים צבירים פועמים שבעה ימים לאחר הביחון. מתוך 42 שורות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים שנבדקו, נוצרו בממוצע אוכלוסיות תאים חיוביות ל-cardiac troponin T בשיעור של יותר מ-60% עד היום ה-15. הצבירים הפועמים מפגינים גם הם ביטוי ציטופלזמי של cardiac troponin T וביטוי גרעיני של NKX2.5 בדומה לזה שנצפה בספרואידים שהופקו בביוראקטור של תרחיף מעורבב.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש ב-hPSCs שהותאמו לתרבית של תא בודד למשך שלושה מעברים לפחות לפני הבידול בביוראקטור. ניתן לשלב פרוצדורה זו עם שיטות אחרות להעשרת קרדיומיוציטים על מנת להשיג אוכלוסיית תאים טהורה. טכניקה זו סללה את הדרך למסחור של קרדיומיוציטים המופקים מ-hPSC.

קיימת לה פוטנציאל לשימוש ביישומים קליניים, פרמצבטיים, בהנדסת רקמות ובפיתוח איברים או אורגנואידים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לגזור ביעילות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לתאי שריר לב (cardiomyocytes) ולהגדיל את קנה מידה התרבית בביוראקטור.