RNA הפרעה מבוססת חקירת הפונקציה של חלבון מחממי הלם 27 במהלך הקרנית אפיתל לריפוי פצעים

המטרה הכוללת של בדיקת טרנספקציה זו של RNA היא להשתמש ב-RNA מפריע קטן ספציפי ל-HSP27 כדי להעריך את התפקיד הפוטנציאלי של HSP27 בריפוי פצעי אפיתל בקרנית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לתפקודו של חלבון הלם חום 27 במהלך תהליך ריפוי פצעי האפיתל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ש-RNA מפריע קטן הוא סוכרוז RNA רגיש שנוצר כדי למקד ספציפית לתעתיק RNA שליח כדי לגרום לפירוקו.

הוא שימש לזיהוי מרחב מזיקים חדש, תהליכים תאיים שונים. למרות שטכניקה זו יכולה לספק תובנה לגבי ריפוי פצעי האפיתל בקרנית, היא עשויה לחול גם על מערכת אחרת כגון עור ורירית. מי שתדגים את ההליך תהיה סון-סוק קאנג, טכנאית מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל בהליך זה, תרבית תאי אפיתל קרנית אנושיים בצלחת של שש בארות עם מדיום גידול אפיתל הסימפונות ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני עד שהם מפגשים של 95 אחוזים. לאחר מכן, יש לדלל 2.5 מיקרו ליטר, או 7.5 מיקרו ליטר של ריאגנט טרנספקציה עם 100 מיקרו ליטר של מדיום סרום מופחת להעברה. לאחר מכן, ממיסים siRNA ספציפי של HSP27 ו-siRNA מבוקר מקושקש ב-100 מיקרו ליטר או מדיום סרום מופחת כדי ליצור 10 ננו-מולרי של siRNA ספציפי ל-HSP27 ו-15 ננו-מולרי של siRNA בקרה מקושקשת בהתאמה.

לאחר מכן, מערבבים 100 מיקרו ליטר תמיסת siRNA עם 100 מיקרו ליטר מגיב טרנספקציה מדולל ודוגרים את התערובת למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף מתחמי שומנים siRNA לתאים. לאחר דגירה של ארבע שעות, שנה את המדיום למדיום הגידול השלם של אפיתל הסימפונות, ודגר את התאים יומיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני ניתוח הכתם המערבי.

בשלב זה, חלץ את ה-HCECs הספציפיים והמקושקשים של HSP27 בארון בטיחות ביולוגי באמצעות 100 מיקרו ליטר של מאגר ליזה קר כקרח. לאחר מכן דגרו את התאים למשך 30 דקות על קרח כדי לגרום לליזה של תאים. לאחר מכן, צנטריפוגה את הליזטים ב -10, 000 פעמים G למשך 15 דקות.

לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנטים לצינורות טריים של 1.5 מיליליטר ואחסנו אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, קבע את ריכוזי החלבון של הליטאטים של התא באמצעות בדיקת החלבון של ברדפורד. לאחר מכן טען את הדגימות בכמויות שוות של חלבוני התא הכולל על ג'ל אקרילאמיד של 10 אחוז או 12 אחוז

הכניסו את הג'ל לדף SDS, והעבירו באופן אלקטרופורטי את רצועות החלבון המופרדות למסנני הניטרוצלולוז עם זרם של 200 מיליאמפר למשך שעה וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, חסום את ממברנות מסנן הניטרוצלולוזה עם חמישה אחוז חלב דל שומן ב-TBST למשך שעה. לאחר מכן הוסיפו נוגדנים ראשוניים ודגרו על הממברנות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר.

למחרת, שטפו את הממברנות שלוש פעמים עם TBST ואפשרו עשר דקות לכל שטיפה. לאחר מכן זהה את הרצועות האימונולריאקטיביות באמצעות חזרת פרוקסידאז מצומד נוגדנים נגד ארנב עזים בחמישה אחוזים BSA. לאחר מכן, דגרו את הממברנות בריאגנטים ללומינול המערבי למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.

הסר את הממברנה מתמיסת המגיב. לאחר מכן, הסר עודפי נוזלים בעזרת מגבת סופגת והניח אותם במגן יריעת פלסטיק. לאחר מכן, הניחו את הממברנה המכוסה בקלטת סרט כשצד החלבון פונה כלפי מעלה.

הניחו סרט רנטגן על גבי הממברנות וחשפו אותו למשך דקה. בארון בטיחות ביולוגי, צור פצע על ידי גרירת קצה פיפטה סטרילי על פני תרביות קונפלואנט של HCECs ספציפיים או מקושקשים של HSP27. מיד לאחר הפציעה יש לשטוף את התאים פעמיים עם 1XPBS ולשמור אותם במצע גידול אפיתל הסימפונות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני למשך 24 שעות.

24 שעות לאחר הפציעה צלם את תמונת ה-HCECs באמצעות מיקרוסקופ זקוף ב-100x ובצע שיטוח רקע באמצעות פקודת המסנן בתוכנת ניתוח תמונה. בעזרת הפקודה Select Measurements, הגדר את אזור העניין עם צורה מצולעת בגודל זהה שיכולה לכסות את הפצע הראשוני בניצב מקצה לקצה. לאחר מכן, קבע שלושה אזורי עניין שונים באזור הפצוע של כל דגימה.

ספור אוטומטית את מספר התא בכל שדה באמצעות אפשרות תפריט מדידת גודל הספירה. ניתוח כתמים מערביים המוצג כאן, גילה כי הביטוי של HSP27 זרחני ו-Akt זרחני הופחת שניהם באופן משמעותי. כאשר ביטוי הגב גדל באופן משמעותי ב-HSP27 ספציפי siRNA עבר HCECs.

ביטוי HSP27 הזרחני הופחת ב-30 אחוזים ו-40 אחוזים ב-10 ננו-מולרים ו-15 ננו-מולרים של תאים שעברו טרנספטציה של siRNA ספציפיים ל-HSP27 בהתאמה, בהשוואה לתאי ביקורת שעברו טרנספטציה של siRNA. יתר על כן, ביטוי HSP27 הלא זרחני הופחת ב-20 אחוזים ו-30 אחוזים בעשרה ננו-מולרים ו-15 ננו-מולרים של תאים ספציפיים של siRNA HSP27 בהתאמה. בדיקת הפצע הכיווני שנגרמה על ידי שריטה הצביעה על כך ש-24 שעות לאחר הפציעה, תאים siRNA ספציפיים ל-HSP27 ב-10 ו-15 ננו-מולרים הפגינו נדידה מופחתת.

בנוסף, siRNA ספציפי ל-HSP27 שעבר טרנספטציה של HCEC עבר יותר מוות של תאים אפופטוטיים ונמקיים בהשוואה לתאי ה-siRNA המקושקשים המוצגים על ידי ציטומטריית זרימה. לאחר שליטה בטכניקת טרנספקציה של RNA ניתן לבצע תוך 24 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליכים אלה ניתן ליצור אפיזודה כמו פה נעול על מנת לענות על שאלות נוספות כמו התפקוד הראשוני של חלבון הלם חום 27 בריפוי פצעי אפיתל בקרנית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש ב-RNA מפריע קטן ספציפי לחלבון הלם חום 27 כדי להעריך את התפקיד הפוטנציאלי של חלבון הלם חום 27 בריפוי פצעי אפיתל בקרנית. אל תשכח שעבודה עם RNA וריאגנטים מפריעים קטנים עלולה להיות מסוכנת ותמיד יש להשתמש בקודמים כגון ארון בטיחות ביולוגי ומסכת מגן בעת ביצוע נהלים אלה.