Name: RNA הפרעה מבוססת חקירת הפונקציה של חלבון מחממי הלם 27 במהלך הקרנית אפיתל לריפוי פצעים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: חקור את תפקיד חלבון מחממי הלם 27 בריפוי פצעים באפיתל הקרנית באמצעות RNA הפרעה ספציפי. שיטה זו מאפשרת לחקור מנגנונים תאיים ופונקציות חלבון בצורה ממוקדת ויעילה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענק מחקר סטודנטים (13-14) של אוניברסיטת אולסן המכללה לרפואה, בסיאול, קוריאה ומענק (2014-464) ממכון אסאן למדעי החיים, בסיאול, קוריאה.

שורת תאים 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות 10 6 תאים אפיתל הקרנית אדם הנציח טלומרז (HCECs) בצלחת 6-היטב (צפיפות: 1039.9 תא / מ&quot;מ 2) בתוך 37 ° C חממה עם אווירה 5% CO 2 באמצעות מדיום הגידול האפיתל הסימפונות (BEGM) עד הם מגיעים למפגש 95%. </li></ol> 2. ניתוח כתם המערבי לאחר יצירת פצעים Scratch אפיתל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak קצה פיפטה 200 μl סטרילי על פני באר HCECs תרבותי ומחוברות ארבע פעמים לכל צלחת בארון בטיחות ביולוגית (Class II, A2 סוג) דגירה HCECs בנפרד 37 ° C חממה עם אווירה 5% CO 2 עבור 1, 5, 10, 30, 60, ו -120 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צלחת אחת 6-היטב מזה שישה מדגמים שונים בהתאם לזמן הדגירה לאחר פציעת אפיתל קרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף monolayers HCEC נפצע שלוש פעמים עם 1x PBS ולאחר מכן להוסיף 2.0 מ&quot;ל BEGM היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק HCECs באמצעות 2מ&quot;ל 0.25% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) לכל היטב במשך 5 דקות, צנטריפוגות ב 900 XG במשך 5 דקות בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל, ואת לשאוב טריפסין-EDTA בעזרת פיפטה 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות HCECs עם 1 מ&quot;ל 1x PBS ולהעבירם צינור 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HCECs צנטריפוגה ב XG 10,000 במשך 15 שניות ו PBS 1x לשאוב בעזרת פיפטה 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend HCECs ב 100 חיץ μl קרים כקרח תמוגה (10 מ&quot;מ טריס, 10 mM NaCl, 2 מ&quot;מ EDTA, 25 מ&quot;מ NaF, 2 מ&quot;מ Na 3 VO 4, 1 מ&quot;מ פלואוריד phenylmethanesulfonyl [PMSF], מעכבי פרוטאז [1 מיקרומטר pepstatin A, 1 מיקרומטר leupeptin, ו -0.1 מיקרומטר aprotinin] ו -0.5% Triton X-100 [pH 7]) ומערבבים אותם היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 30 דקות על הקרח כדי לגרום תמוגה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> lysates צנטריפוגה ב 4 ° C. ב XG 10,000 במשך 15 דקות, ולאחר מכן להעביר supernatants 1.5 מ&quot;ל צינורות טרי (90 aliquots μl) ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע ריכוזי חלבון סך של lysates התא באמצעות יחסי ציבור ברדפורדassay otein. 9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבונים הכולל תא טען 30 מיקרוגרם לג&#39;ל acrylamide 10% או 12% עבור ג&#39;ל אלקטרופורזה סולפט-polyacrylamide dodecyl נתרן (SDS-PAGE), ולאחר מכן electrophoretically העברת מופרדים להקות חלבון מסנני nitrocellulose עם זרם 200 מיליאמפר עבור שעה 1 ב 4 ° C להשתמש מבחני כתם מערביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממברנות מסנן nitrocellulose בלוק עם 5% חלב רזה מלוחים טריס שנאגרו עם Tween 20 (TBST) במשך שעה 1, להוסיף נוגדנים polyclonal ארנב העיקרי נגד HSP27 הלא פוספורילציה (1: 1,000 דילול) או נוגדנים polyclonal ארנב העיקרי נגד HSP27 פוספורילציה (1 דילול 1,000) ב אלבומין 5% שור (BSA), ו דגירה ממברנות לילה ב 4 ° C על שייקר:. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי להקות immunoreactive באמצעות נוגדנים נגד ארנב peroxidase מצומדות חזרת עיזים (1: 10,000 דילול) ב 5% BSA לאחר הכביסה במשך 10 דקות 3 פעמים עם TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה של ריאגנטים לומינול המערבי סופג (6-7 מ &#39;l לכל 10 ס&quot;מ × קרום 5 ס&quot;מ) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקרום מפתרון מגיב, להסיר נוזל עודף עם מגבה סופגת, ומניח מגן יריעת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה בחדר חשוך עם אור בטוח, להציב קרום מכוסה קלטת סרט עם צד חלבון הפונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים הסרט X-ray על גבי הממברנה ולחשוף דקות 1. </li></ol> 3. siRNA Transfection Assay 10 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HCECs תרבות ב 5 × 10 5 תאים / גם בצלחת 6-היטב בתוך 37 ° C חממה עם אווירה 5% CO 2 באמצעות BEGM עד שהם מגיעים למפגש 95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מגיב transfection (2.5 או 7.5 μl) עם 100 μl בינוני סרום מופחת עבור transfection (גורם לדילול היה 41 או 14.3) ו לפזר את HSP27 הספציפי מקושקש השליטה siRNA ב 100 μl בינוני סרום מופחת ליצור 10 או 50 ננומטר של HSP27 ספציפי מקושקש siRNA שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 100 μ; פתרון siRNA l עם מגיב transfection 100 μl מדולל (1: 1 יחס) דגירה את התערובת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את מתחמי השומנים-siRNA לתאים. אז אחרי 4 תקשורת hr שינוי להשלים BEGM דגירת התאים למשך 2 ימים ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח תאי transfected על ידי מערבי סופג, כמתואר מ בסעיפים 4.1 ל -4.7 ילדים. </li></ol> 4. Assay כתם המערבי עבור תאים-טרנספקציה siRNA 11 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ HSP27 ספציפיים מקושקשות HCECs שליטה transfected-siRNA בתוך ארון בטיחות ביולוגית באמצעות 100 חיץ תמוגה μl קרים כקרח (10 טריס מ&quot;מ, 10 מ&quot;מ NaCl, 2 מ&quot;מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 25 מ&quot;מ NaF, 2 מ&quot;מ Na 3 VO 4, 1 מ&quot;מ פלואוריד phenylmethanesulfonyl (PMSF), מעכבי פרוטאז, ו -0.5% Triton X-100, pH 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 30 דקות על הקרח כדי לגרום תמוגה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> lysates גלולה ב XG 10,000 במשך 15 דקות ולאחר מכן להעביר supernatants אל גיגית 1.5 מיליליטר טריes (90 μl aliquots) ולאחסן אותם ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע ריכוזי חלבון של התא lysates באמצעות השיטה ברדפורד. 9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות טענו עם כמויות שווות של חלבוני תא הכוללים על ג&#39;ל acrylamide 10% או 12%, לייחד את הג&#39;ל על SDS-PAGE, ו electrophoretically להעביר את להקות חלבון המופרדות כדי מסנני nitrocellulose עם זרם 200 מיליאמפר עבור שעה 1 ב 4 ° C עד להשתמש מבחני כתם מערביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממברנות nitrocellulose מסנן בלוק עם 5% חלב רזה מלוחים טריס שנאגרו עם Tween 20 (TBST) במשך שעה 1, להוסיף נוגדנים ראשוניים נגד HSP27 פוספורילציה הלא פוספורילציה (1: 1,000 דילול), Akt פוספורילציה (1: 1,000 דילול) הלא פוספורילציה Akt (1: 1,000 דילול, לשמש כסמן הישרדות התא), Bcl-2 הקשורים חלבון X (1: 1,000 דילול, משמש חלבון פרו-אפופטוטיים), ו dehydrogenase 3-פוספט glyceraldehyde (GAPDH; 1 : דילול 200, משמש כביקורת טעינה) ב אלבומין 5% שור (BSA), ודגירת ממברנות הלילה ב 4 ° C על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי להקות immunoreactive באמצעות נוגדנים נגד ארנב peroxidase מצומדות חזרת עיזים (1: 10,000 דילול) BSA 5% לאחר הכביסה 3 פעמים עם TBST, 10 דקות כל אחד לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה של ריאגנטים לומינול המערבי סופג (6-7 מ&quot;ל לכל 10 ס&quot;מ × 5 ס&quot;מ קרום) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקרום מפתרון מגיב, להסיר נוזל עודף עם מגבה סופגת, ומניח מגן יריעת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה בחדר חשוך עם אור בטוח, מניח את הקרום המכוסה קלטת סרט עם צד החלבון הפונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח סרט X-ray על גבי הקרום ולחשוף דקות 1. </li></ol> 5. נגרמת Scratch ערכת Assay פציעה כיוונית של נדידת תאי 12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגית, להפוך פצע ידי גרירת קצה פיפטה סטרילית על פני באר תרבויות ומחוברות שלHSP27 ספציפי-טרנספקציה siRNA או HCECs המלא המקושקש טרנספקציה-siRNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר פציעה, לשטוף את התאים פעמיים עם בופר פוספט 1x (PBS) ולשמור אותם בתרבויות BEGM באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם אווירה 5% CO 2 למשך 24 שעות לאחר פציעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלם תמונות HCEC באמצעות מיקרוסקופ זקוף בהגדלה 100X 24 שעות לאחר ופצע ולבצע משטחת רקע באמצעות מסנן פקודת תוכנת ניתוח תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פקודת המדידות בוחרות, להגדיר השטח של עניין (AOI) עם אותה הצורה מצולע בגודל שיכול לכסות בניצב מקצה לקצה של פצע ראשוני, ולקבוע שלושה AOI שונים באזור הפצוע של כל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אוטומטי לספור את המספר הסלולרי בכל תחום באמצעות אפשרויות תפריט מדוד רוזן / גודל. </li></ol> 6. ניתוח cytometry זרימה של אפופטוזיס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות siRNA-טרנספקציה HSP27 ספציפי ובקרה שלאירנ&quot;א-טרנספקציה HCECs המכילים כל 10 ננומטר siRNA בריכוז של 5 × 10 5 תאים / גם ב 6 צלחות היטב עד התאים מגיעים 95 מפגש% בתוך 37 ° C חממה עם אווירה 5% CO 2 ב BEGM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק HCECs באמצעות 2 מ&quot;ל 0.25% טריפסין-EDTA לכל טוב במשך 5 דקות, צנטריפוגות ב 900 XG במשך 5 דקות בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל, ואת לשאוב טריפסין-EDTA בעזרת פיפטה 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים פעמיים עם קר PBS ולאחר מכן resuspend התאים 1x חיץ מחייב (0.1 M HEPES / NaOH [pH 7.4], 1.4 M NaCl, ו -25 מ&quot;מ CaCl 2) בריכוז של 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μl ההשעיה תא (1 x 10 5 תאים) לתוך צינור תרבות 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl והעמסת מצומדות isothiocyanate V Annexin ו יודיד propidium 5 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבולת התאים דגירה אותם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של חיץ מחייב 1x על צינור אחד ולנתח את התאים על ידי ג זרימהytometer בתוך שעה 1. </li></ol>

<ol><li>Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing.</a> Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).</li>
<li>Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+shed+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in shed human corneal cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).</li>
<li>Guay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+filament+dynamics+by+p38+map+kinase-mediated+phosphorylation+of+heat+shock+protein+27%5BTitle%5D)+AND+%22J.+cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27.</a> J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+heat+shock+protein+mRNAs+under+in+vivo+glutathione+depletion+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina.</a> Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).</li>
<li>Rane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+controls+apoptosis+by+regulating+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation.</a> J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).</li>
<li>Shin, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+tumor+cell+migration+and+invasion+with+biphenyl+isoxazole+derivative+KRIBB3%2C+a+synthetic+molecule+that+inhibits+Hsp27+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+phosphorylated+heat+shock+protein+27+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing.</a> Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).</li>
<li>Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+profiles+in+HeLa+cells+in+response+to+overexpression+or+siRNA-mediated+depletion+of+NASP%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45(2009).</li>
<li>Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+prostaglandin+analogues+on+tear+proteomics+and+expression+of+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+in+the+conjunctiva+and+corea%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea.</a> Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Voegeli, T. S., Currie, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+knocks+down+Hsp27+and+increases+angiotensin+II-induced+phosphorylated+NF-kappaB+p65+levels+in+aortic+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells.</a> Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).</li>
<li>Shi, B., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenite+pre-conditioning+reduces+UVB-induced+apoptosis+in+corneal+epithelial+cells+through+the+anti-apoptotic+activity+of+27+kDa+heat+shock+protein+%28HSP27%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27).</a> J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).</li>
<li>Shen, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+corneal+epitheliotrophic+capacity+among+different+human+blood-derived+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations.</a> Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).</li>
<li>Song, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+phosphorylation+is+involved+in+epithelial+cell+apoptosis+as+well+as+epithelial+migration+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing.</a> Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).</li>
</ol>

יש המחברים שום אינטרסים כלכליים או קניינים כל חומר או שיטות שהוזכר במחקר זה.

במחקר הנוכחי הערכנו את התפקיד הפוטנציאלי של HSP27 בפציעה אפיתל בקרנית באמצעות גישות מבחנה . השלבים הקריטיים כללו טרנספקציה של siRNA עבור נוק-דאון HSP27 כדי לצפות בתפקוד של HSP27 בתאים הנתונים ללחץ. יש לציין כי תפקידו של HSP27 התגלה בניסויים אלה בנדידת תאי אפיתל ואפופטוזיס במהלך ריפוי פצעי אפיתל בקרנית. בניגוד למחקרים קודמים10 שהשתמשו ב-siRNA ספציפי ל-HSP27 של חולדות כדי להעביר תאי שריר חלק בכלי הדם, השתמשנו בטכניקת טרנספקציה של siRNA כדי לשנות את ביטוי הגנים ב-CECs אנושיים כדי להפיל ביעילות ביטוי גנים...

תאי אפיתל קרניים (CECs) הם לשפוך ברציפות לתוך שכבת דמעות, בזמן שהם מוחלפים בו זמנית על ידי תאים מן לימבוס ושכבות הבזליים אפיתל קרניים. 1 לחצים חיצוניים שונים יכולים לגרום אפופטוזיס קלוף של CECs. 2 חלבוני הלם החום (HSPs) שמורים מאוד ניתן לחלק לשתי משפחות לפי גודל מולקולרי. 3 מש&#39; HSP הגדולה כולל Hsp90, HSP70, ו HSP60, והמשפחה הקטנה כולל HSP27. 4 זירחון של HSP27 ידוע לשחק תפקיד חשוב בהישרדות תא והוא נחוץ לצורך נדידת תאים עקב התפקיד של חלבון זה שיפוץ יקטין. 5-7 לכן, ניסינו לבחון את התפקיד הפוטנציאלי של זירחון HSP27 גירת CEC ו אפופטוזיס מודל במבחנה של ריפוי פצע אפיתל. התערבות RNA (RNAi) באף אחת קטנה או קצר RNAs התערבות (siRNA) יש geעניין nerated בשתי ביולוגיה בסיסית ויישומים, כפי שהוא עשוי לאפשר את הביטוי של כל גן של עניין להיות דפק למטה. 8 בזאת, השתמשנו siRNA ספציפי-HSP27 להעריך את התרומה של HSP27 לריפוי אפופטוזיס פצע CEC. שיטות RNAi מסורתית עבור הגן לדפוק למטה בתאים להשתמש דופלקסים RNA סינתטיים, לרבות שני oligonucleotides 21-mer ללא שינוי, אשר ניתן לקבץ ליצור siRNAs. RNAi siRNA כי השתמשנו במחקר הנוכחי הוא שיטה פשוטה ויעילה מאוד transfect תאים, מגיב זה עובד עם שורות תאים הנציחו שונות. במחקר הנוכחי, אנחנו מדגימים את השיטות בהן השתמשו בניתוח זה, כולל assay הפצע כיוונית הנגרמת מאפס, סופג המערבי, assay transfection siRNA, assay immunofluorescence, cytometry הזרימה.

<table><tbody><tr><td>ארון בטיחות ביולוגי</td><td>CHC LAB ושות' בע"מ,&nbsp; דאג'און, הרפובליקה של קוריאה&nbsp;</td><td>CHC-777A2-06</td><td>מחלקה II, סוג A2&nbsp;</td></tr><tr><td>RNAi&trade חמקן; siRNA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>RNAi siRNA; בקרה-siRNA מקושקשת ו-siRNA ספציפי ל-HSP27</td></tr><tr><td>BEGMTM</td><td>Lonza, Inc., Walkersville, MD</td><td>CC-3171, CC4175</td><td>מדיום גידול אפיתל הסימפונות&nbsp;</td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ', בע"מ, סנט לואיס, מיזורי</td><td>P8340, P7626</td><td>1 & #956; M פפסטאטין A, 1 & #956; M Leupepettin, 0.1 &#956; M בדיקת חלבון אפרוטינין</td></tr><tr><td>ברדפורד&nbsp;</td><td>מעבדות ביו-ראד, הרקולס, קליפורניה</td> <td>#500-0001</td><td>בדיקת חלבון ברדפורד&nbsp;</td></tr><tr><td>מסנני ניטרוצלולוזה&nbsp;</td><td>אמרשם, ליטל צ'לפונט, בריטניה</td><td>RPN3032D</td><td>קרום הכתם המערבי</td></tr><tr><td>HSP27&nbsp;</td><td>Abcam Inc., קיימברידג', MA</td><td>ab12351</td><td>1:1,000 דילול (סה"כ HSP27)</td></tr><tr><td>HSP27 זרחני (Ser85)</td><td>Abcam Inc., קיימברידג', MA</td><td>ab5594</td><td>דילול 1:1,000 HSP27 היה זרחני ב-Ser85</td></tr><tr><td>Lipofectamine&reg; RNAiMAX reagent&nbsp;</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>13-778-075</td><td>מגיב טרנספקציה</td></tr><tr><td>Phosphorylated Akt (Ser473)</td><td>טכנולוגיית איתות תאים, דנברס, MA</td><td>מס' 4060</td><td>1:1,000 דילול Akt היה זרחן ב-Ser473 (סמן הישרדות תאים)</td></tr> <tr><td>Akt&nbsp לא זרחני;</td><td>טכנולוגיית איתות תאים, דנברס, MA</td><td>מס' 4061</td><td>דילול 1:1,000 (Total Akt)</td></tr><tr><td>חלבון X הקשור ל-Bcl-2&nbsp;</td><td>טכנולוגיית איתות תאים, דנברס, MA</td><td>מס' 4062</td><td>1:1,000 (סמן חלבון אנטי-אפופטוטי)</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, סנטה קרוז, קליפורניה</td><td>מס' 4063</td><td>1:1,000 סמן בקרת העמסה (גן לשמירת בית)</td></tr><tr><td>חזרת פרוקסידאז מצומד נוגדנים נגד ארנב</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>NCI1460KR</td><td>1:10,000 דילול</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה</td><td>31985</td><td>מדיום סרום מופחת לטרנספקציה</td></tr><tr><td>תוכנה לניתוח תמונות</td><td>Olympus, Inc., טוקיו, יפן</td><td>Image-Pro Plus 5.0</td><td></td></tr><tr><td>אבקת חלב דל שומן&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, גרמניה</td><td>T145.2</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>אמרסקו LCC, בע"מ סולון, אוהיו</td><td>מס' 0497</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0241</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית שש בארות</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>140675 קוטר 35.00 מ"מ /</td></tr><tr><td>באר צלחת 24 בארות</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>N-Bioteck, Inc., סיאול, דרום קוריאה</td><td>NB1015</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיהסנטה קרוז, קליפורניה</td><td>sc-2323&nbsp;</td>,<td></td></tr><tr><td>BDFACSCantoTM II</td><td>BD Biosciences, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי</td><td></td><td>ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>ציטומטריית רנטגן סרט רנטגן</td><td>קודאק, רוצ'סטר, ניו יורק</td><td></td><td>קלטת רנטגן רפואית עם מסך ירוק 400&nbsp;</td></tr><tr><td>ריאגנט לומינול ווסטרן בלוטינג</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, סנטה קרוז, קליפורניה</td><td>SC-2048&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ערכת זיהוי אפופטוזיס FITC Annexin V I</td><td>BD Biosciences, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי</td><td>556547</td><td></td></tr></tbody></table>

rna הפרעה מבוססת חקירת הפונקציה של חלבון מחממי הלם 27 במהלך הקרנית אפיתל לריפוי פצעים

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

RNA מפריע קטן (siRNA) הוא בין שיטות הפרעות ה-RNA הנפוצות ביותר להשתקה לטווח קצר של גנים מקודדי חלבון. siRNA הוא דופלקס RNA סינתטי שנוצר כדי למקד באופן ספציפי תעתיק mRNA כדי לגרום לפירוקו והוא שימש לזיהוי מסלולים חדשים בתהליכים תאיים שונים. קיימים מעט דיווחים לגבי תפקידו של חלבון הלם חום זרחני 27 (HSP27) בריפוי פצעי אפיתל בקרנית. כאן, תאי אפיתל קרנית אנושיים מתורבתים חולקו לקבוצה מקושקשת של siRNA וקבוצה שעברה טרנספטציה של siRNA ספציפית ל-HSP27. לאחר מכן בוצעו בדיקות פציעה כיווניות הנגרמות על ידי שריטות, וכתמים מערביים וזרימה ציטומטרית. אנו מסיקים כי ל-HSP27 יש תפקידים בריפוי פצעי אפיתל בקרנית שעשויים לכלול אפופטוזיס ונדידה של תאי אפיתל. כאן ניתנים תיאורים שלב אחר שלב של הכנת הדגימה ופרוטוקול המחקר.

הביטוי של HSP27 פוספורילציה גדל באופן משמעותי ב 5, 10, ו -30 דקות לאחר שריטה ופצע לעומת HCECs unwounded 13. ניתוח כתם המערבי גילה כי הביטוי של פוספורילציה HSP27 ו פוספורילציה Akt הופחתו הן באופן משמעותי, ואילו הביטוי של Bax הוגדל משמעותית HCECs-טרנספקציה siRNA ספציפיים-HSP27 (איור 1 א-ה). הביטוי HSP27 פוספורילציה הופחת ב -30% ו -40% ב 10 ננומטר ו -50 ננומטר של HSP27 ספציפי בתאי-טרנספקציה siRNA, בהתאמה, לעומת תאי-טרנספקצי...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש ב-RNA מפריע קטן ספציפי לחלבון הלם חום 27 (HSP27) כדי להעריך את תפקודו של HSP27 במהלך ריפוי פצעי אפיתל בקרנית. הפרעות RNA הן השיטה הטובה ביותר להפיל ביעילות ביטוי גנים כדי לחקור את תפקוד החלבון בסוגי תאים שונים.

RNA הפרעה מבוססת חקירת הפונקציה של חלבון מחממי הלם 27 במהלך הקרנית אפיתל לריפוי פצעים

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

המטרה הכללית של בדיקת טרנספקציית ה-RNA זו היא להשתמש ב-small interfering RNA ספציפי ל-HSP27 כדי להעריך את התפקיד הפוטנציאלי של HSP27 בריפוי פצעים באפיתל הקרנית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לתפקודו של Heat Shock Protein 27 במהלך תהליך ריפוי פצעים באפיתל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ש-small interfering RNA הוא רצף RNA רגיש שנוצר כדי להתמקד באופן ספציפי בטרנסקריפט של messenger RNA כדי להוביל לפירוקו.שיטה זו שימשה לזיהוי מטרות חדשות בתהליכים תאיים שונים. למרות שטכניקה זו יכולה לספק תובנות לגבי ריפוי פצעים באפיתל הקרנית, היא עשויה להיות ישימה גם במערכות אחרות כגון העור והריריות. את הפרוצדורה תדגים Soon-Suk Kang, טכנאית מהמעבדה שלי.כדי להתחיל בהליך זה, תרבתו תאי אפיתל של קרנית אנושית בצלחת שש-בארים עם מצע גידול לאפיתל ברונכיאל בטמפרטורה של 37 °C ו-5% פחמן דו-חמצני עד להגעה ל-95% התמזגות (confluence). לאחר מכן, דללו 2.5 µL או 7.5 µL של סוכן הטרנספקציה ב-100 µL של מצע עם סרום מופחת לטרנספקציה. לאחר מכן, המסו siRNA ספציפי ל-HSP27 ו-siRNA ביקורת scrambled ב-100 µL של מצע עם סרום מופחת כדי ליצור ריכוז של 10 nM של siRNA ספציפי ל-HSP27 ו-15 nM של siRNA ביקורת scrambled, בהתאמה.לאחר מכן, ערבב 100 µL של תמיסת siRNA עם 100 µL של ריאגנט טרנספקציה מדולל, ודגור את התערובת למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף את קומפלקס הליפידים-siRNA לתאים. לאחר דגירה של ארבע שעות, החלף את המצע למצע גידול מלא של אפיתל ברונכיאלי, ודגור את התאים למשך יומיים ב-37 °C לפני ביצוע אנליזת western blot.בשלב זה, יש לבצע ליזיס של תאי HCEC שעברו טרנספקציה עם siRNA ספציפי ל-HSP27 ו-siRNA בקרה (scrambled) בתוך קבסי ביולוגי, תוך שימוש ב-100 µL של תמיסת ליזיס קרה מהקרח. לאחר מכן, יש להדגיר את התאים למשך 30 דקות על קרח כדי להשרות ליזיס של התאים. לבסוף, יש לסובב את הליזטים בצנטריפוגה ב-10,000 ×g למשך 15 דקות.לאחר מכן, העבירו את העלונות למבחנות חדשות של 1.5 מיליליטר ואחסנו אותן בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius. לאחר מכן, קבעו את ריכוזי החלבון של ליזאטי התאים באמצעות בדיקת חלבון מסוג Bradford. לאחר מכן, טענו את הדגימות עם כמויות שוות של חלבון תאי כולל על ג'ל אקרילאמיד של 10 אחוזים או 12 אחוזים.העבירו את הג'ל ל-SDS page, והעבירו אלקטרופורטית את פסי החלבון המופרדים למסנני ניטרוסלולוז בזרם של 200 milliamps למשך שעה אחת ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, חסמו את ממברנות מסנני הניטרוסלולוז עם חלב דל שומן בריכוז חמישה אחוזים ב-TBST למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסיפו נוגדנים ראשוניים והדגירו את הממברנות למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס על שייקר.ביום למחרת, שטפו את הממברנות שלוש פעמים ב-TBST, תוך הקצבת עשר דקות לכל שטיפה. לאחר מכן, זהו את הפסים האימונו-ריאקטיביים באמצעות נוגדני עז נגד ארנב המצומדים ל-horseradish peroxidase ב-5% BSA. לאחר מכן, הדגירו את הממברנות בריאגנטים של luminol ל-western blotting למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.הוצא את הממברנה מתוך תמיסת הריאגנט. לאחר מכן, הסר עודפי נוזלים באמצעות מגבת סופגת והנח אותן בתוך כיס פלסטיק שקוף. לאחר מכן, הנח את הממברנה המכוסה בתוך קסטת פילם כאשר הצד שבו נמצא החלבון פונה כלפי מעלה.הנח סרט רנטגן מעל הממברנות וחשף אותו למשך דקה אחת. בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית, צור פצע על ידי גרירת קצה פיפטה סטרילי על פני תרביות צפופות (confluent) של תאי HCECs שעברו טרנספקציה של siRNA ספציפי ל-HSP27 או siRNA ביקורת (scrambled). מיד לאחר יצירת הפצע, שטוף את התאים פעמיים עם 1XPBS והשאר אותם במצע גידול לאפית סימפונית בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ובחמישה אחוזים carbon dioxide למשך 24 שעות.24 שעות לאחר הפציעה, צלם את ה-HCECs באמצעות מיקרוסקופ אנכי בהגדלה של 100x ובצע יישור רקע (background flattening) באמצעות פקודת המסנן בתוכנה לניתוח תמונות. באמצעות פקודת בחירת המדידות, הגדר את אזור העניין באמצעות צורה פוליגונלית באותו גודל שיכולה לכסות את הפצע הראשוני באופן מאונך מקצה לקצה. לאחר מכן, קבע שלושה אזורי עניין שונים באזור הפצוע של כל דגימה.ספרו באופן אוטומטי את מספר התאים בכל שדה באמצעות אפשרות התפריט count size measure. ניתוח Western blot המוצג כאן, חשף כי הביטוי של HSP27 מזופספרל ושל Akt מזופספרל פחתו שניהם באופן משמעותי. זאת, בעוד שהביטוי של backs עלה באופן משמעותי בתאי HCECs שעברו טרנספקציה של siRNA ספציפי ל-HSP27.ביטוי ה-HSP27 המפוספור פחת ב-30% וב-40% בתאים שעברו טרנספקציה של 10 nanomolar ו-15 nanomolar של siRNA ספציפי ל-HSP27, בהתאמה, בהשוואה לתאים שעברו טרנספקציה של siRNA בקרה. יתרה מכך, ביטוי ה-HSP27 שאינו מפוספור פחת ב-20% וב-30% בתאים שעברו טרנספקציה של 10 nanomolar ו-15 nanomolar של siRNA ספציפי ל-HSP27, בהתאמה. בדיקת פצע כיווני מושרה שריטה (scratch induced directional wound assay) הצביעה על כך ש-24 שעות לאחר הפציעה, תאים שעברו טרנספקציה של siRNA ספציפי ל-HSP27 בריכוזים של 10 ו-15 nanomolar הראו נסיגה בנדידה.בנוסף, תאי HCEC שעברו טרנספקציה של siRNA ספציפי ל-HSP27 הראו שיעור גבוה יותר של מוות תאי אפופטוטי ונקרוטי בהשוואה לתאים שעברו טרנספקציה של siRNA ביקורת מסוג scrambled, כפי שהודגם בבדיקת flow cytometry. ברגע ששולטת בטכניקת הטרנספקציה של RNA, ניתן לבצע אותה בתוך 24 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות נהלים אלו ניתן ליצור אירוע המדמה פצע בקרנית, וזאת כדי לענות על שאלות נוספות, כגון התפקיד הראשוני של Heat Shock Protein 27 בריפוי פצעים באפיתל הקרנית.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש ב-small interfering RNA ספציפי ל-Heat Shock Protein 27 כדי להעריך את התפקיד הפוטנציאלי של Heat Shock Protein 27 בריפוי פצעים באפיתל הקרנית. זכרו כי עבודה עם small interfering RNA וריאגנטים עלולה להיות מסוכנת, ויש להשתמש תמיד באמצעי הגנה מקדימים, כגון קבסי בטיחות ביולוגית ומסכות מגן, בעת ביצוע הליכים אלו.

rna-interference-based-investigation-function-heat-shock-protein-27

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

דוגמה לטיפול גנטי אדנו-ויראלי בקרניות אנושיות בתרבית איברים סוכרתיים מוצגת לקראת נורמליזציה של ריפוי פצעים מושהה והפחתה ניכרת בביטוי סמני תאי גזע אפיתל בקרניות אלה. הוא גם מתאר את האופטימיזציה של תהליך זה בתרביות אפיתל לימבליות מועשרות בתאי גזע.

תרפיה adenoviral ג&#39;ין עבור סוכרתית keratopathy: השפעות על ריפוי פצע גזע ביטוי נייד מרקר ב קרניות אדם איברים בתרבית תאים לימבלית אפיתל

תפוקה גבוהה קטן מעכבות RNA ההקרנה היא כלי חשוב זה יכול לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים של פגיעה אפיתל הקרנית כימיים במהירות רבה יותר. במסמך זה, אנו מציגים את הפיתוח ואת האימות של חשיפה מודלים ושיטות להקרנה תפוקה גבוהה של מימן פלואוריד - ו chloropicrin-induced פציעה אפיתל הקרנית.

תפוקה גבוהה SiRNA ואיתור Chloropicrin ופציעות תאים אפיתל הקרנית מימן פלואוריד-Induced

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי לגרום של שחיקה השטח עינית של העכבר, בצע את לאחר מכן תהליך ריפוי הפצע. הפרוטוקול מנצל burr עינית חלקית להסרת האפיתל פני השטח של העין בעכברים מרדימים.

אפיתל שחיקה הקרנית עם עינית Burr כמודל עבור קרנית ריפוי פצעים

פרוטוקול עבור אקסית vivo איברים הקרנית תרבות מודל שימושי עבור לימודי ריפוי הפצע מתואר. מערכת מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות של סוכני כדי לקדם ריפוי משובי או רעילות התרופה סביבה מאורגנת multicellular תלת-ממד.

Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים

כאן מתואר פרוטוקול ליצירת פצע שחיקה מרכזי באפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד של מועדון גולף קהה. מודל זה של ריפוי פצעי הקרנית ניתן לשחזור רב ומשמש כיום להערכת ריפוי פצעי בקרנית שנפגעו בהקשר של מחלות.

מודל שחיקה אפיתליאלית לחקר ריפוי פצעי הקרנית

כאן, מודלים של בעלי חיים המבוססים על עכבר וארנב מפותחים עבור פגיעה מכנית וכימית של אפיתל הקרנית כדי לסנן טיפולים חדשים ואת המנגנון הבסיסי.

מודלים של בעלי חיים של Ex Vivo ו-In Vivo לפציעות מכניות וכימיות של אפיתל הקרנית

הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השלבים השונים הכרוכים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ניתן לנתח את הקרנית המתחדשת או המשוחזרת במלואה עבור פוטנציאל התחדשות באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה.

חקר התחדשות רקמות ללא צלקות בקרנית אפרוח פצועה עוברית

פרוטוקול זה מתמקד בפגיעה במשטח העין של דגי הזברה באמצעות שחיקה כדי להעריך את סגירת הפצעים הבאים ברמה התאית. גישה זו מנצלת בר עיני כדי להסיר חלקית את אפיתל הקרנית ומשתמשת במיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת כדי לעקוב אחר שינויים במורפולוגיה של התא במהלך סגירת הפצע.

ריפוי פצעים בקרנית דגי זברה: משחיקה לניתוח הדמיה לסגירת פצעים

העבודה הנוכחית מתארת פרוטוקול ניסיוני חדשני המשתמש במחזיק מודפס בתלת-ממד כדי לאפשר הדמיית תאים חיים ברזולוציה גבוהה של גלובוסים דחוסים. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לצפות בפעילות איתות הסידן התאי באפיתל קרנית פצועה מגלובוסים ex vivo בזמן אמת.

הדמיית תאים חיים של גלובוסים שלמים של Ex Vivo באמצעות מחזיק חדשני מודפס בתלת-ממד

פיתחנו מודל חולדה של דלקת קרנית חמורה באמצעות גרידת אפיתל בקרנית בשילוב עם תפרים בקרנית. המחקר העריך דפוסי דלקת בקרנית, התפשטות אפיתל ושינויים בתאי גזע לימבליים בתנאים דלקתיים.

ביסוס מודל דלקת קרנית חמורה בחולדות המבוסס על גרידת אפיתל בקרנית בשילוב תפרי קרנית

תרבית איברים של קרנית חזיר ex vivo וריפוי פצעי אפיתל מספקים אמצעי חסכוני, אתי, ניתן לשחזור וכמותי לבדיקת רעילות העין של כימיקלים. הם גם מסייעים בהבהרת המנגנונים העומדים בבסיס ויסות אפיתל ותיקון רקמות, ובהערכת טיפולים לטיפול בקרטופתיה סוכרתית ובריפוי פצעים מאוחר.

הערכת רעילות טיפולית וכימית באמצעות קרניות חזיר בתרבית איברים וריפוי פצעי אפיתל

חקור את תפקיד חלבון מחממי הלם 27 בריפוי פצעים באפיתל הקרנית באמצעות RNA הפרעה ספציפי. שיטה זו מאפשרת לחקור מנגנונים תאיים ופונקציות חלבון בצורה ממוקדת ויעילה.

RNA הפרעה מבוססת חקירת הפונקציה של חלבון מחממי הלם 27 במהלך הקרנית אפיתל לריפוי פצעים

גלה סרטונים נוספים