הצמד תיקון הקלטות על Intact השורש הגבי הגרעינים מן חולדות בוגרות

כתב יד זה מתאר כיצד להכין גרעיני שורש גב שלמים להקלטות מהדק טלאי. תכשיר זה שומר על המיקרו-סביבה עבור נוירונים ותאי גליה לווייניים, ובכך נמנע מהשינויים הפנוטיפיים והתפקודיים הנראים באמצעות נוירוני DRG מנותקים.

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להציג שיטות להכנת גרעיני השורש הגבי השלמים ולבצע רישום מהדק תיקון באמצעות תכשיר זה. שיטה זו מאפשרת הקלטה של תא בודד מגרעיני השורש הגבי השלמים תוך גירוי עצב עמוד השדרה הנכנס או השורש הגבי היוצא. גישה זו שימושית במיוחד כאשר חוקרים את תרומתם של נוירונים חושיים ראשוניים לכאב.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא שומרת על תאי עצב ותאי גליה לווייניים סמוכים. לכן, הכנה זו קרובה יותר למצב in vivo. בהליך זה, לאחר הרדמת החולדה, יש לגלח את אזור המותניים שלה.

לאחר מכן, חתכו את העור ואת הרקמה התת עורית לאורך קו האמצע. לאחר מכן, נתק את השרירים הפריוספיים מהתהליכים הקוצניים ברמת L1 עד S2 באמצעות מעלית פריוסטאלית עדינה. לאחר מכן, חתוך את התהליכים הקוצניים מ- L1 ל- S2. לאחר מכן, בצע שני חתכים רוחביים בעמוד החוליה החשוף בערך L1 ו-S1 והסר את הקטע הזה של עמוד השדרה בגוש.

לאחר מכן, טבלו אותו במהירות ב-aCSF קר למשך שתיים-שלוש דקות. לאחר מכן, שטפו את הדם מעמוד השדרה שהוסר והעבירו את עמוד השדרה לצלחת פטרי עם aCSF קר, ואז השתמשו ברונג'ר עדין כדי להסיר את הלמינות. חותכים את הדורה מאטר לאורך קו האמצע בעזרת מספריים כדי לחשוף את חוט השדרה.

לאחר מכן, העבירו את החוליה הנותרת עם DRG לצלחת הפטרי השנייה המלאה ב-aCSF קר. זהה את ה-DRGs L4 ו-L5 על סמך מיקומם היחסי לתהליכים רוחביים ולעצב הסיאטי. לאחר מכן, שחרר את ה-DRG מרקמות החיבור שמסביב ושמור על שורש העצב ועצב עמוד השדרה מחוברים ל-DRG.

לאחר מכן, העבירו את ה-DRG לצלחת הפטרי השלישית להמשך נתיחה נוספת. חותכים פתח שבו שורשי הגב והגחון מצטרפים ל-DRG ומפרידים ממנו את שורש הגחון. לאחר מכן, השתמש במלקחיים עם קצוות קהים כדי להחזיק את האפינוריום והשתמש במלקחיים עדינים אחרים כדי לגלגל את ה-DRG מהאפינוריום.

המשך להסיר כמה שיותר אפינוריום המחובר ל-DRG. כעת, העבר את ה-DRG לתא ההקלטה. ודא שהצד של ה-DRG שבו מקורם של שורשי העצבים פונה כלפי מטה.

לאחר מכן, ייצב את ה-DRG עם עוגן. לאחר מכן, החדירו את ה-DRG עם aCSF מחומצן דרך צינורות הפלסטיק המחוברים למשאבה פריסטלטית ואפשרו לתאים להתאושש למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, הערך את איכות ה-DRG תחת אופטיקה IR-DIC בהגדלה של פי 40 באמצעות מצלמת CCD.

חיבר בנפרד שני מזרקים של מיליליטר אחד למחזיקי הפיפטה דרך שתי חתיכות של צינורות גומי בקוטר קטן. לאחר מכן, הכניסו פיפטת זכוכית אחת מלאה בקולגנאז לתוך אחד ממחזיקי הפיפטות ופיפטת זכוכית ריקה לתוך השנייה. לאחר מכן, השתמש במיקרומניפולטור כדי למקם את הפיפטות ממש מעל ה-DRG.

התנגשו בקצות של שתי פיפטות זו בזו בעדינות כדי להגדיל את פתחי קצות הפיפטות. לאחר מכן, הזיזו את הפיפטה המלאה בקולגנאז קרוב למשטח ה- DRG. הפעל בקצרה לחץ חיובי על הפיפטה המכילה קולגנאז דרך הצינור המחבר בין המחזיק למזרק על ידי הזזת הבוכנה כ-0.5 מיליליטר.

לאחר 10 עד 15 דקות, כאשר נצפה הפסולת של האפינוריום שנותר, הפעל לחץ שלילי עדין על הפיפטה הריקה כדי לשאוב את הפסולת. בדרך זו, הנוירונים ותאי גליה לווייניים שמסביב יהיו חשופים בבירור ומוכנים להקלטת טלאי. בהליך זה, הנח את תמיסת האלקטרודה על קרח כדי למנוע השפלה.

לאחר מכן, מלאו את פיפטת תיקון הזכוכית בתמיסה תוך-תאית מסוננת. לאחר מכן, הנח את הפיפטה לתוך מחזיק הפיפטה של שלב הראש. הפעל לחץ חיובי עדין על הפיפטה דרך מזרק של חמישה מיליליטר על ידי הזזת הבוכנה כמיליליטר אחד לפני הורדת הפיפטה לתמיסת האמבטיה.

לאחר מכן, בחר במצב V-Clamp במגבר ופתח את ממשק בדיקת הממברנה בתוכנה. מתחת למיקרוסקופ, הזיזו את הפיפטה קרוב לנוירון המטרה. לאחר מכן, הפעילו לחץ חיובי מהפיפטה כדי לחצות את שכבת תאי הגליה של הלוויין עד שנצפתה הגדלה פתאומית של המרווח בין תא העצב לשכבה המקיפה של תאי גליה לווייניים.

לאחר מכן, המשיכו להזיז את הפיפטה לכיוון תא העצב עד שנצפתה גומה על תא העצב. בהכנה שלנו, הנוירונים מוקפים בתאי גליה לווייניים. לכן, כדי לחדור לשכבות תאי הגליה ולהגיע לנוירונים בודדים, פיפטת ההקלטה נשמרת בלחץ חיובי גבוה.

לאחר מכן, הפחיתו את הלחץ החיובי. השג אטימה של ג'יגה-אוהם עם שאיבה עדינה. כדי להשיג תצורת הקלטת תא שלם, חדור לקרום תא העצב באמצעות יניקה קצרה אך חזקה.

לחלופין, השתמש בפונקציית zap במגבר בזמן הפעלת יניקה. לאחר הקמת מצב תא שלם, פצו על כל קיבול התא והתנגדות הסדרה על ידי סיבוב כפתורי הקיבול ופיצוי ההתנגדות במגבר. לאחר מכן, סגור את חלון בדיקת הממברנה.

בחר I-Clamp מצב רגיל על ידי סיבוב כפתור המצב במגבר. לאחר מכן, לחץ על פתח פרוטוקול בתוכנה. בחר וטען את הפרוטוקול למדידת rheobase ולחץ על הקלטה כדי להתחיל בהקלטה.

כדי לבחון את הריגוש העצבי, מדוד את התנגדות הקלט ואת הריאובייס על ידי הזרקת סדרה מדורגת של זרמים דה-פולריזציה בשלבים של 100 פיקואמפים. לאחר מכן, לחץ שוב על פרוטוקול פתוח ובחר את הפרוטוקול למדידת סף הממברנה. לאחר מכן, הזריק זרם רמפה של 500 אלפילית שנייה לנוירון .

כדי לתעד את הזרמים המושרים על ידי ליגנד, מלא פיפטה באגוניסטים ספציפיים. בדוק את הפיפטה כדי לוודא שאין בועות אוויר בפנים. לאחר מכן, הנח את הפיפטה במחזיק הפיפטה המחובר למערכת חלוקת תרופות.

השתמש במניפולטור כדי להזיז את הפיפטה לטווח של 15 מיקרומטר מהנוירון. הגדר את לחץ מערכת חלוקת התרופות ל-PSI אחד ואת משך הזמן לשנייה אחת. לאחר מכן, העבר את מצב ההקלטה למתח clamp ב 70 מילי-וולט.

הפעל לחץ קצר באמצעות מערכת חלוקת התרופות כדי להקליט זרם המושרה על ידי תרופה. באיור זה, ריאובייס נמדד על ידי הזרקת סדרה של זרמים לתוך תא העצב DRG. עוצמת הזרם הנמוכה ביותר שיכולה לגרום לפוטנציאל פעולה מוגדרת כ-rheobase, כפי שמצוין על ידי החץ.

בסיס הריאו-בייס לנוירון זה הוא 300 פיקואמפים. סף הממברנה נמדד על ידי הזרקת זרם רמפה. הפוטנציאל מוגדר כספיף הממברנה כאשר מתעורר פוטנציאל פעולה.

סף הממברנה לנוירון זה הוא 11.9 מילי-וולט. באיור זה, הזרמים הושרו על ידי מריחת נשיפה של גלוטמט או AITC למשך שנייה אחת. שני האגוניסטים גרמו לזרמים פנימה, מה שמרמז על נוכחות של קולטני גלוטמט וקולטני TRPA-1 על נוירונים קטנים של DRG.

לאחר שליטה, ניתן לסיים טכניקה זו תוך שעה אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להסיר את האפינוריום ולשמור על הלחץ הגבוה עבור פיפטת ההקלטה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע הקלטת מהדק טלאי על תאי גליה לווייניים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו קולטנים וערוצים בתאי גליה לווייניים.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הכאב לחקור את תרומתם של גרעיני שורש הגב לנוסיספציה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין גרעיני שורש גב שלמים ואז כיצד לתקן מהדק מתאים בודדים על כל גרעיני השורש הגביים הללו.