Name: ויזואליזציה של HIV-1 Gag מחייב את הענק Unilamellar שלפוחיות (בוס) ממברנות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: חקור את הקשירה של HIV-1 Gag לממברנות שלפוחיות Unilamellar ענקיות (GUV) באמצעות שיטת אלקטרופורמציה. טכניקה זו מאפשרת תצפית ישירה באינטראקציות חלבון-שומן ללא שלבים ממושכים של ערבוב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות מוחמד סלים, ג&#39;ינג וו Krishnan Raghunathan לדיונים מועילים. אנו מודים גם פרייה Begani לסיוע במהלך הצילומים. עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R01 AI071727 (כדי AO) ו R01 GM110052 (כדי SLV).

יום 1: ביטוי של חלבונים Gag שימוש במערכת נבט חיטה Lysate מבוססי במבחנה תמלול-תרגום 1. הכנה של HIV-1 Gag <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל ריאגנטים של ערכת CECF מסחרי נבט חיטה מן מקפיאים (lysates נבט חיטה מאוחסנים ב -80 ºC; חומרים כימיים אחרים ב -20 ºC). להפשיר אותם על הקרח ומערבבים את הרכיבים כפי שמוצג בטבלה 1. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Mix-1 (תערובת האכלה) </td><td></td></tr><tr><td> פתרון האכלה </td><td> 900 μl </td></tr><tr><td> חומצות אמינו </td><td> 80 μl </td></tr><tr><td> מתיונין </td><td> 20 μl </td></tr><tr><td> סה&quot;כ </td><td> 1,000 μl </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Mix-2 (תערובת Lysate) </strאונג&gt; </td><td></td></tr><tr><td> lysates wheatgerm </td><td> 15 μl </td></tr><tr><td> מים חינם RNase </td><td> 7 μl </td></tr><tr><td> חומצות אמינו </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> מתיונין </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> פלסמיד דנ&quot;א במאגר TE (1 מיקרוגרם / μl) ** </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> מאגר תגובה </td><td> 15 μl </td></tr><tr><td> RNasin * </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> סה&quot;כ </td><td> 50 μl </td></tr></tbody></table> טבלה 1: יצירות של תערובות נדרש לתגובות נבט חיטה. הערה: אם הניסוי נועד לבחון את השפעת הסרת RNA על ידי RNase על Gag קרום מחייב, להחליף מעכבי ribonuclease עם מים RNase חינם. פלסמיד דנ&quot;א צריך להיות מוגן מפני זיהומים על פי הוראה של היצרן. עם זאת, plasmids מוכן באמצעות קונבנציונאלי, אך לא רעלן פנימי ללא, ערכות בידוד פלסמיד שימשו בהצלחה. ההוראה של היצרן גם ממליצה להשתמש DNA מומס במים nuclease חינם. אם באמצעות DNA המרחפים TE [10 mM Tris-HCl (pH 7.4) המכיל 1 mM EDTA], להימנע משימוש ריכוזים נמוכים של דנ&quot;א, מאז EDTA ב TE עשויים להשפיע על התשואות. פלסמידים מומס חיץ TE בטווח ריכוז של 0.8-1 מיקרוגרם / μl שימשו בהצלחה. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית להוסיף את תערובת ההאכלה (Mix-1) לתוך קלטת התגובה (תא שקוף). לאחר מכן מוסיפים את תערובת lysate (Mix-2) לתא אחר (אדום). אין להכניס כל בועות תוך הוספת התערובות לתאים שלהם, מאז שעלול להוביל חילופי יעילה של מרכיבי פתרון ולכן להפחית את היעילות של תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים לתאים עם הסרט הדבק מצורף לערכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קלטת התגובה לתוך מחזיק קלטת אינקובטוריםte האסיפה עבור 24 שעות ב 24 ºC במהירות טלטול מתמדת של 900 סל&quot;ד בתוך Eppendorf thermomixer ר </li></ol> יום 2: הכן GUVs ידי Electroformation קציר נבט חיטה Lysates 2. הכנת GUVs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שומני Aliquot מומסים ממסים אורגניים כגון כלורופורם או תערובות של כלורופורם מתנול ב צלוחיות זכוכית עם פקקי הברגה מרופדים ספינות טפלון ועטפו עם Parafilm. טפל שומנים עם מזרקי זכוכית המילטון-סוג, או אם זמין, טיפי פלסטיק עמיד, כלורופורם. להוציא צלוחיות זכוכית המכילים ליפידים כדי לשמש להכנת Guv מהמקפיא -20 ºC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הצלוחיות equilibrated לטמפרטורת חדר, לוודא על ידי בדיקה ויזואלית כי השעיות השומנים ברורות. איכות שומנים, במיוחד שומנים חומצי, כגון phosphatidylserine Palmitoyl-oleoyl (POPS) ו PI (4,5) P 2, חשובה ניסויים מוצלחים. אין להשתמש שומנים כי הםב aliquots למשך זמן ארוך יותר מ -2 חודשים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לחמם גוש חום לטמפרטורה הרצויה. טמפרטורה זו חייבת להיות לפחות 5 ºC גבוהה יותר מאשר טמפרטורת ההתכה (T מ) של שומני בדם (ים) עם T מ הגבוה ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את כמויות שומנים הדרושים על פי יחסי שומנים הרצויים הטוחנים. ללימוד HIV-1 Gag מחייב כאן, השתמש יחסי טוחנת הבאים כפי שמוצג בטבלה 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תערובת של ליפידים </td><td> יחס טוחן </td><td> נפח (ב μl) </td><td> ריכוז מניות </td></tr><tr><td> POPC + פופס + חול </td><td> 46.6 + 23.3 + 30 </td><td> 19.74 + 10.18 + 6.57 </td><td> POPC, POPS, חול: 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td rowspan="2"> POPC + POPS + חול + Brain-PI (4,5) P 2 </td><tdrowspan = &quot;2&quot;&gt; 40 + 20 + 30 + 10 </td><td rowspan="2"> 16,11 + 8,3 + 6,25 + 58,19 </td><td> POPC, POPS, חול: 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Brain-PI (4,5) P 2: 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 2: כרכים של שומנים שונים המשמשים להשיג GUVs. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את בהיקפים הרצויים של שומנים לתוך בקבוקון זכוכית בורג הכתיר נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש איטו מצופה שקופיות של ממדים 25 x 50 x 1.1 מ&quot;מ 3 והתנגדות 70-100 Ω (כמתואר קטלוג). מניחים שתי שקופיות איטו מצופה על ספסל נקי. כל תא electroformation דורש שתי שקופיות זכוכית מצופות אינדיום-בדיל-תחמוצת (איטו). ודא שצד המוליך של שקופיות הזכוכית הוא פונה כלפי מעלה על ידי סימון ההתנגדות באמצעות מודד. זה צריך להראות שווי של כ -200 Ω. ודא פני השטח של השקופיות נקיים ידי מנגב בעדינות עם 70% אתנול באמצעות מגבונים ללא סיבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את המשטח החיצוני של מחט של מזרק על ידי ריnsing זה עם כלורופורם למקם את המזרק על הגוש החום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופית זכוכית חדשה צופה איטו על הגוש החום עם צד מוליך פונה כלפי מעלה ולאפשר לו לאזן לטמפרטורה הרצויה בדרך כלל כ 2-3 דקות. אל תעשה שימוש חוזר בשקופיות זכוכית איטו מצופות עבור סיכון פוטנציאלי כי איטו-הציפוי על שקופיות הזכוכית עלול להינזק במהלך ניקוי נהלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש נפח של 40-50 μl של תערובת שומנים עבור כל שקופית עבור מדים ועם זאת מהיר מתפשטת של שומנים בשקופית זכוכית. התאם את הנפח הכולל עם ממיס אורגני מתאים כגון כלורופורם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מחצית הנפח הכולל של תערובת שומנים בשקופית זכוכית ומיד להפיץ את השומנים באמצעות המזרק ניקה (שלב 2.6) כדי משאירים ציפוי השומנים אחיד (הזזת המחט 2-3 פעמים ברחבי שקופיות). מורחים את הסרט השומנים בעדינות (אבל מהר מאוד), כדי למנוע כל נזק לציפוי איטו דק. לא אחיד מתפשט או מחוספס מתפשט עלולה להוביל תת אופטימליתתשואות או הטרוגניות חישובית של GUVs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכן, להבטיח התפשטות אחידה על ידי בוחן סרט השומנים לאחר להתפשט לפני שתמשיך לשלב הבא. אם האטימות של הסרט מופיעות לא אחידות באופן מוגזם, שוב את ההליך באמצעות שקופית חדשה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף מצופה בתוך צלחת פטרי עם הצד המצופה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.6-2.9 עבור שאר התערובת באמצעות אחר שקופית איטו מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי המכילה גם את השקופיות בתא התייבשות ואקום קונבנציונאלי עבור 60-90 דקות כדי להסיר כל שמץ של ממיסים אורגניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תהליך זה, להגדיר את החממה עד באותה הטמפרטורה כמו זה של הגוש החום (65 מעלות צלזיוס ברוב המקרים) וטרום-חם 300 מ&quot;מ תמיסת סוכרוז בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייבוש, להביא את צלחת פטרי על הספסל במקום להחליק זכוכית על משטח נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות בעדינות אטם PDMS (איור 1) באמצעות 70% אתנול ו משלים לו להתייבשtely. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח אותו על שקופיות זכוכית מצופה שומנים כפי שמוצג באיור 1 בעדינות ובתקיפות ללחוץ כדי שצורות אטם חותם מים חזק. אשר בהעדר הפערים בין אטם PDMS ואת השקופיות. התוצאה היא היווצרות של תא רדוד שמכיל את תמיסת סוכרוז. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig1.jpg" /> איור 1:. הפריסה של שקופית זכוכית מצופה איטו המשמש electroformation <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="16" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את החדר עם פתרון סוכרוז מחומם מראש ללא כל בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף מצופים אחרים על העליונה כדי ליצור חותם חזק. ודא שאין בועות. ההרכבה הסופית אמורה להופיע כפי שמוצגת באיור 2. הדקי את usin הקאמריתקליפים קלסר גרם. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig2.jpg" /> איור 2:. ייצוג סכמטי של תא electroformation (מבט מהצד) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="18" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר סוכרוז עודף ידי שאיפה ולנקות את השקופיות באמצעות מגבונים ללא סיבים. הדק את השקופיות לברות נחושת כדי שהצדדים המוליכים נמצאים בקשר אחיד עם הבר. ודא כי רק צד אחד מוליך של שקופיות הזכוכית נמצא בקשר עם בר נחושת אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הבר נחושת אל מוצא מחולל פונקציה באמצעות קליפים התנין. הנח את מכלול בתוך האינקובטור לאפשר הרכבה כדי לאזן את הטמפרטורה הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל תדר גל סינוס של 10 הרץ ו פרש פוטנציאלים של 1 V עבור 90 דקות. ensurדואר שהמתח הוא 1 V ידי מודד כפי שמוצג באיור 3. משך התהליך במשך 90 דקות. </li></ol><img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig3.jpg" /> איור 3:. העמדות שבו אלקטרודות מן המודד ממוקם למדידת תדר וזרם <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="21" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 90 דקות, לאט להקטין את התדר עד 2 רץ ולהמשיך electroformation עוד 10 דקות. במהלך תקופה זו, קציר בתגובות תרגום במבחנה (שלבי 3.1-3.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את מחולל הפונקציה ולאפשר ההרכבה להתקרר לטמפרטורת חדר לאט (על-ידי כיבוי החממה ולהשאיר את דלת החממה נפתחה מעט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקירור, לנתק את הכבלים מחוברים גנרטורמן המסילות. GUVs עשוי להיות מאוד שביר ולכן צריך להיות מטופלים בעדינות רבה. בזהירות להביא את המכלול לספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את החדר על ידי הסרת השקופית העליונה בעדינות בעזרת מלקחיים. קציר את ההשעיה סוכרוז המכיל GUVs באמצעות קצה לחתוך 1,000 μl ולהעביר צינור נקי. ידית הצינור בעדינות כדי למנוע שיבוש של GUVs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש GUVs מיד. GUVs יציב במשך לפחות 90 דקות לאחר קציר כאשר לאחסן בטמפרטורת חדר. </li></ol> 3. תגובות תרגום חוץ גופית הקציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את תגובות תרגום במבחנה המכילות חלבונים הרצוי מהאולם האדום באמצעות micropipette לתוך צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר חלבונים מצטברים, לסובב את lysates ב 16,200 XG במשך 15 דקות על בצנטריפוגה השולחן ובזהירות להעביר את supernatant לתוך צינור נוסף. </li></ol> 4. Guv Assay עקידת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קצה לחתוך, לערבב 51; l תגובות תרגום במבחנה המכילה חלבונים מתורגם ו -5 μl של GUVs בתוך שפופרת דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף גיליון PDMS עם חור קטן (3-4 מ&quot;מ קוטר) על פיסת כיסוי נקיה להבטיח חותם חזק על ידי בעדינות ובתקיפות מהדקים אותה אל coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התערובת 10 μl משלב 4.1 לתוך חור קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת התערובת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עִלִית או confocal הפוך בטמפרטורת חדר. הערה: כדי למנוע אידוי, לחדר ההדמיה יכול להיות מכוסה על ידי coverslip. </li></ol>

<ol><li>Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+in+support+of+RNA-mediated+inhibition+of+phosphatidylserine-dependent+HIV-1+Gag+membrane+binding+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells.</a> J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).</li>
<li>Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+mechanisms+involving+RNA+and+lipids+regulate+HIV-1+Gag+membrane+binding+through+the+highly+basic+region+of+the+matrix+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1600-1605 (2010).</li>
<li>Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+Gag+matrix+domain+and+phosphatidylinositol-%284%2C5%29-bisphosphate+is+essential+for+efficient+gag+membrane+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding.</a> J Virol. 82 (5), 2405-2417 (2008).</li>
<li>Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+membrane-binding+domain+within+the+amino-terminal+region+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+Gag+protein+which+interacts+with+acidic+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids.</a> J Virol. 68 (4), 2556-2569 (1994).</li>
<li>Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+%284%2C5%29+bisphosphate+regulates+HIV-1+Gag+targeting+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14889-14894 (2004).</li>
<li>Saad, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+targeting+HIV-1+Gag+proteins+to+the+plasma+membrane+for+virus+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).</li>
<li>Shkriabai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+HIV-1+Gag+with+assembly+cofactors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors.</a> Biochemistry. 45 (13), 4077-4083 (2006).</li>
<li>Vlach, J., Saad, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trio+engagement+via+plasma+membrane+phospholipids+and+the+myristoyl+moiety+governs+HIV-1+matrix+binding+to+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3525-3530 (2013).</li>
<li>Anraku, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+analysis+of+the+interaction+between+HIV-1+Gag+and+phosphoinositide+derivatives+based+on+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance.</a> Biochemistry. 49 (25), 5109-5116 (2010).</li>
<li>Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Gag+associates+with+specific+uropod-directed+microdomains+in+a+manner+dependent+on+its+MA+highly+basic+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region.</a> J Virol. 87 (11), 6441-6454 (2013).</li>
<li>Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gag+localization+and+virus-like+particle+release+mediated+by+the+matrix+domain+of+human+T-lymphotropic+virus+type+1+Gag+are+less+dependent+on+phosphatidylinositol-%284%2C5%29-bisphosphate+than+those+mediated+by+the+matrix+domain+of+HIV-1+Gag%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag.</a> J Virol. 85 (8), 3802-3810 (2011).</li>
<li>Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+binding+and+subcellular+localization+of+retroviral+Gag+proteins+are+differentially+regulated+by+MA+interactions+with+phosphatidylinositol-%284%2C5%29-bisphosphate+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA.</a> MBio. 5 (6), e02202(2014).</li>
<li>Valentine, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+micelle+encapsulation+of+membrane-anchored+proteins+for+solution+NMR+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies.</a> Structure. 18 (1), 9-16 (2010).</li>
<li>Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Gag+protein+can+sense+the+cholesterol+and+acyl+chain+environment+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), 18761-18766 (2012).</li>
<li>Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+multimerization+on+membrane+association+of+Rous+sarcoma+virus+and+HIV-1+MA+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins.</a> J Virol. 87 (24), 13598-13608 (2013).</li>
<li>Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+matrix+binding+to+membranes+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids.</a> J Virol. 83 (23), 12196-12203 (2009).</li>
<li>Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicles+formed+by+gentle+hydration+and+electroformation%3A+a+comparison+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).</li>
<li>Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermomechanical+and+transition+properties+of+dimyristoylphosphatidylcholine%2Fcholesterol+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers.</a> Biochemistry. 27 (13), 4668-4673 (1988).</li>
<li>Darszon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassembly+of+protein-lipid+complexes+into+large+bilayer+vesicles%3A+perspectives+for+membrane+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (1), 239-243 (1980).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+electroformation%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Liposome electroformation.</a> Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).</li>
<li>Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P. h, Faucon, F., Bothorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+giant+vesicles+by+external+AC+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Progr+Colloid+Polymer+Sci%22%5BJournal%5D)">Preparation of giant vesicles by external AC electric fields.</a> Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).</li>
<li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (12), 4697-4702 (2008).</li>
<li>Yamauchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consensus+motif+for+N-myristoylation+of+plant+proteins+in+a+wheat+germ+cell-free+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system.</a> FEBS J. 277 (17), 3596-3607 (2010).</li>
<li>Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-%284%2C5%29-Bisphosphate+Acyl+Chains+Differentiate+Membrane+Binding+of+HIV-1+Gag+from+That+of+the+Phospholipase+Cdelta1+Pleckstrin+Homology+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain.</a> J Virol. 89 (15), 7861-7873 (2015).</li>
<li>Morales-Penningston, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUV+preparation+and+imaging%3A+minimizing+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">GUV preparation and imaging: minimizing artifacts.</a> Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).</li>
<li>Veatch, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electro-formation+and+fluorescence+microscopy+of+giant+vesicles+with+coexisting+liquid+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases.</a> Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).</li>
<li>Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+peroxides+promote+large+rafts%3A+effects+of+excitation+of+probes+in+fluorescence+microscopy+and+electrochemical+reactions+during+vesicle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation.</a> Biophys J. 91 (6), 2172-2183 (2006).</li>
<li>Montes, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+native+membranes+and+organic+lipid+mixtures+for+the+study+of+lipid+domains+under+physiological+ionic-strength+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions.</a> Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).</li>
<li>Olety, B., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+played+by+acidic+lipids+in+HIV-1+Gag+membrane+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding.</a> Virus Res. 193, 108-115 (2014).</li>
<li>Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimerizable+HIV+Gag+derivative+binds+to+the+liquid-disordered+phase+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes.</a> Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).</li>
<li>Carlson, L. A., Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+the+ordered+assembly+of+the+endosomal+sorting+complex+required+for+transport+at+membrane-bound+HIV-1+Gag+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (42), 16928-16933 (2012).</li>
<li>Gui, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+minimal+in+vitro+system+for+analyzing+HIV-1+Gag-mediated+budding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding.</a> J Biol Phys. 41 (2), 135-149 (2015).</li>
<li>Prevost, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRSp53+senses+negative+membrane+curvature+and+phase+separates+along+membrane+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules.</a> Nat Commun. 6, 8529(2015).</li>
</ol>

אנחנו מצהירים שאין לנו אינטרסים מנוגדים.

את assay מחייב Guv כמתואר לעיל מספק חלופה טובה בתרחישים בהם מבחני אינטראקציה חלבון-שומנים אחרים יש מגבלות שלהם. assay זה מאפשר לנו לבחון אינטראקציות בין Gag באורך מלא myristoylated ושומנים חומצי עם שרשרות acyl יליד באורך בהקשר השומנים bilayer ולעשות זאת בלי צנטריפוגה הנפקה ממושכת הדרך הדרגתית סוכרוז צפיפות גבוהה או עיבוד שלאחר מחייב אחר של Gag-שומנים מתחמים. יתרון נוסף הוא כי התנהגותם של Gag יכול להיבחן תערובת מורכבת (למשל, בנוכחות רכיבים cytosolic), אשר אינה מושגת בקלות ...

סוג 1 הנגיף (HIV-1) הכשל החיסוני האנושי הוא וירוס אפוף כי מרכיב ב וניצנים מן הקרום פלזמה (PM) בסוגי תאים ביותר. הרכבה של חלקיקי הנגיף HIV-1 הוא מונע על ידי חלבון הליבה ויראלי 55 kDa שנקרא Pr55 Gag (GAG). Gag הוא מסונתז כמבשר polyprotein מורכב מארבעה תחומים מבניים גדולים, כלומר, מטריצה, קפסיד, nucleocapsid, ו P6, וכן שני פפטידים spacer SP1 ו- SP2. במהלך האסיפה, תחום מטריקס (MA) אחראי המיקוד של Gag לאתר ההרכבה, קפסיד (CA) תחום מתווכת אינטראקציות Gag-Gag, את nucleocapsid (NC) תחום מגייס RNA הגנומי ויראלי, וגרם מארח המתגייס P6 שסיוע scission חלקיק וירוס מן קרום הפלזמה. Gag גם הוא עובר שינוי שיתוף translational על ידי תוספת של חומצת שומן 14-חמצני או מחצית myristate בבית שלה N- הסופית. ממברנה עקדת Gag היא תנאי הכרחי עבור הרכבת ויראלי, מאז מ &#39;utants כי הם פגומים קרום מחייב מצליח לייצר חלקיקי נגיף. אנחנו ואחרים הראינו כי קרום עקדת Gag מתווכת על ידי אותות bipartite בתוך תחום MA: מחצית myristate N-terminal שמתווכת אינטראקציות הידרופוביות עם bilayer השומנים מקבץ של שאריות בסיסיות בתוך תחום MA כפי שכונה באזור הבסיסי ביותר ( HBR) כי אינטראקציה עם שומנים חומצי על PM 1-4. מחקרים של אינטראקציות Gag-קרום באמצעות ביטוי אקטופי של IV 5-phosphatase polyphosphoinositide (5ptaseIV), אנזים המזרז הידרוליזה של PM-ספציפי phosphatidylinositol- פוספוליפידים חומצי (4,5) [PI (4,5) P 2] -bisphosphate אל פוספט phosphatidylinositol-4, בתאים הציע לוקליזציה Gag-PM מתווכת על ידי PI (4,5) P 2 3,5. עם זאת, במחקרים במבחנה מכוונים להבנת הפרטים מכניסטית יותר של Gag-PI (4,5) P 2 אינטראקציות הוכיחו להיות אתגר עבור מספר סיבות. ללמשל, טיהור באורך מלא myristoylated Gag HIV-1 עבור ניסויים ביוכימיים כבר קשה מבחינה טכנית לפחות בחלקו בשל הנטייה של Gag כדי לצבור במהלך טיהור. לפיכך, צורות קטועות של HIV-1 Gag, כגון MYR-MA או MYR-MA-CA, או בצורה בלתי myristoylated שמשו לעתים קרובות במחקרים המחייבים טיהור Gag (למשל, תהודה מגנטית גרעינית, footprinting חלבון, משטח plasmon תהודה 6-9). לחלופין, מצמיד בתגובות תרגום-שעתוק במבחנה שמש לייצר myristoylated באורך מלא HIV-1 Gag במחקרים ביוכימיים אחרים 1,2. בדרך כלל במערכת זו, פלסמיד קידוד Gag הוא עיבד ותרגם עם lysates תא אוקריוטים (למשל, lysates reticulocyte ארנב) כי הם נטולי כל קרומים הסלולר RNAs שליח אך מכילים את המכונות שעתוק ותרגום. לאחר התגובה, lysates תא המכיל Gag מעורבבים איתיmbranes לניתוח אינטראקציות Gag עם שומנים. בנוסף הקלות של הכנה באורך מלא myristoylated Gag, שיטות באמצעות מערכת תרגום שעתוק במבחנה יש יתרון כי Gag סינתזה ותגובות מחייב קרום עוקב מתרחשים אצל המילייה &#39;cytosol הדמוי איקריוטיים&#39; כי עשויים לייצג מצבים פיסיולוגיים טובים יותר. מאפיין זה תרם מחקרים שהראו כי מולקולות RNA כבול לתחום MA להסדיר Gag מחייב שומנים חומצי באופן תחרותי 1,2,10-12. עם זאת, מאז את הסכום הכולל של חלבוני Gag שהושגו lysates התאים אלה אינם גבוהים, תיוג המטבולית של חלבונים עם חומצות אמינו radiolabeled הכרח הגילוי שלהן. בהתאם לשיטה למדוד אינטראקציות Gag-שומנים, מגוון של הכנות קרום שמש. כל אחת משיטות אלו יש עוצמות ומגבלותיה. רוב המבחנים מבוססים NMR דורשים שימוש ליפידים עם acyl הקצררשתות המהוות מסיסים במים (למשל, C4- ו C8-PI (4,5) P 2) 6,8. בעוד שיטות תמ&quot;ג לבדוק מחייב של Gag אל שומנים שיש שרשראות acyl ארוך המצוי בתאי מפותחים, הם שימשו רק עם MA myristoylated או nonmyristoylated עד כה 8,13. לחלופין, ליפוזומים שהוכן שומנים שיש שרשרות acyl אורך יליד שמש בשיטות ביוכימיות כגון הנפקת liposome או חרוז ליפוזום פלורסנט מבחני מחייב 2,3,10,14-16. עם זאת, ליפוזומים בשימוש מבחנים אלה יש קוטר קטן, ולכן יש הקרומים שלהם עקמומיות תלולה חיובית. לעומת זאת, בשלב המוקדם של מכלול חלקיקים בתאי HIV-1-נגועים, Gag נקשר לראש הממשלה, אשר כמעט מישוריים על הסקאלה של Gag, ובהמשך גורם עקמומיות שלילית במהלך ניצנים. לכן, ממברנות ליפוזום עם עקמומיות תלולה חיובית לא יכולות להיות דו-שכבה ליפידית אידיאלית ללמוד אינטראקציות שומנים-Gag. באשר ליפוזום שטויותמבחני ation, אזהרה נוספת היא פוטנציאל החשיפה של מתחמי Gag-שומנים כדי שיפוע סוכרוז היפרטוני במהלך צנטריפוגה עשוי להשפיע על התוצאה הניסיונית. כדי להקל על המגבלות האלה ולספק מערכת ניסיונית משלימים, מבחנים עבור Gag מחייב שלפוחית ​​unilamellar ענקית (GUVs) פותחו בשנים האחרונות. GUVs הם שלפוחית ​​bilayer השומנים יחיד אשר היקף בקטרים ​​להאריך לכמה עשרות מיקרומטר. לפיכך, העקמומיות של הקרומים האלה דומה PM על הסקאלה של Gag. יתר על כן, בשל ממדיו הגדולים, המאפשר בדיקה ויזואלית תחת מיקרוסקופים אופטיים, קרום עקדת מתויג fluorescently או שכותרתו חלבוני Gag כדי שלפוחית ​​אלה על ערבוב ניתן לקבוע בקלות ללא העיבוד הבא של מתחמי Gag-שומנים. אנחנו כאן מתארים פרוטוקול ללמוד קרום HIV-1 Gag מחייב שימוש GUVs המתקבל בשיטה electroformation. שיטות שונות כגון לחות עדינה, הידרציה בסיוע ג&#39;ל, מיקרופוןהטיסות הללו rofluidic, ו electroformation 17-22 שימשו להשיג GUVs. בשביל הפרוטוקול המתואר כאן, שיטת electroformation משמשת בעיקר בגלל יעילותה ביצירת GUVs עם שומנים חומצי וקלות היחסית של שימוש ללא הצורך של setups היקר. מאז להדמיה של Gag מחייבת כתב ניאון, חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) מתווסף גנטית C- הסופית של Gag (Gag-YFP). חלבונים Gag-YFP מתקבלים על ידי תגובות שעתוק ותרגום במבחנה ב lysates נבט חיטה מבוסס על טכנולוגיה (CECF) זרימה רציפה רציף-החליפין. בטכנולוגיה זו, הן הסרת תוצרי לוואי מעכבות מהתגובות ואספקת מצעי תגובה ורכיבי אנרגית מושגות במנגנון המבוסס-דיאליזה. לקבלת התגובות האלה, קידוד פלסמיד Gag-YFP תחת שליטה של ​​מקדם T7 משמש. מן הראוי לציין כי, כפי שראינו קודם, lysates נבט חיטה לתמוך myristoylation ללא רכיבים נוספים 23,24. באמצעות שיטה זו, ניתן היה להשיג כמויות מספיקות של באורך מלא myristoylated Gag-YFP להדמיה של Gag על ממברנות בוס 24. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול שבה HIV-1 Gag מחייב PI (4,5) P 2 המכילים ממברנות Guv ניתן לבדוק ללא עיבוד שלאחר מכן ממושך בעקבות תגובות מחייבות ולהציע כי שיטה זו משלימה-קרום Gag קודם מבחני מחייב והוא יכול להיות להאריך עוד יותר להבין Gag-קרום HIV-1 מחייב.

<table><tbody><tr><td>מולטימטר דיגיטלי</td><td>Meterman</td><td>30XR</td><td>מולטימטר גנרי שיכול למדוד התנגדות ווולט ישרת את המטרה.</td></tr><tr><td>מחולל פונקציות</td><td>Instek</td><td>GFG-8216A</td><td>מספיק מחולל פונקציות גנרי המסוגל ליצור גל סינוס ב-10 הרץ ו-1 וולט.</td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית מצופות ITO</td><td>Delta Technologies, Loveland, CO</td><td>CG-90IN</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hoefer</td><td></td><td>כל חממה שיכולה לשמור במדויק על הטמפרטורה תספיק</td></tr><tr><td>תא ואקום</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>מזרק</td><td>המילטון</td><td>80400</td><td>מד 22S, מספר מזרק 702</td></tr><tr><td></td><td>ערכת בסיס אלסטומר PDMS Sylgard, Dow-Corning</td><td>Sylgard, ערכת CECF נבט חיטה 184</td><td></td></tr><tr><td>RTS 100</td><td>BiotechRabbit, ברלין, גרמניה</td><td>BR1401001</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA&nbsp;</td><td>D7757</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>אוונטי ליפידים קוטביים, אלבסטר, AL&nbsp;</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPS</td><td>אוונטי שומנים קוטביים</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>אוונטי שומנים קוטביים</td><td>700041P</td><td></td></tr><tr><td>מוח-PI(4,5)P<תת>2</תת>&&nbsp;</td><td>ליפידים קוטביים של Avanti</td><td>840046X</td><td></td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של hiv-1 gag מחייב את הענק unilamellar שלפוחיות (בוס) ממברנות

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

החלבון המבני של HIV-1, Pr55 Gag (או Gag), נקשר הממברנה בתאים במהלך תהליך ההרכבה וירוס. ממברנה עקדת Gag היא מהווה נדבך חיוני להיווצרות חלקיק וירוס, מאז פגם בתוצאות מחייב קרום Gag ליקוי חמור של ייצור החלקיקים ויראלי. כדי לקבל פרטים מכניסטית של אינטראקציות קרום שומנים Gag, שיטות חוץ גופייה מבוססת על תמ&quot;ג, footprinting חלבון, תהודת plasmon פני שטח, צנטריפוגה הנפקת liposome, או חרוז שומני קרינת כריכה פותח עד כה. עם זאת, כל אחת משיטות במבחנה אלה יש מגבלות. כדי להתגבר על כמה מגבלות אלה ולספק גישה משלים לשיטות הוקמו בעבר, פתחנו assay במבחנה שבה אינטראקציות בין HIV-1 Gag וממברנות שומנים להתקיים בסביבה &quot;דמוי תא&quot;. ב assay זה, Gag מחייב ממברנות שומנים בדם מנותח ויזואלית באמצעות YFP-taggeד Gag מסונתז ניבט חיטה מבוססת במערכת תרגום במבחנת GUVs שהוכן על ידי טכניקת electroformation. כאן נתאר את הרקע ואת הפרוטוקולים להשיג חלבונים Gag באורך מלא myristoylated וממברנות Guv הכרחי עבור assay וכדי לזהות Gag-בוס מחייב ידי מיקרוסקופ.

<html> שימוש בפרוטוקול לעיל, הכנו GUVs המורכב POPC + POPS + חול (יחס טוחן: 4.66: 2.33: 3). רכב זה נבחר כ לשקף את ריכוזי PS וכולסטרול של ראש הממשלה. יציב ויעיל מחייב של Gag נצפה רק כאשר המוח-PI (4,5) P 2 נכלל לתוך תערובת POPC + POPS + החול (POPC + POPS + חול + המוח-PI (4,5) P 2 [יחס טוחן : 4: 3: 2 1] בדוגמה זו) (איור 4, להשוות לוחות B ו- D עם A ו- C). -YFP Gag מחייב GUVs המורכב POPC + פופס + חול + המוח-PI (4,5) ...

אנו מדגימים כאן מבחן קשירת ממברנה במבחנה שבו אינטראקציות בין HIV-1 Gag וממברנות שומנים מנותחות ויזואלית באמצעות Gag מתויג YFP המסונתז במערכת תרגום במבחנה מבוססת נבט חיטה ו-GUVs שהוכנו בטכניקת אלקטרופורמציה.

ויזואליזציה של HIV-1 Gag מחייב את הענק Unilamellar שלפוחיות (בוס) ממברנות

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להמחיש את קישור ה-HIV-1 Gag לממברנות של וסיקולות אונילמילריות ענקיות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביו-הרכבה (Bio Assembly), כגון התפקידים של ליפידים בעלי שרשראות פחמניות שונות בקישור לממברנה או חלבונים וירו-מבניים, כגון חלבונים וירו-ויראליים של Gag.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לזהות ויזואלית את קישור הממברנה של Gag על ממברנות של וזיקולות יונילמלאריות ענקיות (GUVs) מיד לאחר הערבוב, מה שחוסך שלבי פוסט-ערבוב ממושכים שעלולים להיות מזיקים. הכנת HIV-1 Gag מפורטת בפרוטוקול הטקסט, ויש לבצעה יום אחד לפני הכנת ה-GUVs.הוציאו את מלאי הליפידים מהמקפיא והמתינו להשגת טמפרטורת החדר. במקביל, הגדירו את טמפרטורת בלוק החימום כך שתהיה גבוהה בלפחות חמישה מעלות צלזיוס מהטמפרטורה הגבוהה ביותר של נקודת ההמס של הליפידים שבשימוש. בהדגמה זו, הטמפרטורה מוגדרת ל-65 מעלות צלזיוס, שהיא הטמפרטורה הגבוהה ביותר שבה השתמשנו.יש להמיס את הליפידים בממסים אנאורגניים, לאחסנם בבקבוקוני זכוכית עם פקקי הברגה מצופי טפלון, ולעטוף ב-Parafilm. לאחר ההפשרה, ודאו שהסספנסיות צלולות. חשבו את נפחי הליפידים הנדרשים בהתאם ליחסי המולאר/ליפיד הרצויים.לאחר מכן, העבירו את הנפחים שחושבו למבחנה מזכוכית נקייה בעלת פקק הברגה, באמצעות מכשיר העמיד לכלורופורם, כגון מזרק זכוכית מסוג Hamilton. התאימו את הנפח הכולל באמצעות ממס אורגני מתאים, כגון כלורופורם. לאחר מכן, הכינו שתי שקופיות חדשות מצופות ITO עבור כל תא אלקטרופורמציה.וודאו שהצד המוליך של השקף פונה כלפי מעלה על ידי בדיקת ההתנגדות באמצעות מולטימטר, אשר צריכה להיות כ-200 ohms. לאחר מכן, נקו בעדינות את השטחים שלהם באמצעות 70%ethanol וניגיונים נטולי סיבים. לאחר מכן, נקו את השטח החיצוני של מחט המזרק על ידי שטיפתה בכלורופורם, והניחו את המזרק על גבי בלוק החימום.הניחו גם את השקופיות המצופות ITO לאחר הניקוי על גבי בלוק החימום, כאשר הצד המוליך פונה כלפי מעלה. תוך מספר דקות, השקופיות יגיעו לטמפרטורה הרצויה. לאחר מכן, הוסיפו 40 עד 50 µL של תערובת הליפידים לאחת השקופיות.יש לפרוס את הליפיד במהירות, אך באופן אחיד ככל האפשר. לאחר מכן, יש להוסיף חצי נפח נוסף של תערובת הליפידים לשקופית זכוכית אחרת, ולפרוס אותה מיד כדי ליצור שכבת ליפיד אחידה. יש לפעול במהירות ובעדינות כדי למנוע פגיעה בציפוי ה-ITO הדק.אם עמימות השכבה נראית כבלתי אחידה באופן מופרז, בצעו את הפרוצדורה מחדש באמצעות זכוכית אובייקט חדשה. לאחר מכן, הכינו זוג שני של זכוכית אובייקט עבור תערובת ליפידים שונה מזו הראשונה. שכבה אחידה של ליפידים נחוצה להשגת תנוב גУV אופטימלית ולאחידות בהרכב של ה-GUVs.אחסנו את השקופיות בתא ייבוש בוואקום למשך 60 עד 90 דקות כדי להסיר עקבות של ממס אורגני. לשלב הבא, הגדירו אינקובטור לטמפרטורה של בלוק החימום ששימש בשלבים הקודמים, וחממו מלאי של תמיסת סוכרוז בריכוז 300 millimolar לטמפרטורה זו. כמו כן, הכינו אטם PDMS על ידי ניגוב עדין שלו עם 70% ethanol, והמתינו לייבוש מלא.לאחר שהשקופיות התייבשו, הניחו אותן על משטח נקי והדביקו בעדינות אך בחוזקה את האטם על שקופית אחת, כך שהאטם ייצור חסימה אטומה למים. ודאו כי אין גז בין אטם ה-PDMS לבין השקופית. לאחר מכן, מלאו את האטם במלואו בתמיסת סוכרוז שחוממה מראש.אין להשאיר בועות. כעת, הצמידו את השקופית המצופה השנייה מעל לאטם, בקו אחד עם השקופית הראשונה. ודאו שאין בועות, והדקיאו את התא באמצעות תפסים.בשלב הבא, הסיר את עודפי תמיסת הסוכרוז באמצעות שאיבה, ונקה את השקופיות בעזרת מגבונים נטולי סיבים. כדי להמשיך, הדק את מערך השקופיות לסורג נחושת כך שהצד המוליך של כל שקופית יהיה במגע אחיד עם הסורג. לאחר מכן, חבר את סורג הנחושת ליציאת מחולל הפונקציות, והנח את המערך בתוך האינקובטור, כאשר מחולל הפונקציות נשאר מחוצה לו.לאחר הגעה לטמפרטורה הרצויה, הגדירו במחולל הפונקציות הפעלת גל סינוס בתדר 10 Hz והפרש פוטנציאלים של 1 volt למשך 90 דקות. ודאו כי המתח הוא 1 volt באמצעות רב-מודד (multimeter). לאחר 90 דקות, הפחיתו באיטיות את התדר ל-2 Hz והמשיכו בתהליך האלקטרופורמציה למשך 10 דקות נוספות.במהלך זמן זה, קצרו את ה-HIV-1 Gag מתגובת התרגום in vitro שהוכנה ביום שלפני. הסירו אגרגטים לא רצויים על ידי ספינטדאון של הליזטים והעבירו בזהירות את העלייה לשפופרת אחרת. לאחר 10 דקות ב-two Hz, כבו את מחולל הפונקציות, כבו את האינקובטור והשאירו את דלת האינקובטור פתוחה עד שהמכלול יחזור לטמפרטורת החדר.לאחר הקירור, העבירו בזהירות את תסביב השקופיות לספסול המעבדה ופרקו בעדינות את התא על ידי הסרת השקופית העליונה באמצעות פינצטה. העבירו את ה-GUVs לשפחור חדש באמצעות טיפ של פיפט בנפח 1000 microliter שקצו פתוח (clipped). היזהרו בעת טיפול בשפחור זה והשתמשו ב-GUVs בתוך 90 דקות.בשלב הבא, הכין תא דימוי. הצמד יריעת PDMS המכילה חור קטן על זכוכית כיסוי נקייה. לחץ אותה למטה בעדינות ובחוזקה כדי להבטיח איטום הדוק.לאחר מכן, ערבבו 5 µL מתגובת התרגום in vitro עם 5 µL של GUVs. לאחר מספר דקות, העבירו את התערובת לתא הדמיה והמשיכו בהדמיה. כדי למנוע התאיידות, ניתן לכסות את תא ההדמיה בכיסוי זכוכית (cover slip).באמצעות הפרוטוקול המתואר, הוכנו GUVs המורכבים מ-POPC, POPS וכולסטרול ביחס מולרי של 4.7 ל-2.3 ל-3. מדידת פלואורסצנציה של אותי Gag YFP על GUV מראה כי הם אינם ניתנים לגילוי מעל הרקע על פני השטח של ה-GUV. עם זאת, חלבון Gag-YFP נקשר ביעילות ל-GUVs כאשר brain-PIP2 נכלל בתערובת הליפידים.קישור Gag ניכר על ידי העלייה בעוצמת הפלואורסצנציה על פני השטח של הממברנה, אשר בעת סריקה, מופיעה כפיסה חדה. לאחר שליטה בשיטה, ובתנאי שהחלבון זמין בצורה מסומנת פלואורסצנטית, ניתן לבצע טכניקה זו בארבע עד חמש שעות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנהוג בעדינות בטיפול ב-GUVs, ולהשתמש תמיד בליפידים טריים ככל האפשר.טכניקה זו אפשרה לחוקרים בתחום ההרכבה של רטרו-וירוסים לבחון אינטראקציות של ממברנה של חלבוני Gag רטרו-וירוסייים in vitro ללא הליכי ערבוב ממושכים (Post Mixing), העשויים לשנות את המצב הלטנטי של האינטראקציות.

visualization-hiv-1-gag-binding-to-giant-unilamellar-vesicle-guv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ניסוי זה הוא מדריך חזותי עבור ניצול שיבוט מולקולרי פלואורסצנטי של HIV עבור לחיות ניסויים הדמיה confocal.

חזותי Cell ל-תא העברה של HIV באמצעות המשובטים פלורסנט של HIV מיקרוסקופיה confocal חיים

הפרוטוקול מתאר גישה תפוקה גבוהה לקביעת מבנים של חלבונים בממברנה באמצעות אלקטרונים cryo-3D טומוגרפיה ועיבוד תמונה. זה מכסה את הפרטים של הכנת הדגימה, איסוף נתונים, עיבוד נתונים לפרשנות, מסכם עם ייצור של היעד מייצג את הגישה, HIV-1 גליקופרוטאין מעטפה. נהלים אלה חישובית מעוצבים באופן המאפשר לחוקרים וסטודנטים כדי לעבוד מרחוק לתרום עיבוד וניתוח של נתונים מבניים.

קביעת מבנים מולקולריים של גליקופרוטאינים HIV מעטפה באמצעות אלקטרונים cryo-טומוגרפיה ו ממוצעים אוטומטי תת tomogram

מאמר זה מתאר שיטה לחזות היווצרות הסינפסה virological HIV-1 המעטפה הנגרמת על bilayers זכוכית הנתמכים מישוריים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סך פנימית (TIRF) השתקפות. השיטה ניתן גם לשלב עם כתמים immunofluorescence לזהות הפעלה חלוקה מחדש של מולקולות איתות המתרחשים במהלך היווצרות ה-HIV-1 המעטפה הנגרמת סינפסה virological.

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

הכינון מחדש של החלבון הטרנסממברני, KvAP, לתוך שלפוחית ​​unilamellar ענקית (GUVs) הוא הוכיח לשתי שיטות התייבשות-החזרת נוזלים - electroformation, ונפיחות בסיוע ג '. בשני השיטות, שלפוחית ​​unilamellar קטנה המכילה החלבון הם התמזגו יחד כדי ליצור GUVs כי אז יכול להיות שנחקר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק.

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית ​​למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים

אנו מתארים וזמינותו מבוססת תא לדווח על HIV-1 היתוך באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי על ידי מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. זה יכול לשמש כדי לבדוק את מעכבי נגיפי כניסה (במיוחד בשלב fusion) במערכות זיהום תא ולתא.

Cre-עצלן תפוקה גבוהה מופעל ממברנה ויראלי Assay פיוז'ן לזהות מעכבי של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1

פרוטוקול זה משתמש נפיחות agarose כטכניקה רבת עוצמה להכללה לשילוב חלבונים ממברנה אינטגרלית (IMPs) לתוך שלפוחיות שומנים חד-צדדיות ענקיות (GUVs), כפי שתואר כאן עבור שחזור של חלבון קולטן סרוטונין האדם 1A (5-HT1AR), אחד מסוגי קולטני חלבון G חשובים מבחינה פרמקולוגית.

בניית מודל ממברנות שומנים המשלבות קולטנים מצמידים של חלבון G (GPCRs)

מאמר זה מציג שיטה פשוטה לייצור מהיר של שלפוחיות חד-שכבתיות ענקיות עם חלבוני שלד ציטוסקטליים עטופים. השיטה מוכיחה את עצמה כיעילה לשילוב מחדש מלמטה למעלה של מבנים ציטוסקטליים באינטראקציות כליאה וציטוסקלטון-ממברנה.

אנקפסולציה מהירה של שלד ציטוסקי משוחזר בתוך בועיות יונילאמלריות ענקיות

גיוון השומנים בממברנה במבנה ובהרכב הוא תורם חשוב לתהליכים תאיים ויכול להיות סמן למחלות. סימולציות של דינמיקה מולקולרית מאפשרות לנו לחקור ממברנות ואת יחסי הגומלין שלהן עם ביומולקולות ברזולוציה אטומית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לבנייה, הפעלה וניתוח של מערכות ממברנות מורכבות.

מידול ממברנות מציאותי באמצעות תערובות שומנים מורכבות במחקרי סימולציה

מאמר זה מציג שיטה להכנת שלפוחיות ענק חד-תכליתיות (cGUVs) בעלות מבנה שלפוחית בתוך שלפוחית, עם מוליכות חשמלית מותאמת אישית באזורים פנימיים, טבעתיים וחיצוניים. אלקטרופורמציה מסנתזת GUVs פשוטים, שהופכים לסטומטוציטים ו-cGUVs באמצעות הלם אוסמוטי, ומספקים מודל רב ערך לחקר הביופיזיקה של תאים גרעיניים.

סינתזה של שלפוחיות חד-כיווניות ענקיות: מודל ביומימטי של תאים גרעיניים

חקור את הקשירה של HIV-1 Gag לממברנות שלפוחיות Unilamellar ענקיות (GUV) באמצעות שיטת אלקטרופורמציה. טכניקה זו מאפשרת תצפית ישירה באינטראקציות חלבון-שומן ללא שלבים ממושכים של ערבוב.

ויזואליזציה של HIV-1 Gag מחייב את הענק Unilamellar שלפוחיות (בוס) ממברנות

גלה סרטונים נוספים