משולב האינפרה-אדום הקרוב הדמיה פלורסנט וטומוגרפיה-מחושב מיקרו ישירות חזותי מוחין Thromboemboli

המטרה הכוללת של טכניקה זו לדימוי ישיר של קריש היא ויזואליזציה כמותית של תסמימי תסחיף מוחי המסומנים פלואורסצנטית in vivo ו-ex vivo, תוך שימוש בננו-חלקיקי זהב, טומוגרפיה ממוחשבת ודימוי פלואורסצנטי בבליקום של האינפרא-אדום הקרוב (near-infrared). שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ההמוסטזיס והתרומבוזיס, כגון התגובה האורתופדית החמורה של תסמימי תסחיף מוחי למפעיל פלסמינוגן רקמתי או לסוכנים תרומבוליטיים חדשים הנמצאים תחת בדיקה, כתלות בזמן או במינון. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שלאחר הזרקה תוך-ורידית של ננו-חלקיקי זהב, micro-CT ברזולוציה גבוהה מאפשר לתעד את ההתפתחות הדינמית של תסמימי תסחיף מוחי על ידי ויזואליזציה כמותית של מיקומם ועומסם in vivo, ולאחר מכן אישור של הממצאים באמצעות דימוי פלואורסצנטי של הקריש בבליקום של האינפרא-אדום הקרוב ex vivo.

הדגמה של הפרוצדורה תבוצע על ידי Jeong-Yeon Kim, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. לאחר איסוף של 300 עד 1,000 µL של דם עורקי באמצעות ניקור לב, הוסיפו 70 µL מהדגימה ל-30 µL של פקטור קרישה מופעל מתאים, גשש פלואורסצנטי הרגיש לפעילות קשירת צלבה של פיברין המתווכת על ידי 13, ומלאו מזרק של 3 mL, המצויד במחט gauge 23, בתערובת שהתקבלה. לאחר מכן, הזריקו את הדם המסומן לתוך צינור פוליאתילן באורך 20 cm והניחו לדם להיקרש בטמפרטורת החדר.

לאחר שעתיים, העבירו את המבחנה לטמפרטורה של 4 °C למשך 22 שעות, ולאחר מכן חתכו את המבחנה לחלקים של 1.5 סנטימטר. באמצעות מזרק של 3 מיליליטר ממולא ב-PBS, דחפו את הקריש מכל חלק של הצינור אל תוך בארות בודדות של פלטת 6 בארות המכילה PBS. שטפו את הקרישים שלוש פעמים ב-PBS, ולאחר מכן הכניסו מזרק של 1 מיליליטר ממולא בתמיסת סלין המצויד במחט 30 gauge לקצה אחד של צינור PE10 באורך 15 סנטימטר, ושאבו בזהירות קריש שטוף בודד אל הקצה הנגדי של הצינור.

לאחר מכן, חברו את צינור ה-PE10 המעומס בקריש דם לצינור PE50 באורך שלושה סנטימטרים עם קצה מדורג בקוטר 200 מיקרון. לאחר וידוא ההרדמה באמצעות היעדר תגובה ללחיצה על בהונות, חטאו את אזור הניתוח ב-Betadine ובאלכוהול 70%, והשתמשו בסקאלפל כדי לבצע חתך אנכי של סנטימטר אחד בין האוזן השמאלית לעין. הדביקו את הקצה הדיסטלי של הסיב האופטי של מד זרימה בלייזר דופלר על פני השטח החשופים של עצם הרקה שמאלית, מילימטר אחד משמאל ולארבעה מילימטרים מתחת ל-bregma, והתחילו בניטור הדופלר.

לאחר מכן, בצעו חתך אנכי של שלושה סנטימטרים בקו האמצע דרך הרקמות הרכות הפרי-וסקולריות כדי לחשוף את אזור הנורה הגזרנית השמאלית. באמצעות תפר משי שחור סטרילי בדרגת 6-0, קשרו את העורק הגזרני המשותף הפרוקסימלי השמאלי, ולאחריו קשרו את העורק הגזרני הפנימי השמאלי ואת העורק הפטריגופלטיני השמאלי באמצעות תפרי משי שחורים סטריליים בדרגת 7-0. בעזרת כויית חשמל מונו-פולרית, כווו את העורק התירואידי העליון השמאלי, ולאחר מכן השתמשו בתפרי משי שחורים סטריליים בדרגת 7-0 כדי לקשור באופן רפוי את העורק הגזרני החיצוני הפרוקסימלי השמאלי, ובאופן הדוק את הקצה הדיסטלי של כלי הדם.

השתמשו במיקרו-מספריים כדי ליצור חור בגודל 0.2 עד 0.25 מיקרון בין אתרי הליגציה של העורק הקרוטידי החיצוני, והחדירו לחור את הקטטר המכיל את התרומבוס תוך כדי שחרור הליגציה הפרוקסימלית של העורק הקרוטידי החיצוני. התקדמו עם הקטטר אל תוך העורק הקרוטידי המשותף כדי להדק את הקטטר במקומו, והדקו מחדש את הליגציה הפרוקסימלית של העורק הקרוטידי החיצוני. חתכו את הקצה הדיסטלי של העורק הקרוטידי החיצוני באמצעות כהייה, וסובבו את הקצה הפרוקסימלי החופשי של העורק הקרוטידי החיצוני עם כיוון השעון כדי ליישר את כלי הדם עם העורק הקרוטידי הפנימי, תוך כדי נסיגה של הקטטר.

לאחר מכן, שחררו את הקשירת העורק הקרוטידי הפנימי והחדירו מיד את הקטטר כ-9 מילימטרים אל תוך הפיצול של העורק המוחי האמצעי והקדמי. כעת, הדקו מחדש את התפר של העורק הקרוטידי הפנימי סביב הקטטר ולחצו בעדינות על המזרק כדי להזריק את התסחין לאזור הפיצול. אם נצפה בדולר זרימת דם הגבוהה או שווה ל-30% נמוך מהקו הבסיס, הסירו את הקטטר וקשרו מיד את הקצה הפרוקסימלי של העורק הקרוטידי החיצוני.

כדי לצלם את הקריש באמצעות מיקרו-טומוגרפיה ממוחשבת בנקודת הזמן הניסיונית המתאימה, לדלל ננו-חלקיקי זהב המכוונים לפיברין לריכוז של 10 milligrams per milliliter ב-PBS בריכוז 10 millimolar, ולבצע סוניקציה לחומר הדימות של הקריש למשך 30 דקות כדי להבטיח תהייה הומוגנית של הננו-חלקיקים. לאחר מכן, להזריק 300 microliters של החלקיקים המכוונים לפיברין אל הווריד של הפין בבעל החיים הניסיוני. להעביר את בעל החיים למצע של מכשיר המיקרו-CT ולהשתמש בחוט המחובר לסיכה כדי למשוך בעדינות את השיניים הקדמיות העליונות לצורך יישור הצוואר.

חמש דקות לאחר הזרקת ננו-חלקיקי הזהב, התחילו את הדמיון. כדי להמחיש את הקריש באמצעות הדמיה בבסיס אינפרא-אדום קרוב ex vivo, מקמו את רקמת המוח שהוצאה במכשיר ההדמיה כאשר הבסיס פונה כלפי מעלה. השגין תמונות של התסמיליים התרומבואמבוליים המסומנים פלואורסצנטית בעורקים של מעגל ויליס (circle of Willis).

לאחר מכן, מקמו את הרקמה כך שהקדקוד פונה כלפי מעלה וצלמו את התסמיליים התרומבואמבוליים הקורטיקליים. הרטה את הרקמה עם מספר טיפות של סליין, ולאחר מכן, באמצעות מכשיר brain matrix בהתאם להוראות היצרן, השגיחו במהירות שישה פרוסות מוחיות קורונליות בעובי של 2 מילימטרים כל אחת. תוך שמירה על הרטבתו של הפרוסות בעזרת סליין, השגיחו תמונות נוספות באינפרא-אדום קרוב (near-infrared) של שני המשטחים, הקדמי והאחורי, של החתכים.

כדי לכמת את שטח הקריש לאחר דימוי micro-CT, פתחו את קובצי רצף התמונות ובחרו ב-Image, לאחר מכן ב-Type ולאחר מכן ב-8-bit כדי להמיר את התמונות לגווני אפור של 8 ביט. כאשר פיקסל אחד של קובצי תמונת ה-CT תואם ל-0.053 מילימטרים, השתמשו ב-Analyze Set Scale כדי להזין 1, 0.053 ומילימטרים עבור Distance in pixels, Known distance ו-Unit of length, בהתאמה. לאחר מכן, תחת Edit, בחרו ב-Selection ולאחר מכן ב-Specify כדי להגדיר אזור עניין (ROI) על שטח של פרנכימת המוח ללא קריש או אזור היפר-דנסי הקשור לעצם.

מכיוון שהאזור המוגדר כמעניין (region of interest) חל על כל פרוסה בערימה, ודאו שהאזור אינו חופף לאזור בעל צפיפות גבוהה (hyperdense) באף אחת מהפרוסות. לאחר מכן, תחת Plugin, בחרו ב-Region of Interest ולאחר מכן ב-Background Subtraction מתוך Region of Interest, והזינו את המספר שתיים עבור מספר סטיות התקן מהממוצע (Number of standard deviations from the mean). איתרו נגעים בעלי צפיפות גבוהה הקשורים לתסמיכים תרומבואמבוליים ובצעו זום לאזור הנגע.

כעת, בחרו ב-Image, לאחר מכן ב-Adjust וב-Threshold, והזינו רמת סף תחתונה (Lower Threshold Level) של 22 ורמת סף עליונה (Upper Threshold Level) של 255. בחרו ב-Over/Under כדי להציג את הפיקסלים שמתחת לערך הסף התחתון בכחול, את הפיקסלים שעברו סף בגווני אפור, ואת הפיקסלים שמעל ערך הסף העליון בירוק. לאחר מכן, השתמשו בכלי הבחירה החופשית (Freehand selection tool) כדי לסמן אזורי עניין המקיפים את הגשמים ההיפר-דנסיים הקשורים לתסביב תרומבואמבולי, ללא אזורים גרמיים.

השתמשו ב-Analyze, Set Measurements כדי לבחור את Area, Mean gray value, ו-Integrated density area times mean. סמנו את האפשרויות הבאות: Limit to threshold ו-Display label. השתמשו ב-Analyze Measure כדי לקבל את הנתונים הכמותיים, ולאחר מכן שמרו את התוצאות.

תמונות micro-CT בקו הבסיס אלו התקבלו in vivo חמש דקות לאחר הזרקה של ננו-חלקיקי זהב המכוונים לפיברין, שעה אחת לאחר שבח איסכמי במוח של עכברים. ניתן לראות בבירור את הקריש המוחי באזור הת分פג של העורק המוחי הקדמי והתיכון של העורק התוך-גולגולתי הפנימי הדיסטלי. תמונות micro-CT של מעקב אינן מראות שינויים בקריש במעגל ויליס (circle of Willis) בבעלי החיים שקיבלו טיפול בתמיסת סליין, עם זאת, בבעלי חיים שטופלו בTissue plasminogen activator נראה פירוק הדרגתי של הקריש במעגל ויליס עם הזמן, כפי שסומן על ידי חצי החיצים הכחולים.

קיים מתאם חזק בין צפיפות ה-CT in vivo לבין הדימות ב-near-infrared ex vivo עבור תסבילי תרומבואמבולים שיוריים לאחר 24 שעות. לדוגמה, בתמונות אלו, האזורים ההיפר-דנסיים ב-micro-CT, שהוצגו באמצעות חלקיקי זהב המכוונים לפיברין, תואמים ישירות לאזורי אות ה-near-infrared שזוהו על ידי פרובה פלואורסצנטית הרגישה לפעילות קישור צולב של פיברין המתווכת על ידי פקטור קרישה 13A, הנקשרת לתרומבוס במהלך תהליך הבשלת הקריש שנוצר. יתרה מכך, כפי שניתן לראות בתמונות אלו, ניתן להשתמש בצביעת TTC כדי להעריך את השפעות התרומבוליזה על נזק מוחי איסכמי בבעלי חיים שקיבלו תמיסת סליין כביקורת בהשוואה לבעלי חיים שטופלו במפעיל פלסמינוגן רקמתי.

לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצע את הדמיית ה-micro-CT in vivo והדמיית הפלואורסצנציה בבסמיכות לאינפרא-אדום של קריש דם ex vivo תוך כשעה, במידה והדבר מבוצע כראוי ובעת שגשוני ההדמיה זמינים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בננו-חלקיקי זהב שאינם מצברים ומכוונותים לפיברין לצורך הדמיה ישירה של קריש דם מוחי מבוססת micro-CT. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית או ICPMS (ספקטרומטריית מסות עם פלזמה מצומדת השראית), כדי לענות על שאלות נוספות כגון התפלגות רקמנית וקינטיקה של דם של ננו-חלקיקי זהב.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום השבץ או מחקרים קרדיווסקולריים לבחון תסחיף תרומבוטי במודלים של בעלי חיים שהיו פגיעים לתרומבוזיס כלילי או לאוטם מוחי תסחיפי. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבנה טובה של אופן הכנת קרישים מסומנים פלואורסצנטית עבור שבץ תרומבואמבולי בעכברים, ושל ביצוע דימוי רציף וכימות של תסחיפי תרומבוזה מוחיים in vivo ולאחר מכן ex vivo, ובכך ניטור התפתחות התרומבוס.