פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לפתח שיטה לסינון מהיר ואוטומטי בתפוקה גבוהה של פרוטופלסטים צמחיים, במיוחד כדי לטפל בצוואר הבקבוק הנוכחי בסינון מוקדם של מספר רב של יעדי עריכת גנום והשתקת גנים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביוטכנולוגיה של הצמח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ייצור וטרנספורמציה אוטומטיים של פרוטופלסט בתפוקה גבוהה לסינון מקביל מהיר של תפקוד המקדם בביטוי גנים.

הליך זה יודגם באמצעות תרבית ההשעיה הנפוצה טבק צהוב בוהק שניים, או BY-2. התחל בגידול תרבית BY-2 בבקבוק ארלנמאייר, כמתואר בטקסט הפרוטוקול. ביום בידוד הפרוטופלסט, ערבבו היטב את התרבית מכיוון שהתאים ישקעו במהירות, והעבירו שישה מיליליטר מהתרבית לצינור צנטריפוגה תחתון חרוטי של 15 מיליליטר.

תן לתאים להתיישב לפחות 10 דקות. התאם את נפח התא הארוז ל-50% מהנפח הכולל על ידי הסרת הנפח המתאים של סופרנטנט. נער את הצינור על ידי היפוכו ולאחר מכן השתמש בפיפטות רחבות כדי להחדיר 500 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר של צלחת בת שש בארות לעיכול.

השלב הראשון בהליך זה הוא להפעיל את כל מרכיבי מערכת הרובוטיקה, שהם מניע המיקרופלייט, המטפל בנוזלים, קורא הצלחות הרב-מצבי, המתקן הרב-מצבי, מחמם הצלחות או הצ'ילר והמחשבים. לאחר מכן, פתח את תוכנת תזמון המשימות של מעביר הצלחות המשלבת את מוביל המיקרו-פלטות עם הציוד האחר כדי לאפשר העברת צלחות בין כל פריט ציוד. בתוכנת העברת הלוחות, הגדר את המפרט הטכני עבור כלי המעבדה המשמשים בפרוטוקול.

לחץ על הגדרה מסרגל הכלים הראשי ובחר בפקודה נהל סוגי גורמים מכילים. בחר את סוג הגורם המכיל המתאים מרשימת סוגי הגורמים המכילים הקיימים. הגדר את המפרט הטכני עבור כל כלי המעבדה שבהם יתקל מוביל הצלחות.

השלב הבא הוא להגדיר את מיקומי ההתחלה והסיום עבור כל גורם מכיל. לחץ על הכרטיסייה התחל/סיום בפרוטוקול ספציפי. בחר את מיקום ההתחלה של כל מיכל וסמן את התיבה עבור מכסה, ללא מכסה הן במצב ההתחלה והן במצב הסיום.

לאחר הגדרת מיקומי ההתחלה והסיום עבור כל כלי מעבדה, טען ידנית את כל הלוחות למצב ההתחלה עבור כל זרימת העבודה. טען את לוחות הסינון הפלואורסצנטיים של 96 בארות למלון שתיים, את צלחות שש הבארות עם תאי BY-2 למלון שלוש, צלחת באר בעומק 96 שתשמש לטרנספורמציה לקן שניים של מחמם הצלחת או הצ'ילר, וצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל את תמיסת האנזים על המתקן הרב-מצבי. כדי לבצע טרנספורמציה בפרוטוקול, טען מראש כל באר של צלחת הבאר בעומק 96 עם 10 מיקרוליטר של DNA פלזמה המכיל את מבנה מדווח החלבון הפלואורסצנטי הכתום ודגירה על מחמם הצלחת או הצ'ילר בארבע מעלות צלזיוס.

טען את כל האספקה והצלחות על פלטפורמת הטיפול האוטומטית בנוזלים במקומות המיועדים לכך. טען צלחת של 96 בארות טעונה מראש עם 200 מיקרוליטר של תמיסת פוליאתילן גליקול 40% לכל באר בעמודה הראשונה. טען קופסה של קצות פיפטות בקן שמונה.

כדי להגדיר את המיקום של כל פריט בתוכנת הפלטפורמות האוטומטיות לטיפול בנוזלים, בחר כלים מהתפריט ולחץ על Labware Editor. בחר את סוג כלי המעבדה מהתפריט הנפתח. בחר בכרטיסייה פרוטוקול ראשי ולחץ על הגדר תוכנת מעבדה כדי להגדיר את המיקום של כל חלק של תוכנת מעבדה.

לחץ על הפעל כדי לאתחל את כל המכשירים שישמשו בפרוטוקול. לבסוף, בחלון סייר העבודה, לחץ על הוסף יחידת עבודה כדי לאמת את כל תוכנות המעבדה במערכת ולהתחיל את הפרוטוקול האוטומטי. החלק הרגיש ביותר בהליך הוא טרנספורמציה של פרוטופלסט.

מכיוון שהטרנספורמציה מבוצעת על ידי מערכת הרובוטיקה, זה קריטי שהפרוטוקולים האוטומטיים יוגדרו כהלכה. למטרות סרטון זה, יוצגו רק שלבים נבחרים בפרוטוקולים האוטומטיים. במהלך פרוטוקול הטרנספורמציה, פלטפורמת הטיפול האוטומטי בנוזלים שואבת 70 מיקרוליטר מתמיסת הפרוטופלסט מצלחת שש הבארות ומפזרת אותו לתוך צלחת הבאר בעומק 96 בקן השישי.

לאחר מכן, קצות פיפטה חדשים משמשים לשאיבה איטית של 70 מיקרוליטר מתמיסת פוליאתילן גליקול צמיגה מאוד מצלחת הבאר העמוקה הטעונה מראש ולהוציא לחלוטין את התמיסה לבארות הרלוונטיות של צלחת הבאר העמוקה. לאחר מכן, פלטפורמת הטיפול האוטומטית בנוזלים מעבירה את צלחת הבאר העמוקה משש הבאה לקן תשע, שם מוביל הצלחת מרים את הצלחת ומעביר אותה לתחנת שייקר הצלחות ומנער אותה במהירות של 1500 סל"ד למשך 30 שניות. לאחר דגירה של 20 דקות ללא ניעור כדי לאפשר שיווי משקל של פרוטופלסטים, מעביר הצלחת מעביר את צלחת הבאר בעומק 96 למתקן הרב-מצבי ומפעיל את פרוטוקול הכביסה.

לאחר השלמת פרוטוקול הבידוד והטרנספורמציה האוטומטי של פרוטופלסט, הסר את הצלחת עם הפרוטופלסטים שעברו טרנספורמציה ממערכת הרובוטיקה של המלון. הפעל את המיקרוסקופ ההפוך, המצלמה ומנורת הפלורסנט. בחר את המטרה פי 10 להתמקדות ראשונית בפרוטופלסטים.

הפעל את מנורת הלוגן וסגור את התריס למנורת הפלורסנט. טען את הצלחת על מערכת המיקרוסקופ והתמקד בפרוטופלסטים באמצעות שדה בהיר. לאחר מכן, כבה את נורת הלוגן ופתח את התריס למנורת הפלורסנט.

בחר את ערכת המסננים Cy3/TRITC להדמיה של החלבון הפלואורסצנטי הכתום המתבטא על ידי הפרוטופלסטים הטרנסגניים. סרוק כל באר כדי לקבוע את מספר הפרוטופלסטים המבטאים את הסמן הפלואורסצנטי. עיכול אנזימים של פרוטופלסטים בתנאים המפורטים בפרוטוקול זה הביא ל-2,820,000 פרוטופלסטים לצלחת של שש בארות.

אובדן ריכוז הפרוטופלסט לאחר כל שלב העברה בפרוטוקול הוערך. לאחר פרוטוקול העיכול, הועברו 11,500 פרוטופלסטים לכל באר של צלחות הבאר בעומק 96. לאחר השלמת פרוטוקול הטרנספורמציה, הועברו 1,230 פרוטופלסטים ללוחית הסינון הפלואורסצנטית של 96 בארות.

כדי להבטיח ששלבי פיפטינג מרובים לא יפגעו בפרוטופלסטים, נבדקה כדאיותם על ידי צביעת פרופידיום יודיד. התוצאות לא הראו הבדל משמעותי בכדאיות לאחר העיכול, לאחר ההעברה לצלחת הסינון הפלואורסצנטית של 96 בארות, ולאחר פרוטוקול הטרנספורמציה. פרוטוקול הטרנספורמציה הצליח לייצר תאים טרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי כתום למרות שיעילות הטרנספורמציה הייתה נמוכה, רק כ -2% זאת בשל הפלזמה הבינארית הגדולה בה נעשה שימוש והפרוטוקול לא עבר אופטימיזציה ספציפית עבור פרוטופלסטים BY-2.

מדדים שהתקבלו עבור מהלך הזמן של הפרוטוקול הראו כי ההשקעה העיקרית של הזמן מושקעת בשלב העיכול. משך הזמן המלא של בידוד וטרנספורמציה של פרוטופלסט היה שלוש שעות, 50 דקות ו-53 שניות ללא צורך בקלט חיצוני מהמפעיל. לאחר ההגדרה הנכונה, טכניקה זו יכולה להתבצע על ידי הרובוט תוך פחות מארבע שעות.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הביוטכנולוגיה של הצמח לבצע הליכים גנומיים של יבולים בעלי תפוקה גבוהה, כגון עריכת גנום וסינון מקדם.