Name: פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: למד שיטה רובוטית לבידוד וההשנאת פרוטופלאסטים בקנה מידה גבוה ב-BY-2. שיטה זו מאפשרת סינון מקבילי מהיר של פונקציית מקדמים בביטוי גנים בצמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי הסוכנות לפרויקטים מחקריים מתקדמים - אנרגיה (ARPA-E) פרס מס. דה-AR0000313.

1. הקמת תא תרבויות השעיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן נוזלי BY-2 מדיה ידי הוספת 4.43 גרם Linsmaier &amp; Skoog התקשורת בסל, 30 גרם של סוכרוז, 200 מ&quot;ג KH 2 PO 4, ו -200 מיקרוגרם של 2,4-dichlorophenoxyacetic חומצה (2,4-D) ל -900 מ&quot;ל של מזוקקים מי pH 5.8 עם 0.1 M KOH. לאחר תקנון pH, להתאים את עוצמת סופית 1,000 מיליליטר עם מים מזוקקים חיטוי. מדיה ניתן לאחסן עד 2 שבועות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן בבקבוק 250 מ&quot;ל Erlenmeyer עם 100 מ&quot;ל של נוזל BY-2 התקשורת חתיכה אחת של יבלת BY-2 (&gt; 1 ס&quot;מ קוטר) גדל על BY-2 התקשורת מוצק (נוזל BY-2 מדיה בתוספת 1% אגר) ואת החותם עם רדיד אלומיניום. דגירת התרבות ב C 28-30 מעלות עם רעד במשך 5 ימים. הערה: BY-2 יבלת מתוחזק על תקשורת מוצקה עבור אחסון לטווח ארוך, כמו תרבויות נוזל תהיינה לגדול יותר במהירות. נפח תרבות יכול להיות מותאם לפי צורך, בדרך כלל תרבות 100 מיליליטר תהיה מסוגל טעינת שלושים ושלושה 6-wצלחות ell. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 2 מ&quot;ל של שלב יומן BY-2 תרבות 98 מ&quot;ל של התקשורת BY-2 טריים דגירה של 5-7 ימים ב 28-30 מעלות צלזיוס עם רעד. הערה: culturing-Sub של תרבויות נוזליות הוקמו יכולה להתבצע באמצעות בקביעות 1: 100 דילולים של תרבויות ישנות 5-7 יום, ולא חיסון עם יבלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התרבות ביסודיות, כמו תאים יישב במהירות, והעברת 6 מ&quot;ל של תרבית תאים לצינור צנטריפוגות התחתונה חרוטי 15 מ&quot;ל ולתת התאים להסתפק דקות 10 לפחות. התאם את נפח תא ארוז 50% מכלל נפח על ידי הסרת supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake צינור ידי היפוך ו pipet 500 μl לבאר כל צלחת 6-גם לעיכול. השתמש pipets רחב נשא להעביר את התאים בשלב זה, כפי שהם צפופים יסתום טיפים pipet סטנדרטי. </li></ol> 2. בידוד פרוטופלאסט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כל המרכיבים של מערכת רובוטית (איור 1A) ולפתוח את המשימה מניעת צלחת תזמון רךכלי. תכנית תזמון משימות משלבת את מניע microplate עם הציוד האחר כדי לאפשר העברת הצלחות בין כל חלקי ציוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ניסויים, להגדיר את המפרט הטכני עבור מעבדתי (למשל, צלחות, מכסים) בשימוש בפרוטוקול, כמו גם התחלה ועמדות מסתיימות עבור כל פיסת מעבדתי, בתוכנה המניעה צלחת, כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הגדרה מסרגל הכלים הראשי בתוכנה המניעה צלחת ובחר את פקודת סוגי מכולות ניהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם סוג המכל מופיע בספריית הסוג מיכל הקיימת, ולאחר מכן בחר את המכל המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם סוג המכל אינו רשום בספריית סוג המכל הקיימת ולאחר מכן לחץ על הוספה כדי לציין סוג מכל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הוספת סוג מיכל חדש, הכנס את הממדים של המכל החדש (גובה, רוחב, מידות ערמה, ואת תפסן לקזז) לתוך הכרטיסיות רצויות ולחץ על שמור.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הממדים הנכונים אינם זמינים מהיצרן, אז לקבוע במדויק בכל הממדים עד המילימטר הקרוב באמצעות מחוגה. שגיאות במדידת הממדים מיכל תגרומנה לכישלון מניע הצלחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 2.2.2 דרך 2.2.4.1 לכל סוגים מיכל שמניע הצלחת יפגוש. לאחר השלמת שלב זה עבור כל מעבדתי, יש צורך להגדיר את ההתחלה מיקום הסיום עבור כל מכולה (שלב 2.2.6). הערה: עבור פרוטוקול זה המעבד כוללת את 6-גם צלחת, צלחת העמוקה היטב, ואת 96-גם צלחת הקרנת ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את מיקום ההתחלה וסיום של כל מכולה, לחץ על כרטיסיית ההתחלה / סיום בפרוטוקול ספציפי. ראשית, בחר את מיקום ההתחלה של כל מכולה. בשלב הבא, סמן את התיבה עבור עפעפיים / Unlidded היא ברמה של ההתחלה וסיום המיקום. חזור על הפעולה עבור כל מכולה. הערה: אם המיכל יישאר על עוד פיסת סוסיםipment (במקום מניע הצלחת) המיקום סוף ניתן להשאיר ריק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה באופן ידני לטעון את כל הצלחות לתוך למצב ההתחלתי עבור כל העבודה. טען את צלחות ההקרנה פלורסנט 96-היטב לתוך מלון 2, 6 צלחות היטב עם BY-2 תאים לתוך מלון 3, צלחת 96 עמוק היטב אשר ישמשו לטרנספורמציה על הקן מחמם צלחת / ילר 2, ו חרוטי 50 מ&quot;ל שפופרת המכילה את פתרון האנזים (ראה קובץ משלימה, סעיף 1.2.2) על מתקן המצב המרובה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם השינוי יתבצע בפרוטוקול, טרום לטעון 96 צלחת עמוקה היטב עם 10 μl של ה- DNA פלסמיד לכל טוב (1 מיקרוגרם / μl, A 260/280&gt; 1.8) המכיל את לבנות כתב OFP דגירה על הצלחת דוד / ילר ב 4 ° C.. כל טוב ישמש טרנספורמציה יחיד, ובכך הגיע מספר בארות מלא יהיה תלוי בהגדרת הניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טענת את כל האספקה ​​והצלחות על האוטומציהלפלטפורמת טיפול ד נוזלי במקומות המיועדים ולהגדיר את המיקום של כל פריט ב תוכנות שליטה אוטומציה (איור 1B). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען צלחת 96-היטב מראש עם 200 μl של PEG 40% ב MMG (0.4 M מניטול, 100 מ&quot;מ MgCl 2, 4 מ&quot;מ MES, pH 5.7) בטור 1, 200 μl של יודיד propidium (PI, 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) בטור 2, ו -200 μl של אתנול בעמודה 3 (הקן 2), וקופסת טיפים פיפטה בקן 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את מיקומו של מעבדתי בתוכנה של פלטפורמת טיפול הנוזל אוטומטית, כלים מהתפריט ולחץ עורך Labware. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את סוג מעבדתי מהתפריט הנפתח או להגדיר סוג מעבדי חדש באמצעות הלחצן Labware החדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המיקום של כל פיסת המעבדת שנבחרה על ידי בחירת הכרטיסייה ראש הפרוטוקול ולחיצת Labware Configure. ודא כי כל פיסת מעבדתי להוסיף על פלטפורמת טיפול נוזל אוטומטית היאכהגדרתו ערב הפעלת הפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעורר את הפרוטוקולים האוטומטיים, לחץ על חלון פרופיל Explorer ובחר את שמו של הפרוטוקול שיופעל (בידוד פרוטופלאסט, ספירת תאים, וטרנספורמציה בתיווך PEG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הפעל כדי לאתחל את כל ההתקנים אשר ישמשו בפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, בחלון העבודה Explorer, לחץ על הוסף יחידת עבודה כדי לאמת את כל המכולות / מעבדתי במערכת ולהתחיל הפרוטוקול האוטומטי. הערה: תיאור מלא של הפרוטוקולים האוטומטיים מוכלים קובץ המשלימה. </li></ol></li></ol> 3. יקבע תקן Curve עבור ספירת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידנית להתרכז פרוטופלאסט בריכוז של 1 x 10 6 פרוטופלאסט / מ&quot;ל בנפח של 1 מ&quot;ל. צנטריפוגה פרוטופלאסט XG ב 1000 למשך 10 דקות, ולהסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה ידנית של 900 μl של אתנול 70% (שמרו על 4 מעלות צלזיוס) כדי גלולה פרוטופלאסטמחדש להשעות גלולה. דגירה במשך 10 דקות על קרח כדי לתקן תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של PI (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) אל פרוטופלאסט לתייג את הגרעינים ולאפשר זיהוי על ידי הקורא צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 80 μl של נוזל BY-2 מדיה לתוך כל שורה ועמודה של צלחת הקרנת פלורסנט 96-היטב החל עמודת 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטור 1 של צלחת ההקרנה פלורסנט 96-היטב, להוסיף 70 μl של פרוטופלאסט ו -50 μl BY-2 התקשורת היטב כל בעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את צלחת קן 6 של פלטפורמת טיפול נוזל אוטומטית, ולהפעיל דילול סדר פי 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לערוך דילול סדר על פלטפורמת טיפול נוזל אוטומטית, לחץ הפעל אשף דילול סדר ולהתאים את עוצמת קול ההעברה (60 μl), מספר תערובות ונפח (2, 70 μl), בארות ראשוניות (טור 1, שורות AF), דילול בארות (עמודות 2-11, שורות AF), ואת לשאוב ומאפיינים לוותר (0.5 מ&quot;מ היטב למטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגדרת הפרמטרים, לשמורd להריץ את הפרוטוקול. הערה: מכיוון שכל פרוטופלאסט מסומן עם PI (בשל קיבעון של תאים), הקרינה היא מידתית לריכוז פרוטופלאסט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דילול סדרתי יושלם, הסר את הצלחת מן הקן 9 ולהכניס לתוך קורא הצלחת ולהפעיל את הפרוטוקול העקום הסטנדרט בתוכנה קוראת צלחת. הערה: עקומת סטנדרט אז תופק על ידי השוואת הקרינה מן PI (עירור 536 ננומטר / פליטה 620 ננומטר) בכל טוב עם ריכוז פרוטופלאסט ידוע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת הפרוטוקול הקורא הצלחת, להסיר את הצלחת לאסוף את כל תאים מהונדסים עבור מעוקר או נהלי דה-חִיוּן נוספים שנקבעו פרוטוקולי בטיחות ביולוגיים &quot;. </li></ol> 4. ניתוח מיקרוסקופי של טרנספורמציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת עם פרוטופלאסט טרנספורמציה (התוצר של אוטומט פרוטוקול 3, קובץ משלימה) ממלון 1 של מערכת רובוטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפנותעל מיקרוסקופ הפוכה, מצלמה, ואת מנורת פלורסנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המטרה 10X עבור היין הראשי התמקדות פרוטופלאסט, להדליק את מנורת הלוגן, ולסגור את התריס על מנורת פלורסנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת טען גבי מערכת מיקרוסקופית ולהתמקד פרוטופלאסט באמצעות brightfield. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התמקדות פרוטופלאסט, לכבות את נורת הלוגן ולפתוח את התריס על מנורת פלורסנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מסנן CY3 / TRITC להגדיר להדמיה של חלבון pporRFP שהביע פרוטופלאסט המהונדס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק היטב כל כדי לקבוע את מספר פרוטופלאסט להביע pporRFP סמן ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את יעילות השינוי כמספר הכולל של פרוטופלאסט המבטא את בסמן פלורסנטי המספר הכולל של פרוטופלאסט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף כל צלחות המכילות תאים מהונדסים בשקיות בטיחות ביולוגיות שאושרו מעוקר או נהלי דה-חִיוּן נוספים שנקבעו פרוטוקולי בטיחות ביולוגיים &quot;. </li></ol>

<ol><li>Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+transgenic+nematode+control+in+developed+and+developing+world+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops.</a> Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).</li>
<li>Duke, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+transgenic%2C+herbicide-resistant+crops+in+the+United+States+almost+20+years+after+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag.+Sci%22%5BJournal%5D)">Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction.</a> Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).</li>
<li>Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomics%2C+physiology+and+breeding+approaches+for+improving+drought+tolerance+in+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Theor.+Appl.+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops.</a> Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).</li>
<li>Hu, H., Xiong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+and+breeding+of+drought-resistant+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Bio%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops.</a> Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).</li>
<li>Marco, F., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarco%2C+F+%22Plant+Biology+and+Biotechnology%22">Plant Biology and Biotechnology</a>. , Springer. 579-609 (2015).</li>
<li>Edgerton, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+insect+resistance+traits+increase+corn+yield+and+yield+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability.</a> Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).</li>
<li>Vanhercke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+biomass+for+high+energy+density%3A+oilseed-like+triacylglycerol+yields+from+plant+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotech.+J%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves.</a> Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).</li>
<li>Baxter, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-year+field+analysis+of+reduced+recalcitrance+transgenic+switchgrass%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotech.+J%22%5BJournal%5D)">Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass.</a> Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).</li>
<li>Xing, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+toolkit+for+multiplex+genome+editing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.</a> BMC Plant Biol. 14 (1), 327(2014).</li>
<li>Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-mediated+transient+gene+expression+and+silencing+system+in+maize+mesophyll+protoplasts%3A+a+valuable+tool+for+signal+transduction+study+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physio.+Plant%22%5BJournal%5D)">PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize.</a> Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).</li>
<li>Martinho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+miRNA+pathways+using+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).</li>
<li>Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+for+gene+silencing+using+siRNAs+in+rice+leaf+and+stem-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts.</a> Plant Methods. 2 (1), 13(2006).</li>
<li>Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasts%3A+a+useful+research+system+for+plant+cell+biology%2C+especially+dedifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation.</a> Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).</li>
<li>Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+meets+plant+sciences%3A+Gold+functionalized+mesoporous+silica+nanoparticle+mediated+protein+and+DNA+codelivery+to+plant+cells+via+the+biolistic+method%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method.</a> Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).</li>
<li>Křenek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+plant+transformation+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens%3A+Principles%2C+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications.</a> Biotechnol. Adv. , (2015).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
<li>Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation%2C+growth+and+cryopreservation+of+plant+cell+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures.</a> Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).</li>
<li>Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+BY-2+cell+line+as+the+%26%2334%3BHeLa%26%2334%3B+cell+in+the+cell+biology+of+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Tobacco BY-2 cell line as the &#34;HeLa&#34; cell in the cell biology of higher plants.</a> Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).</li>
<li>Centomani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+DNA+methylation+in+the+control+of+cell+growth+during+heat+stress+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells.</a> Protoplasma. , 1-9 (2015).</li>
<li>Sgobba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+deficiency+stimulates+a+stress+condition+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechnologia%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells.</a> BioTechnologia. 94 (2), (2013).</li>
<li>Väisänen, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coniferyl+alcohol+hinders+the+growth+of+tobacco+BY-2+cells+and+Nicotiana+benthamiana+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings.</a> Planta. 242 (3), 747-760 (2015).</li>
<li>Ortiz-Espìn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+Trxo1+increases+the+viability+of+tobacco+BY-2+cells+under+H2O2+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Botany%22%5BJournal%5D)">Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment.</a> Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).</li>
<li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cis-Golgi+proteins+accumulate+near+the+ER+exit+sites+and+act+as+the+scaffold+for+Golgi+regeneration+after+brefeldin+A+treatment+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Bio.+Cell%22%5BJournal%5D)">cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells.</a> Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).</li>
<li>Madison, S. L., Nebenführ, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+dual-labeled+Golgi+stacks+in+tobacco+BY-2+cells+reveals+similar+behaviors+for+different+cisternae+during+movement+and+brefeldin+A+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment.</a> Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).</li>
<li>de Pinto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-nitrosylation+of+ascorbate+peroxidase+is+part+of+programmed+cell+death+signaling+in+tobacco+Bright+Yellow-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).</li>
<li>Hanamata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+monitoring+of+autophagic+flux+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signa.+Behav%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510(2013).</li>
<li>Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+Studies+on+proliferation%2C+differentiation%2C+and+death+of+BY-2+cultured+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytologia%22%5BJournal%5D)">Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells.</a> Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).</li>
<li>Yasuhara, H., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aphidicolin-induced+nuclear+elongation+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).</li>
<li>Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+coupled+cell-free+transcription-translation+system+based+on+tobacco+BY-2+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates.</a> Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).</li>
<li>Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+BY-2+cell-free+lysate%3A+an+alternative+and+highly-productive+plant-based+in+vitro+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system.</a> BMC Biotechnol. 14 (1), 37(2014).</li>
<li>Alieva, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+coral+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of coral fluorescent proteins.</a> PLoS ONE. 3 (7), 2680(2008).</li>
<li>Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+regeneration+from+leaf-derived+protoplasts+within+the+Daucus+genus%3A+effect+of+different+conditions+in+alginate+embedding+and+phytosulfokine+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Tiss.+Org%22%5BJournal%5D)">Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application.</a> Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).</li>
<li>Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+gene+expression+system+in+Populus+euphratica+Oliv.+protoplasts+prepared+from+suspension+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physio.+Plant%22%5BJournal%5D)">A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells.</a> Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).</li>
<li>Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+PEG-mediated+transient+gene+expression+system+in+grape+protoplasts+and+its+application+in+subcellular+localization+studies+of+flavonoids+biosynthesis+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Hort%22%5BJournal%5D)">An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes.</a> Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).</li>
<li>Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transformation+of+oil+palm+protoplasts+by+PEG-mediated+transfection+and+DNA+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection.</a> PLoS One. 9 (5), 96831(2014).</li>
<li>Sasamoto, H., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+nicotinic+acid%2C+nicotinamide+and+trigonelline+on+the+proliferation+of+lettuce+cells+derived+from+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts.</a> Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).</li>
<li>Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+embryo+formation+from+co-cultivated+protoplasts+of+Brassica+rapa+%26+B.+juncea%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Exp.+Ag%22%5BJournal%5D)">Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea.</a> Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).</li>
<li>Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation+system+for+production+of+fertile+transgenic+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants.</a> Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).</li>
<li>Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplast+isolation+and+transient+gene+expression+in+switchgrass%2C+Panicum+virgatum+L%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L.</a> Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).</li>
<li>Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switchgrass+%28Panicum+virgatum+L.%29+cell+suspension+cultures%3A+Establishment%2C+characterization%2C+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application.</a> Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).</li>
<li>Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+transient+transformation+in+tobacco+protoplasts+is+independent+of+plasmid+amount%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount.</a> Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).</li>
<li>Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+accumulation+of+GFP+in+a+non-acididc+vacuolar+compartment+via+a+C-terminal+propeptide-mediated+sorting+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway.</a> Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).</li>
<li>De Sutter, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+jasmonate+signalling+via+automated+and+standardized+transient+expression+assays+in+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells.</a> Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרים.

הפרוטוקול המתואר לעיל יאומת בהצלחה לבידוד פרוטופלאסט, ספירה, וטרנספורמציה באמצעות תרבית תאי השעית טבק BY-2; עם זאת, הפרוטוקול יכול בקלות להיות מורחב על כל תרבות השעית צמח. נכון לעכשיו, בידוד וטרנספורמציה פרוטופלאסט הושגה בצמחים רבים, כולל תירס (Zea Mays) 10, גזר (Carota Daucus) 32, צפצפה (צפצפת הפרת) 33, ענבים (גפן היין) 34, שמן דקלים (guineensis Elaeis) 35 36, חסה (S...

בשנים האחרונות חלה תנופה משמעותית דגש על העיצוב של יבולים מהונדסים להתגבר מחלות שונות 1, מעניק עמידות עשבים 2, להעניק בצורת 3,4 וסובלנות מלח 5, למנוע herbivory 6, להגדיל את התשואה ביומסה 7, ולהקטין סרבנות דופן תא 8. מגמה זו כבר שנעזר בפיתוח כלים מולקולריים חדשים להפקת צמחי מהונדס, כולל הגנום עריכה באמצעות CRISPR ו TALENs 9, ואת הגן השתקה דרך dsRNA 10, מירנה 11, ו siRNA 12. בעוד הטכנולוגיות הללו יש לפשט את הדור של צמחים מהונדסים, הם גם יצרו צוואר בקבוק, שבו המספר העצום של צמחים מהונדסים שנוצר לא יכול להיות מוקרן באמצעות מערכות מסורתיות המסתמכות על התחדשות צמח. הקשורים צוואר הבקבוק הזה, תוך השתקה בונה לעריכת הגנום יכול להיות מוכנס לתוך במהירות צמחים, רבים שלתכונות ממוקדות מצליחות לייצר את האפקט הרצוי, אשר לעתים קרובות ומתגלה רק צמחים מנותחים בחממה. בעבודה זו, פיתחנו שיטה מהירה, אוטומטית, הקרנת תפוקה גבוהה של פרוטופלאסט צמח, במיוחד כדי לענות על צוואר הבקבוק הנוכחי להקרנה מוקדמת של מספר גדול של עריכת-הגנום הגן השתקה מטרות. השימוש פרוטופלאסט, בניגוד בתאי צמח שלם, יש מספר יתרונות לפיתוח פלטפורמה אוטומטית. ראשית, פרוטופלאסט מבודד לאחר העיכול של דופן תא צמח, ועם המחסום הזה כבר לא קיים, יעילות שינוי היא גדלה 13. בתאי צמח שלמים יש רק שתי שיטות ותיקות לטרנספורמציה, biolistics 14 ו Agrobacterium בתיווך טרנספורמציה 15. אף אחת מהשיטות הללו יכולים להיות מתורגמים בקלות לפלטפורמות טיפול נוזל, כמו biolistics דורש ציוד מיוחד עבור transformation, ואילו Agrobacterium טרנספורמציה בתיווך דורשת שיתוף תרבות והסרה הבאה של החיידקים. לא ניתנים עבור שיטות תפוקה גבוהות. במקרה של פרוטופלאסט, שינוי מתבצע באמצעות פוליאתילן גליקול שיגרתי (PEG) transfection בתיווך 16, מחייב חילוף פתרון מספר בלבד, והוא אידיאלי עבור פלטפורמות טיפול נוזל. שנית, פרוטופלאסט, מעצם הגדרתו, תרבויות תא בודד, ובכך הבעיות קשורות היווצרות בצעדים כבדה שרשרת בתרביות תאי צמח, אינם שנצפה פרוטופלאסט. מבחינת לסינון מהיר באמצעות ספקטרופוטומטר מבוסס-צלחת, התקבצות של תאים, או תאים במטוסים מרובים יובילו קושי ברכישת מדידות עקביות. מאז פרוטופלאסט צפוף גם מאשר התקשורת והתרבות שלהם, הם משקעים לתחתית בארות, ויצרו בשכבה, שהיא תורמת spectrophotometry מבוסס צלחת. לבסוף, בעוד תרבויות השעית תא צמח הם primarily נגזר יבלת 17, ניתן לקצור פרוטופלאסט ממספר רקמות הצמח, מה שמוביל את היכולת לזהות ביטוי רקמות ספציפיות. לדוגמא, היכולת לנתח root- או ביטוי ספציפי עלים של גן יכול להיות חשוב מאוד לניבוי הפנוטיפ. מסיבות אלה, פרוטוקולים שפותחו בעבודה זו אומתו באמצעות פרוטופלאסט מבודד טבק-בשימוש נרחב (Nicotiana tabacum L.) &#39;צהוב בוהק&#39; 2 (BY-2) תרבות ההשעיה. תרבות ההשעיה BY-2 תוארה תא &quot;הלה&quot; של צמחים גבוהים יותר, בשל השימוש הנפוץ שלה באנליזה מולקולרית של בתאי צמח 18. לאחרונה, BY-2 תאים שמשו כדי לחקור את ההשפעות של צמח לחצי 19-22, לוקליזציה חלבון תאית 23,24, ביולוגיה של תא בסיסי 25-27 הוכחת השירות הרחב של תרבויות אלה בביולוגית צמח. יתרון נוסף של תרבויות BY-2 הואהיכולת לסנכרן התרבויות עם aphidicolin, מה שעלול להוביל שחזור משופר עבור ביטוי גנים שלומד 28. יתר על כן, שיטות פותחו עבור החילוץ של BY-2 פרוטופלאסט באמצעות אנזימים בעלות נמוך 29,30, כמו אנזימים מסורתיים המשמשים לייצור פרוטופלאסט הם עלות גבוהה למערכות תפוקה גבוהה. ככזה, הפרוטוקול המתואר להלן יאומת באמצעות תרבות השעית BY-2, אבל זה צריך להיות amendable לכל תרבות השעית תא צמח. הוכחה של קונספט ניסויים מבוצעים באמצעות חלבון פלואורסצנטי כתום (OFP) גן כתב (pporRFP) מן Porites האלמוגים הקשה porites 31 תחת השליטה של אמרגן 35S CAMV.

<table><tbody><tr><td>Orbitor RS Microplate Mover</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bravo Liquid Handler</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Multi-mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-mode Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teleshake</td><td>Inheco</td><td>3800048</td><td></td></tr><tr><td>CPAC Ultraflat מחמם/מצנן</td><td>Inheco</td><td></td><td></td>7000190</tr><tr><td>תוכנת אוטומציה של Vworks</td> תוכנת <td>Agilent</td><td></td><td>המשמשת לבקרה וכתיבת פרוטוקולים עבור Agilent Bravo</td></tr><tr><td>Momentum Software</td><td>תוכנת תזמון משימות Thermo Scientific</td><td></td><td></td> לשליטה בבקרת Orbiter</tr><tr><td>RS Liquid Handling Control 2.17 Software</td><td>Biotek</td><td></td><td>Software המשמשת לבקרה וכתיבת פרוטוקולים עבור MultiFlo FX</td></tr><tr><td>IX81 Inverted Microscope</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>זילה 3-Tap מיקרוסקופ מצלמה</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3/TRITC סט מסנן</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Rohament CL</td><td>AB אנזימים</td><td>מדגם בקבוק</td><td>צלולאז בעלות נמוכה</td></tr><tr><td>Rohapect UF</td><td>AB אנזימים</td><td>בקבוק מדגם</td><td>בעלות נמוכה פקטינאז</td></tr><tr><td>Rohapect 10L</td><td>AB אנזימים</td><td>בקבוק מדגם</td><td>פקטינאז / ארבינאז בעלות נמוכה</td></tr><tr><td>Linsmaier & Skoog בסיסי בינוני</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>L689</td><td></td></tr><tr><td>2,4-dichlorophenoxyacetic acid</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>D295</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Poly (אתילן גליקול) 4000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95904-250G-F</td><td>לשעבר Fluka PEG</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Fisher Scientific</td><td>25535-16-4</td><td>אקרוס אורגניקס</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>מניטול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M1902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan CM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1910-250G</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>Thermo Scientific</td><td>103184</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות 1.2 מ"ל צלחת באר עמוקה</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0564</td><td></td></tr><tr><td>96 באר צלחת תחתונה אופטית</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Finntip 1000 קצות</td> <td>Pipet רחביםThermo Scientific</td><td>9405 163</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4504-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC17259-5000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr></tbody></table>

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

בעשור האחרון חלה התעוררות מחודשת השימוש פרוטופלאסט צמח נעים בין מיני מודל לחתוך מינים, לניתוח של מסלולי העברת אותות, רשתות רגולטוריות תעתיק, ביטוי גנים, הגנום עריכה-להשתקת גנים. יתר על כן, התקדמות משמעותית נעשתה ההתחדשות של צמחים מפני פרוטופלאסט, אשר יצרה עניין עוד יותר את השימוש במערכות אלה עבור הגנומיקה צמח. בעבודה זו, פרוטוקול פותח לאוטומציה של בידוד פרוטופלאסט וטרנספורמציה מתרבה השעית טבק 2 &#39;צהובה בוהק &quot;(BY-2) באמצעות פלטפורמה רובוטית. נהלי טרנספורמציה אומתו באמצעות חלבון פלואורסצנטי כתום גן כתב (OFP) (pporRFP) תחת השליטה של ​​אמרגן 35S וירוס פסיפס הכרובית (35S). ביטוי OFP ב פרוטופלאסט אושר על ידי מיקרוסקופ epifluorescence. ניתוח כלל גם שיטות יעילות הייצור פרוטופלאסט באמצעות propidiuיודיד מטר. לבסוף, אנזימי כיתת מזון בעלות נמוכה שמשו הליך בידוד פרוטופלאסט, עקיפת הצורך אנזימי מעבדת כיתה כי הם עלות אוסרני ב תפוקה גבוהה אוטומטי בידוד פרוטופלאסט וניתוח. בהתבסס על הפרוטוקול שפותח בעבודה זו, הנוהל במלואו מבידוד פרוטופלאסט לטרנספורמציה יכול להתנהל תחת 4 שעות, ללא כל קלט מהמפעיל. בעוד פרוטוקול שפותח בעבודה זו קיבלה תוקף עם תרבית תאים BY-2, נהלים ושיטות צריכה להיות לתרגום לכל ההשעיה צמח תרבות / מערכת פרוטופלאסט, מה שאמור לאפשר האצה של מחקר הגנום היבול.

במחקר הנוכחי, שיעור ההכפלה של BY-2 נע בין 14-18 שעות תלויות בטמפרטורה שבה התרבויות הודגרו, עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים של אורך מחזור התא ממוצע של 15 שעות. עם שיעור הכפלה זו, ביחס של 1: בידוד החל 100 שמש ליזום תרבויות, מה שמוביל תרבויות עם נפח תא ארוז (PCV) של 50% ב 5-7 ימים. בפרוטוקול הנוכחי, שבו תרבויות גדלו ב -200 מ&quot;ל של התקשורת, PCV של 100 מ&quot;ל נוצר ב -7 ימים, אשר סיפקה מספיק תאים כדי למלא 33 6 צלחות היטב. במונחי תשואה פרוטופלאסט, ע...

A-תפוקה גבוהה, אוטומטית, מתודולוגיה ייצור וטרנספורמציה טבק פרוטופלאסט מתוארת. המערכת הרובוטית מאפשרת ביטוי גנים מקביל מסיבי וגילוי במודל BY-2 המערכת שאמורה להיות לתרגום לגידולים שאינם מודל.

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לפתח שיטה לסריקה מהירה, אוטומטית ובעלת תפוקה גבוהה של פרוטופלסטים של צמחים, במטרה להתמודד עם צוואר הבקבוק הנוכחי בסריקה מוקדמת של מספר רב של מטרות לעריכה גנומית ולהשתקה גנטית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביוטכנולוגיה של הצמחים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ייצור והחדרה (טרנספורמציה) אוטומטית של פרוטופלסטים בתפוקה גבוהה, לצורך סריקה מקבילה ומהירה של תפקוד פרומוטורים בביטוי גנים.נוהל זה יודגם באמצעות תרבית סספנציה נפוצה של טבק מסוג bright yellow two, או BY-2. התחל בגידול של תרבית BY-2 בבקבוק ארלנמייר, כפי שמתואר בטקסט הפרוטוקול. ביום בידוד הפרוטופלסטים, ערבב את התרבית היטב כיוון שהתאים שוקעים במהירות, והעבר ששה מיליליטרים מהתרבית לתוך מבחנת צנטריפוגה בעלת תחתית קונוית בנפח 15 מיליליטר.המתינו לפחות 10 דקות עד שהתאים ישקעו. התאימו את נפח התאים הדחוס ל-50% מהנפח הכולל על ידי הסרה של נפח מתאים מהנוזל העליון (supernatant). נערו את המבחנה על ידי היפוכה, ולאחר מכן השתמשו בפיפט עם פיה רחבה (wide bore pipette) כדי להעביר 500 µL של תרחיף תאים לכל באר בלוח שש בארות לצורך עיכול.השלב הראשון בפרוצדורה זו הוא הדלקת כל רכיבי מערכת הרובוטיקה, הכוללים את מעביר המיקרופלייטים, מטפל הנוזלים, קורא הפלטות הרב-תכליתי, המפיץ הרב-תכליתי, מחמם או מצנן הפלטות, והמחשבים. לאחר מכן, פתחו את תוכנת תזמון המשימות של מעביר הפלטות, המשלבת את מעביר המיקרופלייטים עם שאר הציוד כדי לאפשר העברת פלטות בין כל יחידת ציוד. בתוכנת מעביר הפלטות, הגדירו את המפרטים הטכניים עבור כלי המעבדה המשמשים בפרוטוקול.לחצו על Setup מסרגל הכלים הראשי ובחרו בפקודה Manage Container Types. בחרו את סוג המיכל (Container Type) המתאים מתוך רשימת סוגי המכלים הקיימים. הגדירו את המפרטים הטכניים עבור כל כלי המעבדה שהזרוע המעבירה של הפלטה (plate mover) תבוא במגע איתם.השלב הבא הוא הגדרת נקודות ההתחלה והסיום עבור כל מכל. לחצו על לשונית Start/End בפרוטוקול ספציפי. בחרו את נקודת ההתחלה של כל מכל וסמנו את התיבה עבור Lidded (עם מכסה) או Unlidded (ללא מכסה) הן בנקודת ההתחלה והן בנקודת הסיום.לאחר הגדרת מיקומי ההתחלה והסיום עבור כל פריט מכלי המעבדה, טענו ידנית את כל הפלטות למיקום ההתחלה עבור כל זרימת העבודה. טענו את פלטות הסריקה הפלורסצנטיות בעלות 96 בארות ל"מלון" שתיים, את הפלטות בעלות שש בארות עם תאי BY-2 ל"מלון" שלוש, פלטת 96 בארות עמוקות (deep well) שתשמש לטרנספורמציה על גבי קן שתיים של מחמם או מצנן הפלטות, ומבחנה קונית בנפח 50 milliliter המכילה את תמיסת האנזים על גבי המפיץ הרב-מצבי. כדי לבצע טרנספורמציה בפרוטוקול, טענו מראש לכל בארה בפלטת 96 הבארות העמוקות 10 µL של פלסמיד DNA המכיל את קונסטרוקציית הדגל (reporter) של חלבון פלורסצנטי כתום, והדגרירו במחמם או במצנן הפלטות בטמפרטורה של 4 °C.טען את כל האספקות והפלטות על פלטפורמת הטיפול האוטומטי בנוזלים במיקומים המיועדים. טען פלטה בעלת 96 בארות, שכל בארה בעמודה הראשונה טעונה מראש ב-200 µL של תמיסת polyethylene glycol בריכוז 40%. טען קופסת טיפים לפיפט במקום השמינית (nest eight).כדי להגדיר את מיקומו של כל פריט בתוכנה של פלטפורמת הטיפול האוטומטי בנוזלים, בחרו ב-Tools מהתפריט ולחצו על Labware Editor. בחרו את סוג כלי המעבדה מהתפריט הנגלל. בחרו בלשונית Main Protocol ולחצו על Configure Labware כדי להגדיר את המיקום של כל פריט מבין כלי המעבדה.לחצו על Run כדי לאתחל את כל המכשירים שבהם ייעשה שימוש בפרוטוקול. לבסוף, בחלון Work Explorer, לחצו על Add Work Unit כדי לאמת את כל כלי המעבדה במערכת ולהתחיל את הפרוטוקול האוטומטי. החלק הרגיש ביותר בהליך הוא טרנספורמציית הפרוטופלסטים.מכיוון שהטרנספורמציה מבוצעת על ידי מערכת הרובוטיקה, קריטי שהפרוטוקולים האוטומטיים יוגדרו כהלכה. לצורך סרטון זה, יוצגו רק שלבים נבחרים בפרוטוקולים האוטומטיים. במהלך פרוטוקול הטרנספורמציה, פלטפורמת טיפול בנוזלים אוטומטית שואבת 70 µL של תמיסת הפרוטופלסטים מלוח ששתאים ומספקת אותה ללוח 96 בארות עמוקות בקינוח שש.לאחר מכן, משתמשים בקצות פיפטה חדשים כדי לשאוב באיטיות 70 µL של תמיסת הפוליאתילן גליקול בעלת הצמיגות הגבוהה מלוח הבארות העמוקות (deep well plate) שהוכן מראש, ומעבירים את התמימה באופן מלא לבארות הרלוונטיות בלוח הבארות העמוקות. בשלב הבא, פלטפורמת הטיפול האוטומטית בנוזלים מעבירה את לוח הבארות העמוקות מעמדה שש לעמדה תשע, שם זרוע הזזת הלוחות אוספת את הלוח ומעבירה אותו לתחנת ניעור הלוחות, שם הוא מנוער במהירות של 1500 RPM למשך 30 שניות. לאחר דגירה של 20 דקות ללא ניעור כדי לאפשר התאזנות של הפרוטופלסטים, זרוע הזזת הלוחות מעבירה את לוח 96 הבארות העמוקות למספיק הנוזלים הרב-תכליתי (multi-mode dispenser) ומפעילה את פרוטוקול השטיפה.עם השלמת הפרוטוקול האוטומטי לבידוד והטרנספורמציה של פרוטופלסטים, הוצא את הפלטה עם הפרוטופלסטים שעברו טרנספורמציה מהמלון הראשון של המערכת הרובוטית. הפעל את המיקרוסקופ ההפוך, את המצלמה ואת המנורה הפלואורסצנטית. בחר בעדשה של 10X לצורך מיקוד ראשוני של הפרוטופלסטים.הדליקו את נורת ההלוגן וסגרו את התריס של נורת הפלואורסצנציה. טענו את הפלטה למערכת המיקרוסקופ ובצעו פוקוס על הפרוטופלסטים באמצעות תאורה בשדה בהיר (brightfield). לאחר מכן, כבו את נורת ההלוגן ופתחו את התריס של נורת הפלואורסצנציה.יש לבחור את סט המסננים Cy3/TRITC לצורך ויזואליזציה של החלבון הפלואורסצנטי הכתום המובע על ידי הפרוטופלסטים הטרנסגניים. סרקו כל באער כדי לקבוע את מספר הפרוטופלסטים המבטאים את הסמן הפלואורסצנטי. עיכול אנזימטי של פרוטופלסטים בתנאים המפורטים בפרוטוקול זה הניב 2,820,000 פרוטופלסטים לכל פלטת שש באערים.בוצעו הערכות של אובדן ריכוז הפרוטופלסטים לאחר כל שלב העברה בפרוטוקול. לאחר פרוטוקול העיכול, הועברו 11,500 פרוטופלסטים לכל באער של פלטות 96-deep well. עם השלמת פרוטוקול הטרנספורמציה, הועברו 1,230 פרוטופלסטים לפלטת הסריקה הפלואורסצנטית בעלת 96 באערים.על מנת לוודא ששלבי פיפוט מרובים לא פגעו בפרוטופלסטים, נבדקה חיוניותם באמצעות צביעה ב-propidium iodide. התוצאות לא הראו הבדל משמעותי בחיוניות לאחר העיכול, לאחר ההעברה לפלטת סריקה פלואורסצנטית בעלת 96 בארות, ולאחר פרוטוקול הטרנספורמציה. פרוטוקול הטרנספורמציה הצליח לייצר תאים טרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי כתום, אם כי יעילות הטרנספורמציה הייתה נמוכה, כ-2% בלבד. זאת בשל הפלסמיד הבינרי הגדול שנעשה בו שימוש והעובדה שהפרוטוקול לא עבר אופטימיזציה ספציפית עבור פרוטופלסטים של BY-2.המדדים שהתקבלו עבור מהלך הזמן של הפרוטוקול הראו כי עיקר השקעת הזמן נעשה במהלך שלב העיכול (Digestion). משך הזמן המלא של בידוד הפרוטופלסטים והטרנספורמציה היה שלוש שעות, 50 דקות ו-53 שניות, ללא צורך בהתערבות חיצונית של המפעיל. לאחר הגדרה נכונה, טכניקה זו יכולה להתבצע על ידי הרובוט בפחות מארבע שעות.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים בתחום הביוטכנולוגיה של צמחים לביצוע הליכים גנומיים של גידולים בעוצמה גבוהה, כגון עריכה גנומית וסריקת פרומוטורים.

a-robotic-platform-for-high-throughput-protoplast-isolation

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

פוליאתילן גליקול יעיל (PEG) מתווכת טרנספורמציה של מוס Physcomitrella patens</em

כאן אנו מתארים מסך overexpression פלסמיד...

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

תפוקה גבוהה, פלטפורמה אוטומטית של פיתוח וייצור קו התא לייצור חלבונים ותרופות מתואר. יישום סדרן BD Cell Aria FACS, CloneSelect Imager וטקאן חופש מערכת EVO טיפול הנוזל הוכיחה יכולת עיבוד גדל באופן משמעותי בפיתוח קו התא עם איכות הקו השתפרה התא reproducibility גבוהה.

פלטפורמה תפוקה גבוהה אוטומטיות לפיתוח קווי ייצור עבור Cell Therapeutics חלבון

מאמר זה מתאר את השינוי הגנטי של unicellular אצה...

שינוי גנטי של Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

אנו מתארים שיטה לטיהור זיקה מתויגת-של חלבונים רקומביננטי באמצעות רובוטיקה נוזלית לטיפול. שיטה זו היא בדרך כלל ישימה לטיהור בקנה המידה הקטנה של חלבונים המתויגים המסיסים בפורמט תפוקה גבוהה.

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

. הנה, זרימת עבודה אוטומטית לבצע הרכבה "התקן" DNA מודולרי, באמצעות שיטה מודולרית DNA שיבוט הרכבה על רובוטים נוזלי-טיפול מוצג. הפרוטוקול משתמשת כלי תוכנה אינטואיטיבית ליצירת רשימות המטפל נוזלי לדור קומבינטורית DNA התקן הספרייה, אשר נדגים באמצעות שתי פלטפורמות טיפול בנוזלים.

אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

פיתחנו פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הכנת כמויות גדולות של סויה protoplasts ללמוד מנגנוני איתות ולניהולו מורכבים בתאים חיים.

שיטה פשוטה עבור בידוד של סויה Protoplasts, ליישום ניתוחים ביטוי גנים ארעית

כאן נתאר פרוטוקול כדי להביע את החלבונים לתוך protoplasts באמצעות שיטת שינוי בתיווך פג. השיטה מספקת קל ביטוי של חלבונים עניין ולאחר חקירה יעילה של חלבון לוקליזציה, תהליך הייבוא בתנאי ניסוי שונים ויוו.

לומד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט באמצעות Protoplasts

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בתפוקה גבוהה להעברה זמנית של מיליוני פרוטופלסטים של תירס לבדיקת ספריות גדולות של פלסמידים בתאי מזופיל תירס.

טרנספקציה ניתנת להרחבה של פרוטופלסטים של מזופיל תירס

אנו מתארים את השימוש בפלטפורמת ביטוי גנים מרובת תפוקה גבוהה המכמתת את ביטוי הגנים על ידי ברקוד וספירת מולקולות במצעים ביולוגיים ללא צורך בהגברה. השתמשנו בפלטפורמה כדי לכמת את ביטוי המיקרו-רנ"א (miRNA) בדם מלא בנבדקים עם ובלי תסמונת המעי הרגיז.

הפרעות של במחזור miRNAs ב תסמונת מעי רגיז זוהו באמצעות פלטפורמת ביטוי גני תפוקה הגבוהה Multiplexed

למד שיטה רובוטית לבידוד וההשנאת פרוטופלאסטים בקנה מידה גבוה ב-BY-2. שיטה זו מאפשרת סינון מקבילי מהיר של פונקציית מקדמים בביטוי גנים בצמחים.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

גלה סרטונים נוספים