פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לפתח שיטה לסריקה מהירה, אוטומטית ובעלת תפוקה גבוהה של פרוטופלסטים של צמחים, במטרה להתמודד עם צוואר הבקבוק הנוכחי בסריקה מוקדמת של מספר רב של מטרות לעריכה גנומית ולהשתקה גנטית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביוטכנולוגיה של הצמחים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ייצור והחדרה (טרנספורמציה) אוטומטית של פרוטופלסטים בתפוקה גבוהה, לצורך סריקה מקבילה ומהירה של תפקוד פרומוטורים בביטוי גנים.

נוהל זה יודגם באמצעות תרבית סספנציה נפוצה של טבק מסוג bright yellow two, או BY-2. התחל בגידול של תרבית BY-2 בבקבוק ארלנמייר, כפי שמתואר בטקסט הפרוטוקול. ביום בידוד הפרוטופלסטים, ערבב את התרבית היטב כיוון שהתאים שוקעים במהירות, והעבר ששה מיליליטרים מהתרבית לתוך מבחנת צנטריפוגה בעלת תחתית קונוית בנפח 15 מיליליטר.

המתינו לפחות 10 דקות עד שהתאים ישקעו. התאימו את נפח התאים הדחוס ל-50% מהנפח הכולל על ידי הסרה של נפח מתאים מהנוזל העליון (supernatant). נערו את המבחנה על ידי היפוכה, ולאחר מכן השתמשו בפיפט עם פיה רחבה (wide bore pipette) כדי להעביר 500 µL של תרחיף תאים לכל באר בלוח שש בארות לצורך עיכול.

השלב הראשון בפרוצדורה זו הוא הדלקת כל רכיבי מערכת הרובוטיקה, הכוללים את מעביר המיקרופלייטים, מטפל הנוזלים, קורא הפלטות הרב-תכליתי, המפיץ הרב-תכליתי, מחמם או מצנן הפלטות, והמחשבים. לאחר מכן, פתחו את תוכנת תזמון המשימות של מעביר הפלטות, המשלבת את מעביר המיקרופלייטים עם שאר הציוד כדי לאפשר העברת פלטות בין כל יחידת ציוד. בתוכנת מעביר הפלטות, הגדירו את המפרטים הטכניים עבור כלי המעבדה המשמשים בפרוטוקול.

לחצו על Setup מסרגל הכלים הראשי ובחרו בפקודה Manage Container Types. בחרו את סוג המיכל (Container Type) המתאים מתוך רשימת סוגי המכלים הקיימים. הגדירו את המפרטים הטכניים עבור כל כלי המעבדה שהזרוע המעבירה של הפלטה (plate mover) תבוא במגע איתם.

השלב הבא הוא הגדרת נקודות ההתחלה והסיום עבור כל מכל. לחצו על לשונית Start/End בפרוטוקול ספציפי. בחרו את נקודת ההתחלה של כל מכל וסמנו את התיבה עבור Lidded (עם מכסה) או Unlidded (ללא מכסה) הן בנקודת ההתחלה והן בנקודת הסיום.

לאחר הגדרת מיקומי ההתחלה והסיום עבור כל פריט מכלי המעבדה, טענו ידנית את כל הפלטות למיקום ההתחלה עבור כל זרימת העבודה. טענו את פלטות הסריקה הפלורסצנטיות בעלות 96 בארות ל"מלון" שתיים, את הפלטות בעלות שש בארות עם תאי BY-2 ל"מלון" שלוש, פלטת 96 בארות עמוקות (deep well) שתשמש לטרנספורמציה על גבי קן שתיים של מחמם או מצנן הפלטות, ומבחנה קונית בנפח 50 milliliter המכילה את תמיסת האנזים על גבי המפיץ הרב-מצבי. כדי לבצע טרנספורמציה בפרוטוקול, טענו מראש לכל בארה בפלטת 96 הבארות העמוקות 10 µL של פלסמיד DNA המכיל את קונסטרוקציית הדגל (reporter) של חלבון פלורסצנטי כתום, והדגרירו במחמם או במצנן הפלטות בטמפרטורה של 4 °C.

טען את כל האספקות והפלטות על פלטפורמת הטיפול האוטומטי בנוזלים במיקומים המיועדים. טען פלטה בעלת 96 בארות, שכל בארה בעמודה הראשונה טעונה מראש ב-200 µL של תמיסת polyethylene glycol בריכוז 40%. טען קופסת טיפים לפיפט במקום השמינית (nest eight).

כדי להגדיר את מיקומו של כל פריט בתוכנה של פלטפורמת הטיפול האוטומטי בנוזלים, בחרו ב-Tools מהתפריט ולחצו על Labware Editor. בחרו את סוג כלי המעבדה מהתפריט הנגלל. בחרו בלשונית Main Protocol ולחצו על Configure Labware כדי להגדיר את המיקום של כל פריט מבין כלי המעבדה.

לחצו על Run כדי לאתחל את כל המכשירים שבהם ייעשה שימוש בפרוטוקול. לבסוף, בחלון Work Explorer, לחצו על Add Work Unit כדי לאמת את כל כלי המעבדה במערכת ולהתחיל את הפרוטוקול האוטומטי. החלק הרגיש ביותר בהליך הוא טרנספורמציית הפרוטופלסטים.

מכיוון שהטרנספורמציה מבוצעת על ידי מערכת הרובוטיקה, קריטי שהפרוטוקולים האוטומטיים יוגדרו כהלכה. לצורך סרטון זה, יוצגו רק שלבים נבחרים בפרוטוקולים האוטומטיים. במהלך פרוטוקול הטרנספורמציה, פלטפורמת טיפול בנוזלים אוטומטית שואבת 70 µL של תמיסת הפרוטופלסטים מלוח ששתאים ומספקת אותה ללוח 96 בארות עמוקות בקינוח שש.

לאחר מכן, משתמשים בקצות פיפטה חדשים כדי לשאוב באיטיות 70 µL של תמיסת הפוליאתילן גליקול בעלת הצמיגות הגבוהה מלוח הבארות העמוקות (deep well plate) שהוכן מראש, ומעבירים את התמימה באופן מלא לבארות הרלוונטיות בלוח הבארות העמוקות. בשלב הבא, פלטפורמת הטיפול האוטומטית בנוזלים מעבירה את לוח הבארות העמוקות מעמדה שש לעמדה תשע, שם זרוע הזזת הלוחות אוספת את הלוח ומעבירה אותו לתחנת ניעור הלוחות, שם הוא מנוער במהירות של 1500 RPM למשך 30 שניות. לאחר דגירה של 20 דקות ללא ניעור כדי לאפשר התאזנות של הפרוטופלסטים, זרוע הזזת הלוחות מעבירה את לוח 96 הבארות העמוקות למספיק הנוזלים הרב-תכליתי (multi-mode dispenser) ומפעילה את פרוטוקול השטיפה.

עם השלמת הפרוטוקול האוטומטי לבידוד והטרנספורמציה של פרוטופלסטים, הוצא את הפלטה עם הפרוטופלסטים שעברו טרנספורמציה מהמלון הראשון של המערכת הרובוטית. הפעל את המיקרוסקופ ההפוך, את המצלמה ואת המנורה הפלואורסצנטית. בחר בעדשה של 10X לצורך מיקוד ראשוני של הפרוטופלסטים.

הדליקו את נורת ההלוגן וסגרו את התריס של נורת הפלואורסצנציה. טענו את הפלטה למערכת המיקרוסקופ ובצעו פוקוס על הפרוטופלסטים באמצעות תאורה בשדה בהיר (brightfield). לאחר מכן, כבו את נורת ההלוגן ופתחו את התריס של נורת הפלואורסצנציה.

יש לבחור את סט המסננים Cy3/TRITC לצורך ויזואליזציה של החלבון הפלואורסצנטי הכתום המובע על ידי הפרוטופלסטים הטרנסגניים. סרקו כל באער כדי לקבוע את מספר הפרוטופלסטים המבטאים את הסמן הפלואורסצנטי. עיכול אנזימטי של פרוטופלסטים בתנאים המפורטים בפרוטוקול זה הניב 2,820,000 פרוטופלסטים לכל פלטת שש באערים.

בוצעו הערכות של אובדן ריכוז הפרוטופלסטים לאחר כל שלב העברה בפרוטוקול. לאחר פרוטוקול העיכול, הועברו 11,500 פרוטופלסטים לכל באער של פלטות 96-deep well. עם השלמת פרוטוקול הטרנספורמציה, הועברו 1,230 פרוטופלסטים לפלטת הסריקה הפלואורסצנטית בעלת 96 באערים.

על מנת לוודא ששלבי פיפוט מרובים לא פגעו בפרוטופלסטים, נבדקה חיוניותם באמצעות צביעה ב-propidium iodide. התוצאות לא הראו הבדל משמעותי בחיוניות לאחר העיכול, לאחר ההעברה לפלטת סריקה פלואורסצנטית בעלת 96 בארות, ולאחר פרוטוקול הטרנספורמציה. פרוטוקול הטרנספורמציה הצליח לייצר תאים טרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי כתום, אם כי יעילות הטרנספורמציה הייתה נמוכה, כ-2% בלבד. זאת בשל הפלסמיד הבינרי הגדול שנעשה בו שימוש והעובדה שהפרוטוקול לא עבר אופטימיזציה ספציפית עבור פרוטופלסטים של BY-2.

המדדים שהתקבלו עבור מהלך הזמן של הפרוטוקול הראו כי עיקר השקעת הזמן נעשה במהלך שלב העיכול (Digestion). משך הזמן המלא של בידוד הפרוטופלסטים והטרנספורמציה היה שלוש שעות, 50 דקות ו-53 שניות, ללא צורך בהתערבות חיצונית של המפעיל. לאחר הגדרה נכונה, טכניקה זו יכולה להתבצע על ידי הרובוט בפחות מארבע שעות.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים בתחום הביוטכנולוגיה של צמחים לביצוע הליכים גנומיים של גידולים בעוצמה גבוהה, כגון עריכה גנומית וסריקת פרומוטורים.