הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות בנפח תאים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי עמוק בתוך לבבות שלמים, לחקור את תפקוד הגנים ברזולוציה של תא בודד במהלך התפתחות הלב ובלבבות לאחר הלידה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במהלך התפתחות הלב, כגון חקר תפקודי הגנים ועזרה בתמונה ברזולוציה של תא בודד במהלך התפתחות הלב וחפצי אנימידל. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא פשוטה יחסית, זולה ופרו-חכמה בכך שהיא מבצעת ניתוח זמני מיוחד של תפקודי הגן והחלבון ברזולוציה של תא בודד בעובר או בלב שלמים.

אף על פי שאנו משתמשים במערכת הזו כדי לחקור את התפתחות הלב בעכברים, אתם יכולים להשתמש בה גם כדי לחקור מערכות איברים אחרות, כמו למשל שרירים, מוח וריאות, וגם באורגניזמים מודלים אחרים. כאן משתמשים בעוברים חיוביים לחלבון פלואורסצנטי מסכרי קונפטי R-26 Cre-RET2 שטופלו בטמוקסיפרן . התחל לצבוע על ידי טבילת כל עובר קבוע בפרפורמלדהיד במיליליטר אחד של 0.1% PBST בבארות של צלחת 48 בארות.

דגירה במשך שעתיים על שייקר צלחת בטמפרטורת החדר כדי לחלחל את הרקמה. לאחר מכן, החלף את תמיסת החדירות במ"ל אחד של חיץ חוסם ודגר, בניעור, למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו דילול של 1 עד 100 של הנוגדן הספציפי לתאי האנדותל, PECAM, ב-0.3 מיליליטר של חיץ חוסם לכל באר והוסיפו אותו לבארות המכילות את העוברים.

דגירה במשך 48 שעות עם טלטול בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, שטפו את העוברים חמש פעמים עם PBST למשך 30 דקות בכל פעם כדי להסיר עודפי נוגדנים ראשוניים מהרקמה. לאחר מכן, טבלו את העוברים בתמיסת נוגדנים משנית של Alexa Fluor 647 ודגרו עם טלטול במשך 48 שעות בארבע מעלות צלזיוס, כשהם מוגנים מפני אור.

48 שעות לאחר מכן, לאחר שטיפה לפני, לאחר תיקון העוברים עם 4% PFA למשך שעה בטמפרטורת החדר עם ניעור. לאחר מכן, לאחר שטיפה פעמיים עם PBS במשך חמש דקות בכל פעם, דגרו על העוברים עם כתם גרעיני DAPI למשך עשר דקות. לאחר מכן יש לבצע שתי שטיפות PBS של חמש דקות כל אחת, ולאחר מכן להמשיך לניקוי רקמות.

ניקוי הרקמות הוא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה על מנת לדמות את הלב ברזולוציה של תא בודד. כמו כן, הבחירה בשיטת הקלירינג בקנה מידה או CUBIC, חשובה מאוד גם על מנת לשמר אותות פלואורסצנטיים בלב העוברי השלם. מעבירים את העוברים השטופים והמוכתמים לבקבוקון נצנוץ עטוף בנייר אלומיניום, המכיל מיליליטר אחד של תמיסת אבנית A2.

דגירה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עם ניעור עדין מדי פעם ביד למשך 48 שעות. לאחר הדגירה של אבנית A2, יש להחליף את התמיסה בבקבוקון במיליליטר אחד של תמיסת סולם B4, ולדגור בארבע מעלות צלזיוס עם ניעור עדין מדי פעם למשך 48 שעות נוספות. דגרו על העוברים למשך 48 שעות נוספות עם מיליליטר אחד בקנה מידה 70 בארבע מעלות צלזיוס עם טלטול עדין מדי פעם כמו קודם.

לבסוף, טבלו את הדגימה הנקייה במיליליטר אחד של 90% גליצרול ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס עד להדמיה. כדי לצלם, העבירו את הדגימה לצלחת פטרי עם תחתית זכוכית עם כמות מינימלית של 90% גליצרול ותמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בשתי יכולות פוטון. לניקוי CUBIC יש לטבול כל עובר במיליליטר אחד של CUBIC אחד עם ניעור עדין מדי פעם למשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר 48 שעות, החלף את התמיסה באותו נפח של מגיב CUBIC טרי אחד ודגר את הדגימה למשך 48 שעות נוספות, כמו קודם. לאחר הדגירה, שטפו את העוברים שטופלו ב-CUBIC אחד עם PBS מספר פעמים בניעור עדין ביד כדי להסיר את תמיסת ה-CUBIC One העודפת. לאחר מכן, טבלו את העוברים בתמיסת CUBIC 2 למשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין מדי פעם ביד.

אם יהיה עיכוב לפני ההדמיה, דגרו ברצף את הדגימות עם מיליליטר אחד של 30%50% ו-70% גליצרול ו-PBS למשך 30 דקות כל אחת. לאחר המעבר בסדרה, העבירו לתמיסת גליצרול 90% לאחסון בארבע מעלות צלזיוס. כשהוא מוכן, צלם בצלחת פטרי עם תחתית זכוכית עם 90% גליצרול, כמו קודם.

סרטון זה מציג קטעים אופטיים של לב E 8.75 שטופל בקנה מידה, משטח הלב ועד לומן. צהוב מסמן את ביטוי PECAM וכל הקרדיומיוציטים מופיעים בירוק. העומק הוא 110.4 מיקרון ויש 93 פרוסות בסך הכל.

זוהי תמונת פני השטח התלת-ממדית של הלב המשוחזר שהוצגה זה עתה. שוב, צהוב מסמן ביטוי PECAM, וירוק מסמן את כל הקרדיומיוציטים. סרטון זה מציג קטעים של שיבוט אב יחיד מלב E 9.5 שטופל בקנה מידה באזור דרכי הזרימה.

צהוב מסמן את ביטוי PECAM והשיבוט מופיע בירוק. העומק הוא 36 מיקרון ויש 10 פרוסות בסך הכל. סרט זה מציג קטעים של P שטופל ב-CUBIC שני לבבות מפני השטח ללומן.

העומק הוא 130 מיקרון עם שלושה מיקרון לקטע. סרט זה מציג חלקים של לב E 17.5 שטופל ב-CUBIC מפני השטח ועד הלומן. העומק הוא 630 מיקרון עם שישה מיקרון לקטע.

זוהי תמונת פני שטח תלת-ממדית של הלב שהוצגה זה עתה, ושוחזרה באמצעות תוכנת השחזור התלת-ממדית. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור שהעובר שביר ופתולוגיה של הלב יכולה להיות מופרעת בקלות. בעקבות הליך זה, ניתן לממש חלבון אחר, באמצעות צביעה כדי לחקור את תפקוד הגן לאחר הניתוח והקצף.