Name: הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: למדו הדמיה וולומטרית של תאים מסומנים בחלבון פלואורסצנטי בלבבות עובריים ולאחר לידה ברזולוציית תא בודד. השיטה משלבת ניקוי רקמות וצביעה שלמות לניתוח פונקציות גנים בפיתוח לבבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מעבדת M.W. על הדיון המדעי. עבודה זו נתמכת על ידי AHA [13SDG16920099] ל-M.W., ועל ידי מענקי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם [R01HL121700] ל-M.W. תמונות צולמו במתקן ליבת ההדמיה במכללה הרפואית של אולבני.

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) Albany Medical College וביצע בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. 1. הכנות פתרון הערה: 15 Rosa26Cre ERT2, R26R-קונפטי 16, αMHC-Cre 17, ו Rosa26-mTmG (mTmG) 20 קווי עכבר נרכשו מסחרית cTnT-Cre 18 היה מתנה ד&quot;ר ג&#39;יאו באוניברסיטת אלבמה Nfatc1-Cre.. היה מתנה ד&quot;ר בן ג&#39;ואו בבית אלברט איינשטיין קולג &#39;לרפואה 19. עכברים היו מורדמים משאיפת פחמן דו חמצני בתא סגור במשך 60 שניות לפחות ואחריו באמצעים פיזיים של אימות למוות על ידי פתיחת בית החזה בין שתי המדינות, עריפת ראש או נקע בצוואר הרחם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן טמוקסיפן. ממיסים 10 מ&quot;ג טמוקסיפן ב 10 מ&quot;ל של אוי זרעי חמניותl. ברגע שזה נמס לגמרי, aliquot ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פוספט בופר (PBS). ממיסים 4 Na 2 HPO (1.41960 גרם), KH 2 PO 4 (0.24496 גרם), NaCl (8.0669 גרם) ו KCl (0.20129 גרם) ב 1 ליטר של מים מזוקקים ולהתאים את ה- pH ל -7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PBST: 0.1% פתרון Tween-20 ב PBS על ידי המסת 100 μl של Tween-20 ב 100 מ&quot;ל של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן חיץ חסימה. הפוך אלבומין 3% שור (BSA) פתרון חסימת ידי המסת 3 גרם של BSA ב 100 מ&quot;ל של PBST המכיל 0.2% Tween-20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן-1 מעוקב (מגיב 1). מערבבים 25% WT אוריאה, 25% WT N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethylenediamine ו -15% WT טריטון X-100 ב DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן-2 מעוקבים (מגיב 2). מערבבים 50% WT סוכרוז, 25% WT אוריאה, 10% WT 2, 2 &#39;, 2&#39; &#39;- nitrilotriethanol ו -0.1% (v / v) טריטון X-100 ב DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Sca le A2: 4 אוריאה M, 10% w / גליצרול נ ו -0.1% w / v טריטון X-100 ב DH 2 O. התאם את ה- pH ל -7.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן B4 Sca le: 8 אוריאה ז ו -0.1% w / v טריטון X-100 ב DH 2 O. התאם את ה- pH ל -8.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Sca le 70: 4 אוריאה M, 70% w / גליצרול נ ו -0.1% w / v טריטון X-100 ב DH 2 O. </li></ol> 2. טמוקסיפן אינדוקציה, בידוד העובר קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמוקסיפן אינדוקציה בידוד העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פרוטוקול שאושר על צינורית הזנה מעוקלת (ACUP 13-12,007), gavage עכברי R26Cre ERT2 קונפטי הנקבה (פקוק על ידי עכברי זכרי R26Cre ERT2) עם 10 מיקרוגרם / g של טמוקסיפן ביום התפתחות עוברי E7.75 33. ביום העוברי 9.5 (E9.5) או E10.5, להרדים את העכברות עם CO 2 ו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר וידוא הריגה העכבר (ראה סעיף 1 הערה), לפתוח את חלל הבטן העכבר עם מספריים לנתח את קרן הרחם, להסיר את שכבות צינור הרחם בעזרת מספריים פינצטה, מחדשלחכור את העוברים מן 23,24 צינור הרחם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העוברים על צלחת פטרי המכילה PBS (pH 7.4). תחת המיקרוסקופ לנתח, להסיר את השכבות הלא-עובריים (סיסית, שק החלמון ואת amnion) בעזרת פינצטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פינצטה ומספריים, לאסוף את הזנב העכבר העובר נקבה דגימות עבור genotyping כפי שדווח בעבר 22. בעזרת פיפטה פלסטיק, להעביר את כל העובר אל באר צלחת 48 היטב המכיל 1 מ&quot;ל של 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לזהות את ה- GFP / RFP / עובר חיוב CFP באמצעות מיקרוסקופ הפוכה עם מצלמה. קלף את קרום הלב באמצעות פינצטה לסובב את העובר בלב / בעזרת פינצטה מעוקלת כדי לקבוע את מספר שיבוטי ניאון משני צידי הלב עם מסנני GFP / RFP / CFP. שום חתכים נדרשים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זיהוי GFP / RFP / עובר חיוב CFP, ובמהירות לשטוף את העוברים פעמים (2 דקות כל אחד) עם PBS 1x ב הדואר 48 היטב צלחת על שייקר צלחת בטמפרטורת החדר (RT). פעולה זו תסיר דם עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן בלב העובר / העוברי באמצעות paraformaldehyde 4% (PFA) ב RT. השעה קיבעון תלוי בגודל גיל רקמה עוברית. לקבלת E9.5 לתקן את העובר עבור שעה 2 ב RT. עובר בשלב העוברי מאוחר דורש זמן קיבעון יותר, אשר יכול גם להיות ממושך עד 24 שעות עבור לב לאחר לידה. זהירות: Paraformaldehyde רעיל, להימנע ממגע עם עור, עיני קרום רירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, לשטוף את העובר / לב ב -48 ההצלחה היטב פעמים (10 דקות כל אחד) עם PBS 1x על שייקר צלחת ב RT. פעולה זו מסירה את PFA עודף מעובר / הלב. עובר אז הם עיבוד נוסף עבור מכתים הר שלם וסליקת רקמות. </li></ol> 3. הר שלם מכתים הערה: לאחר קיבוע PFA העובר / הלב נתונה הר שלם מכתים כדלקמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize העובר / הלב בצלחת היטב 48 באמצעות 1 מ &#39;l של PBST 0.1% עבור 2 שעות על שייקר צלחת ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות permeabilization, לטבול את העובר / לב ב 1 מ&quot;ל של חיץ חסימת עבור 2 שעות או למשך הלילה על שייקר צלחת ב 4 ºC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את העובר / הלב אל PECAM נוגדנים ספציפיים תא האנדותל (CD31), מדולל (1: 100) ב 0.3 מ&quot;ל חסימת חיץ במשך 48 שעות על צלחת שייקר ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העובר / הלב באמצעות PBST 5 פעמים, 30 דקות כל אחד ב RT על שייקר צלחת. פעולה זו מסירה את הנוגדן הראשוני כבול הלא ספציפית עודף מן הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את העובר / לב אלקסה פלואוריד 647 נוגדנים משני אנטי עכברוש עיזים, מדולל (1: 1,000) ב 1 מ&quot;ל חיץ חסימת במשך 48 שעות על צלחת שייקר ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.4 לשטוף את הנוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן את העובר / הלב עם 4% PFA עבור שעה 1 ב RT על שייקר צלחת ולשטוף פעמיים עם דק PBS 5 כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם העובר / לב עם גרעיני כתם 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (מדולל PBST בכל concentמנה של 0.01 מ&quot;ג / מ&quot;ל) במשך 10 דקות על שייקר צלחת ב RT. עקוב עם שני שוטף PBS 5 דקות כל אחד. </li></ol> 4. עובר / ניקוי לב עם Sca l e או שיטה מעוקבת הערה: לאחר מכתים הר שלם, העובר / לב נתונה גם את Sca le או שיטת סליקת רקמות מעוקבת. בחירת השיטה תלוי בגודל הרקמה וגיל עוברי. עבור E11.5 או קודם לכן עוברים גיל, שימוש Sca שיטת הסליקה l e רקמות, בעוד עוברי מבוגרים או לבבות לאחר הלידה שיטת הסליקה רקמות מעוקב הוא העדיף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות סולם שיטת הסליקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה העובר / לב עם 1 מ&quot;ל של תמיסת A2 דואר Sca l בבקבוקון נצנץ (עטוף בנייר כסף) עם רעד עדין מדי פעם (ביד) במשך 48 שעות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר Sca הדגירה l e A2, דגירה העובר / לב עם 1 מ&quot;ל של תמיסת B4 דואר Sca l ב 4 ° C באותו בקבוקון עם רעד עדין מדי פעם עבור anot48 השעות שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה העובר / הלב במשך 48 אחר שעה עם e 1 מ&quot;ל Sca l 70 ב 4 ° C עם רעד עדין מדי פעם. העובר הר באמצעות גליצרול 90% (ראה סעיף 5.1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות מעוקב שיטת הסליקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסליקה מעוקב עובר / בלב שלם, לטבול כל עובר / לב ב 1 מיליליטר של מעוקב-1 עם רעד עדין מדי פעם במשך 48 שעות ב 37 ºC 7. לאחר 48 שעות, להחליף את פתרון עם נפח זהה של מגיב מעוקב טרי 1, ו דגירה המדגם עבור 48 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס עם רעד מדי פעם עם היד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העובר בלב / מטופלים מעוקב-1 עם זמני 1x PBS כמה בטמפרטורת החדר עם רעד עדין עם היד. פעולה זו מסירה את הפתרון מעוקב-1 עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה החוצה מעוקב-1 עם PBS, לטבול את העוברים / לבבות בתמיסה מעוקבת-2 (1 גרם לכל עובר / לב) למשך 48 שעות ב 37 ºC עם רעד עדין מדי פעם עם יד. זאת בעקבות עובר / לב גובר באמצעות גליצרול (ראה סעיף 5.2). </li></ol></li></ol> שמה והדמיה לדוגמא 5. הערה: עוברים או איברים שנסלקו Sca l e 70 או מעוקב-2 פתרון ניתן הדמיה ישירות עם סולם 70 ו מעוקב-2 פתרון כמדיום הדמיה, בהתאמה. עם זאת, בהתחשב בפגיעות של דגימות עובריות ריאגנטים סליקה, אם הדגימות הן לא להיות צלמו מייד, אבל מאוחסנות לטווח ארוך, לאחסן דגימות גליצרול 90% בעקבות הפרוטוקול להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישירות לטבול את Sca le פינה מדגם ב 1 מ&quot;ל של גליצרול ולאחסן 90% ב 4 ° C עד הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם מעוקב שטופלו 1x PBS פעמיים, 5 דקות כל אחד ברצף דגירה המדגם עם 1 מ&quot;ל של 30%, 50%, 70% ו פתרון גליצרול 90% כל אחת למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה, להעביר את המדגם כדי צלחת תחתית זכוכית פטרי עם כמות מינימלית של שיבוטים גליצרול ותמונה 90% עם מיקרוסקופ confocal מצויד בשתי יכולות פוטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה בלב או העובר גליצרול עם 10X / 0.3 NA, טבילה 25x / 0.8 NA, או עדשה אובייקטיבי מתקנת מים 40X / 1.2 NA. תמונה DAPI באמצעות עירור 2-פוטון מתוך טיטניום קוהרנטית: לייזר זיקית ספיר. הבחירה של המיקרוסקופ עדשה אובייקטיבית תהיה תלויה לצורך הניסויים, למשל עבור סופר-רזולוציה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי אור גיליון יכול להיות מנוצל. </li></ol>

<ol><li>Vincent, S. D., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+heart%3A+the+origin+and+regulation+of+cardiac+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells.</a> Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).</li>
<li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+discoveries+in+cardiac+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A decade of discoveries in cardiac biology.</a> Nat Med. 10, 467-474 (2004).</li>
<li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+in+the+evolution+and+development+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart.</a> Science. 313, 1922-1927 (2006).</li>
<li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedding+embryos+for+high-resolution+episcopic+microscopy+%28HREM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM).</a> Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).</li>
<li>Soufan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+gene+expression+patterns+during+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development.</a> Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916(2012).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noninvasive+genetic%2Fpharmacologic+strategy+for+visualizing+cell+morphology+and+clonal+relationships+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse.</a> J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Agah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+recombination+in+postmitotic+cells.+Targeted+expression+of+Cre+recombinase+provokes+cardiac-restricted%2C+site-specific+rearrangement+in+adult+ventricular+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo.</a> J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).</li>
<li>Jiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+of+Bmp4+in+the+atrioventricular+septation+of+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart.</a> Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151, 1083-1096 (2012).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+spindle+orientation+controls+cell+entry+into+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium.</a> Dev Cell. 19, 114-125 (2010).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+family+proteins+are+essential+for+cardiac+morphogenesis+and+progenitor+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation.</a> Development. 141, 281-295 (2014).</li>
<li>Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+atlas+of+mouse+development%22">The atlas of mouse development</a>. , Academic Press. London. (1992).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo+%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).</li>
<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).</li>
<li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anterior+heart-forming+field%3A+voyage+to+the+arterial+pole+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart.</a> Trends Genet. 18, 210-216 (2002).</li>
<li>Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+right+ventricle%2C+outflow+tract%2C+and+ventricular+septum+comprise+a+restricted+expression+domain+within+the+secondary%2Fanterior+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field.</a> Dev Biol. 287, 134-145 (2005).</li>
<li>Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+the+secondary+heart+field+leads+to+tetralogy+of+Fallot+and+pulmonary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia.</a> Dev Biol. 284, 72-83 (2005).</li>
<li>Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis-acting+regulatory+sequences+governing+Wnt-1+expression+in+the+developing+mouse+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS.</a> Development. 120, 2213-2224 (1994).</li>
<li>Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+the+mammalian+cardiac+neural%5BTitle%5D)+AND+%22Developement%22%5BJournal%5D)">Fate of the mammalian cardiac neural.</a> Developement. 127, 1607-1616 (2000).</li>
<li>Viragh, S., Challice, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+epicardium+and+the+embryonic+myocardial+circulation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse.</a> Anat Rec. 201, 157-168 (1981).</li>
<li>Wu, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+family+proteins%3A+novel+players+in+cardiac+morphogenesis+and+cardiac+progenitor+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+concepts%22%5BJournal%5D)">Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation.</a> Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Lineage+Tracing+Reveals+that+Oriented+Cell+Division+Contributes+to+Trabecular+Morphogenesis+and+Regional+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification.</a> Cell reports. 15, 158-170 (2016).</li>
<li>Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+on+thermal-+and+chemical-induced+denaturation+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).</li>
<li>Captur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+myocardial+trabeculae+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo.</a> J Anat. , (2016).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הבידוד העובר הוא צעד מאוד קריטי. עובר E9.5 הם שבירים מאוד קטנים בגודלם, כך משנת זהירות יש לנקוט לא לפגוע מבנים עוברים / לב במהלך בידוד. שני הרבדים הנוספים שאינם עובריים העוטף את העובר / הלב צריך להסיר בזהירות במיוחד כאשר הדמיה העובר כולו. זה מאפשר חדירת תערובת נוגדנים וסליקה עמוקה בתוך הרקמות העובריות, וגם עוזר בהסרת אות הרקע כאשר הדמיה. נוגדנים מרובים כולל נוגדנים נגד PECAM, טובולין-α acetylated ו β1 integrin נבדקו וכל אותרו בהצלחה (מידע לא מוצג) 33. מכך ניתן להסיק כי ...

המורפוגנזה לב היא אירוע רציף הדורש ארגון spatiotemporal של ארבעה סוגים שונים של ובתאים לב למגזרים ברורים של הלב, וגם דורשת רשתות רגולטוריות גנטיות מרובות לתזמר את התהליך הזה כדי ליצור את 1,2 הלב הפונקציונלי. מפרט, בידול, דפוסי לב, והתבגרות קאמרית מוסדרים 3 גורמי שעתוק קרדיוגני. מוטציה גנטית או סטיית posttranscriptional של גורמים אלה ובתאי לב יכולה לגרום גם קטלני עובריים או מומי לב מולדים (CHD) 4. המחקר של המורפוגנזה לב דורש הבנה של פרטים מבניים טמונים בשלושה ממדים (3D) ואת שושלת תא אב לב יחידה שכותרתו התחקות במהלך התפתחות לב יקדם את ההבנה של המורפוגנזה לב. מספר שיטות טומוגרפיה מבוסס סעיף ברזולוציה גבוהה פותחו הדואר האחרונים עשרות שנים מבנה האיבר תמונה 5,6; עם זאת, שיטות אלו דורשות מכשירים יקרים, מיוחדים, עבודה רבה, ועל חוסר ארגון מבני מפורט ברזולוצית תא בודדת בתוך הנפח הסופי משוחזר תמונה 7,8. הדמית נפח 3D ברמת התא הבודדה מספקת אמצעי ללמוד התמיינות תאים ובתאים והתנהגות הסלולר in vivo 7. עם זאת, פיזור אור הרקמות נשאר המכשול העיקרי הדמית תאים ומבני 3D עמוק בתוך הלב ללא פגע. ליפידים הם מקור עיקרי של פיזור אור, והסרת שומנים ו / או התאמה של ההבדל מקדם השבירה בין שומנים בסביבותיה שלהם גישות פוטנציאל להגדלת רקמת שקיפות 8. בשנים האחרונות, מספר שיטות סליקה רקמות פותחו, המקטינים אטימות רקמות פיזור אור, כמו באב (בנזיל אלכוהול ו benzoat בנזילתערובת ה) ו- DBE (tetrahydrofuran ו dibenzylether); אבל בשיטות האלה, מרווה הקרינה נשארת בעיה 8-10. הממס מבוסס שיטות הידרופילי, כגון SeeDB (פרוקטוז / thioglycerol) ו 3DISCO (dichloromethane / dibenzylether), לשמר אותות ניאון, אבל לא להפוך כל האיבר 7,8,11 שקוף. לשם השוואה, שיטת רקמות סליקת CLARITY הופכת את האיבר שקוף, אבל זה דורש מכשיר אלקטרופורזה מיוחד כדי להסיר שומנים 8,12, כפי שעושה PACT (טכניקת בהירות פסיבית), אשר גם דורשת הידרוג&#39;ל הטבעת 7,13. לקבלת מידע מפורט לגבי כל שיטות ניקוי הרקמות הזמינות, עיין בטבלת 1 ב ריצ&#39;רדסון ליכטמן, et al. 7. בשנת 2011, חאמה et al. גילה serendipitously תערובת הידרופילי &#39;Sca le&#39; (אוריאה, גליצרול טריטון תערובת X-100) אשר משבש את המוח העכבר transpar העובראף אוזן גרון תוך שמירת פלורסנט אותות לחלוטין שיבוטים שכותרתו 14. זה מאפשר הדמיה של המוח ללא פגע בעומק של כמה מילימטרים ושחזור בקנה מידה גדול של אוכלוסיות נוירונים ותחזיות ברזולוציה subcellular. Susaki et al. נוספים שיפרו Sca le ידי הוספת aminoalcohols ופיתח את &#39;מעוקב&#39; (ברור, קוקטיילים הדמיה מוחית בלא הפרעה וניתוח חישובית) שיטת הסליקה רקמות, שהגדילה solubilization פוספוליפידים, זמן סליקה מופחת, ואיפשר פלורסנט ססגוניות הדמיה 8. במחקר הנוכחי, מנצל את Sca le וטכניקות סליקת רקמות מעוקבות חתך אופטי 3D ברזולוציה גבוהה, שיבוטי פרט בתוך הלב במהלך cardiogenesis אותר באמצעות Rosa26Cre ERT2 15, R26R-קונפטי 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, </strong&gt; Nfatc1-Cre 19, ו Rosa26-mTmG (mTmG) 20 קווי עכבר. השילוב של מכתים הר השלם (WMS) השיטה שפותח בעבר 21,22 עם שיטות סליקת רקמות מותרות נוסף עבור המכתים של חלבונים אחרים שיבוטי שכותרתו לחקר התנהגותם בהקשר נפח 3D. השילוב של סליקת רקמות WMS מאפשר הבנה טובה יותר של התפקידים של גנים וחלבונים שונים במהלך התפתחות של לב, ואת האטיולוגיה של מומי לב מולדים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם ללמוד התמיינות תאים ובתאים אחרות, התנהגות הסלולר, ואירועי morphogenesis האיבר במהלך פיתוח.

<table><tbody><tr><td>2,2&פריים;,2&פריים; '-ניטרילוטריאתנול&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד ב-PBS</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BP16000</tr><tr><td>N,N,N',N'-טטראקיס(2-הידרוקסיפרופיל) אתילנדיאמין&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פוספט מלח</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>סיגמא אולדריץ</td>' <td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>U-1250</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא אולדריץ</td>' <td>84097</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא אולדריץ</td>' <td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>טמוקסיפן</td><td>סיגמא אולדריץ</td><td>' T5648</td><td></td></tr><tr><td>שמן זרעי חמניות</td><td>סיגמא אולדריץ</td>' <td>S5007</td><td></td></tr><tr><td>טווין 20</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31)</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td>550274</tr><tr><td>Alexa Fluor 647&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI כתם גרעיני</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>37oC אינקובטור</td><td>תרמו-מדעי פישר</td><td>הרתרם, חממות מיקרוביולוגיות קומפקטיות</td><td></td></tr><tr><td>48 צלחות באר</td><td>טיפול בתא</td><td>229148</td><td></td></tr><tr><td>איזון אנליטי</td><td>מטלר טולדו</td><td>PB153-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>קונפוקלי מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 510 מיקרוסקופ</td><td></td>קונפוקלי</tr><tr><td>מיקרוסקופ חיתוך</td><td>Unitron</td><td>Z850</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Zeiss</td><td>Observer. Z1</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 מעקר חרוזי זכוכית</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER-5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>מקור אור</td><td>SCHOTT</td><td>ACE I</td><td></td></tr><tr><td>זוג מספריים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 60 מ"מ x15 מ"מ&nbsp;</td><td>TPP טכנו מוצרי פלסטיק AG</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>נדנדה II&nbsp; נדנדה פלטפורמה</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מנצנצים</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>03-337-26</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה העברה</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

מעקב וניתוח המשובטים יחיד ברמה השלמה-לב יכולים לקבוע התנהגות תא ובתאי לב והבחנה במהלך התפתחות של לב, ולאפשר לחקר הבסיס התאי והמולקולרי של המורפוגנזה לב נורמלית נורמלית. טכנולוגיות מתפתחות אחרונות של ניתוחים משובטים יחיד רטרוספקטיבית לעשות לחקר המורפוגנזה לב ברזולוצית תא בודד ריאלית. עם זאת, אטימות רקמות אור פיזור של הלב כעומק הדמיה הוא גדל הדמיה כולו-לב לעכב ברזולוציה תא בודד. כדי להתגבר על המכשולים הללו, מערכת סליקת מחיטה עוברת שיכול להפוך בלב מאוד שקוף לתאורה וזיהוי שניהם חייבים להיות מפותח. למרבה המזל, בשנים האחרונות, מתודולוגיות רבות למערכות סליקה כל-אורגניזם כגון CLARITY, SCA le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, מעוקב, DBE, באב ו PACT דווחו. מעבדה זו מעוניינת המנגנונים התאיים ומולקולריים של כרטיסmorphogenesis IAC. לאחרונה, הקמנו שושלת תא בודדת התחקות דרך ROSA26-Cre ERT2; ROSA26-קונפטי מערכת לתאי תווית בדלילות במהלך התפתחות של לב. התאמנו מספר מתודולוגיות כולו סליקה-העובר כולל Sca le ו מעוקב (ברור, קוקטיילי הדמיה מוחית בלא הפרעה וניתוח חישובית) כדי לנקות את העובר בשילוב עם מכתים הר שלם כדי שיבוטים יחידים תמונה בתוך הלב. הלב היה צלם בהצלחה ברזולוצית תא בודדת. מצאנו כי Sca le יכול לנקות את הלב העוברי, אך לא ניתן לנקות את הלב לאחר הלידה ביעילות, תוך מעוקב יכול לנקות את הלב לאחר הלידה, אך נזקים בלב העוברית על ידי המסת רקמות. השיטות שתוארו כאן תאפשרנה המחקר של תפקוד גן ברזולוצית שיבוט אחד במהלך המורפוגנזה לב, אשר, בתורו, יכול לחשוף את הבסיס התאי ומולקולרי של מומי לב מולדים.

הדמיה בלב העוברי הפינה היווצרות לב החולייתנים היא תהליך morphogenic מוסדר spatiotemporally ותלוי הארגון וההבחנה של ובתאים מארבעה מקורות שונים 1. תאים משדה הלב הראשון של סהר הלב יתקפלו לכיוון קו אמצע הגחון כדי ליצור צינור לב ליניארי. התאים משדה הלב השני, בתחילה המתגוררים dorsomedially לשדה הלב הראשון, ובהמשך translocate אל mesoderm הבלוע ...

אנו מתארים פרוטוקול להדמיה נפחית של תאים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי עמוק בתוך לבבות עובריים שלמים ולאחר לידה. תוך שימוש בשיטות ניקוי רקמות בשילוב עם צביעה שלמה, ניתן לדמות תאים בודדים עם תווית חלבון פלואורסצנטי בתוך לב עוברי או לאחר לידה בצורה ברורה ומדויקת.

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא הדמיה נפחית של תאים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי עמוק בתוך לבבות שלמים, כדי לחקור תפקוד גנים ברזולוציה של תא בודד במהלך ההתפתחות הלבבית ובלבבות לאחר הלידה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח במהלך ההתפתחות הלבבית, כגון חקר תפקודי גנים וסיוע בהדמיה ברזולוציה של תא בודד במהלך ההתפתחות הלבבית ומניעת ארטיפקטים של בעלי חיים. היתרון המרכזי של שיטה זו הוא שהיא פשוטה יחסית, זולה, ויעילה בביצוע ניתוח זמני מיוחד של תפקודי הגן והחלבון ברזולוציה של תא בודד בעובר או בלב שלמים.למרות שביצענו שימוש במערכת זו כדי לחקור את התפתחות הלב בעכברים, ניתן להשתמש בה גם כדי לחקור מערכות איברים אחרות, כגון שרירים, מוח וריאות, וכן באורגניזמים מודל אחרים. כאן נעשה שימוש בעוברים חיוביים לחלבון פלואורסצנטי מנקבות R-26 Cre-RET2 confetti שטופלו ב-Tamoxifren. התחילו את הצביעה על ידי טבילה של כל עובר מקובע ב-paraformaldehyde בתוך מיליליטר אחד של 0.1% PBST בבארות של פלטה בעלת 48 בארות.דגרו למשך שעתיים על מנער פלטות בטמפרטורת החדר כדי להפריש (permeabilize) את הרקמה. לאחר מכן, החליפו את תמיסת ההפרשה ב-1 mL של תמיסת חסימה (blocking buffer) ודגרו, תוך써 ניעור, למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או למשך לילה ב-4 °C. לאחר מכן, הכינו דילול של 1:100 של הנוגדן הספציפי לתאי אנדותל, PECAM, ב-0.3 מיליליטר של תמיסת חסימה עבור כל באר, והוסיפו זאת לבארי המכילים את העוברים.דגרו למשך 48 שעות עם ניעור בטמפרטורה של 4°C. לאחר הדגירה, שטפו את העובריים חמש פעמים עם PBST למשך 30 דקות בכל פעם כדי להסיר נוגדן ראשוני עודף מהרקמה. לאחר מכן, טבלו את העובריים בתמיסת נוגדן משני Alexa Fluor 647 goat antivat ודגרו עם ניעור למשך 48 שעות בטמפרטורה של 4°C, תוך הגנה מאור.48 שעות לאחר מכן, לאחר שטיפה מוקדמת, בצעו קיבוע מאוחר (post-fix) לעובריים ב-4% PFA למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תוך כדי ניעור. לאחר מכן, לאחר שטיפה כפולה עם PBS למשך חמש דקות בכל פעם, דגרו את העובריים עם צבע גרעין DAPI למשך עשר דקות. המשיכו בשני שטיפות PBS של חמש דקות כל אחת, ולאחר מכן עברו לשקיפות רקמה (tissue clearing).השקיפות של הרקמה היא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה על מנת לדמות את הלב ברזולוציה של תא בודד. כמו כן, בחירת שיטת ההשקיפות, scale או CUBIC, היא חשובה מאוד על מנת לשמר את האותות הפלואורסצנטיים בלב העוברי השלם. העבירו את העוברי השטופים והצבועים לבקבוק סינטינציה (scintillation vial) העטוף בנייר אלומיניום, המכיל 1 ml של תמיסת scale A2.דגרו בטמפרטורה של 4°C עם ניעור עדין ידני מדי פעם למשך 48 שעות. לאחר הדגירה של סדרה A2, החליפו את התמיסה בבקבוקון ב-1 mL של תמיסת סדרה B4, ודגרו בטמפרטורה של 4°C עם ניעור עדין מדי פעם למשך 48 שעות נוספות. דגרו את העוברים למשך 48 שעות נוספות עם 1 mL של סדרה 70 בטמפרטורה של 4°C עם ניעור עדין מדי פעם, כפי שבוצע קודם לכן.לבסוף, טבול את הדגימה לאחר הפינוי בשניסקל (scale cleared) במיליליטר אחד של 90% glycerol ואחסן בטמפרטורה של 4 degrees celsius עד לביצוע הדימות. לצורך הדימות, העבר את הדגימה לפיתרי דיש עם תחתית זכוכית המכיל כמות מינימלית של 90% glycerol, ובצע דימות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי בעל יכולות פוטון כפול. עבור פינוי בשיטת CUBIC, טבול כל עובר במיליליטר אחד של CUBIC one עם ניעור עדין מדי פעם למשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 degrees celsius.לאחר 48 שעות, החליפו את התמיסה בנפח זהה של רכיב CUBIC one טרי והדגירו את הדגימה למשך 48 שעות נוספות, כפי שנעשה קודם לכן. לאחר הדגירה, שטפו את העוברים שעובדו ב-CUBIC one מספר פעמים ב-PBS תוך써 ניעור עדין ביד כדי להסיר את עודפי תמיסת ה-CUBIC one. לאחר מכן, טבלו את העובריים בתמיסת CUBIC two למשך 48 שעות ב-37 degrees celsius עם ניעור עדין מדי פעם ביד.במידה ויהיה עיכוב לפני הדמיון, דגרו את הדגימות באופן סדרתי עם מיליליטר אחד של גליצרין בריכוזים של 30%, 50% ו-70% ועם PBS למשך 30 דקות כל אחד. לאחר מעבר דרך הסדרה, העבירו לתמיסת גליצרין 90% לאחסון בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כאשר הדגימות מוכנות, בצעו דמיון בצלחת פטרי עם תחתית מזכוכית המכילה גליצרין 90%, כפי שנעשה קודם לכן.סרטון זה מציג חתכים אופטיים של לב עוברי ביום 8.75 (E 8.75) שעבר טיפול בסקאל (scale), מפני השטח של הלב ועד לחלל הלב (lumen). צבע צהוב מסמן את הביטוי של PECAM וכל התאים השריריים של הלב (cardiomyocytes) מופיעים בירוק. העומק הוא 110.4 microns ובסך הכל ישנם 93 חתכים.זוהי תמונת פני השטח בתלת-ממד של הלב השוחזר שהוצג זה עתה. שוב, צבע צהוב מסמן ביטוי של PECAM, וצבע ירוק מסמן את כל התאי השריריים של הלב (cardiomyocytes). סרטון זה מציג חתכים של שיבוב (clone) פרוגניטורי בודד מלב של עוף ביום הריון E 9.5 שטופל ב-scale, באזור מסלול הזרימה (outflow tract).צבע צהוב מסמן את ביטוי ה-PECAM והשיבוב מופיע בירוק. העומק הוא 36 microns וישנם 10 פרוסות בסך הכל. סרטון זה מציג חתכים של לב P two שעבר טיפול ב-CUBIC, מהפני השטח ועד ללומן.העומק הוא 130 microns עם שלושה microns לחתך. סרטון זה מציג חתכים של לב E 17.5 שעבר טיפול ב-CUBIC, מהפנימיות ועד לחלל הלב. העומק הוא 630 microns עם שישה microns לחתך.זוהי תמונת פני שטח בתלת-ממד של הלב שהוצג כעת, אשר שוחזרה באמצעות תוכנה לשחזור בתלת-ממד. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי העובר שברירי וניתן להפריע בקלות לפתולוגיה של הלב. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לזהות חלבונים אחרים, תוך שימוש בצביעה כדי לחקור את תפקוד הגן בשלב שאחרי ההפריה ומאוחר יותר.

imaging-cleared-embryonic-postnatal-hearts-at-single-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מוטציות המובילות למומי לב מולדים מפיקות תועלת מחקירה in vivo של מבנה הלב במהלך ההתפתחות, אך מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה בלב העוברי של העכבר הם מאתגרים מבחינה טכנית. כאן אנו מציגים שיטת אימונופלואורסצנציה וניתוח תמונה חזקה להערכת מבנים ספציפיים לקרדיומיוציטים בלב העכבר המתפתח.

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

אנו מציגים פרוטוקול לניתוח הכליליים כולן לבבות בעכברים עובריים עד E15.5, בשיטות מכתימות אימונולוגיים תקן ואחריו אישור אופטי מיקרוסקופיה confocal. טכניקה זו מאפשרת הדמיה של כלי דם בכל הלב השלם ללא הצורך בניתוח רב-פעמי של סעיפי סדרתי.

ניתוח של כלי דם כליליים ב הותרו עוברי לבבות

כדי להבחין בין חלוקת תאים לשינויים במחזור התא בקרדיומיוציטים, אנו מציגים פרוטוקולים המשתמשים בשני קווי עכברים טרנסגניים: עכברים טרנסגניים Myh6-H2B-mCh, לזיהוי חד משמעי של גרעיני קרדיומיוציטים, ועכברי CAG-eGFP-אנילין, להבחנה בין חלוקת תאים לשינויים במחזור התא.

ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כל הר immunofluorescence וניתוח מבוססת תמונה כמותית volumetric העובר העכבר בשלב מוקדם. אנו מציגים טכניקה זו כמו בגישה רב-עוצמה איכותית באופן כמותי להעריך מבנים לב במהלך הפיתוח, ואני מציע כי ייתכן נרחב יכולת הסתגלות למערכות איברים אחרים.

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

מחקר זה משתמש בטכניקה מיקרוסקופ (LSFM) אור גיליונות פלורסצנטיות דו-צדדית תאורה בשילוב עם קרחת אופטי ללמוד את הלב מאתר.

מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות לחקר הלב מאתר

התפשטות הקרדיוציט לאחר הפציעה היא תהליך דינאמי הדורש סימפוניה של רמזים בלתי-מיכיים מאוכלוסיות תאים שאינן מיוציט. ניצול מעקב אחר השושלת, בהירות פסיבית, ושלושה מימדים שלמים של מיקרוסקופ ההרכבה טכניקות, אנחנו יכולים לנתח את ההשפעה של מגוון סוגי תאים על תיקון לב והתחדשות.

לכידת תגובת פגיעה לב של אוכלוסיות תאים ממוקדות באמצעות לב נקי תלת מימדי הדמיה

אנו מדווחים על שיטה לשחזור מזוסקופי של לב העכבר כולו על ידי שילוב של התקדמות חדשה בטרנספורמציה וצביעה של רקמות עם פיתוח של מיקרוסקופ אור סרוק אקסיאלי.

הדמיה אופטית מזוסקופית של לב עכבר שלם

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתרבית והדמיית עוברי עכבר המאפשר הדמיה תלת ממדית + זמן של תאי אב לבביים. ערכת כלי וידאו זו מתייחסת למיומנויות המפתח הנדרשות להדמיה חיה מוצלחת שאחרת קשה לרכוש מפרסומים של טקסט בלבד.

הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר

הפרוטוקול משתמש במיקרוסקופ מתקדם של יריעות אור יחד עם שיטות מותאמות לניקוי רקמות כדי לחקור מבנים לבביים מורכבים בלבבות מכרסמים, טומן בחובו פוטנציאל גדול להבנת מורפוגנזה לבבית ועיצוב מחדש.

הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים

פרוטוקול זה מציג שיטה מהירה להדמיית כלי דם תלת מימדית כמותית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור. יעילות השיטה מודגמת באמצעות מערכת עורקי קשת הלוע של מודל עובר האפרוח, עם כוחות המודינמיים המכומתים באמצעות דינמיקת נוזלים חישובית.

הדמיה מהירה ברזולוציה גבוהה של כלי דם של בעלי חיים קטנים למחקרים כמותיים

למדו הדמיה וולומטרית של תאים מסומנים בחלבון פלואורסצנטי בלבבות עובריים ולאחר לידה ברזולוציית תא בודד. השיטה משלבת ניקוי רקמות וצביעה שלמות לניתוח פונקציות גנים בפיתוח לבבי.

הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד

גלה סרטונים נוספים