אופטימיזציה גודל המצרפי Microwells עבור מבוססי השעיה בידול לב של תאי גזע אנושיים pluripotent
September 25th, 2016
בשיטות מקובלות ליזום בידול מצטבר המבוסס השעית לב של פלוריפוטנטיים אדם נובע תאים (hPSCs) הם הטרידו עם ההטרוגניות תרבות ביחס גודל וצורה המצרפי. כאן אנו מתארים שיטה חזקה לבידול לב העסקת microwells ליצור שבשליטת הגודל hPSC אגרגטים בתרבית בתנאים לקידום לב.
ראשית, צנטריפוגה תא גזע פלוריפוטנטי אנושי חד-תאי, או תרחיף HPSC, ב-200 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגה, שאפו את מדיום הכביסה, והשעו מחדש את התאים במדיום צבירה, בצפיפות של 1.2 פעמים 10 עד התאים השישיים למיליליטר. לאחר מכן, זרעו מיליליטר אחד של תרחיף התאים לכל באר על צלחת המיקרובאר המוכנה, והפיצו את התאים באופן שווה.
כדי לזרוע מספר רב של בארות, מערבל מעת לעת את תרחיף התאים כדי למנוע שקיעה. לאחר הזריעה, צנטריפוגה את הצלחת ב -200 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר הסיבוב, התבונן בצלחת מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר שהתאים הסתובבו לתחתית כל מיקרובאר.
לאחר מכן, דגרו את הצלחת למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור היפוקסי של 5%C-O שתיים, 5%O שתיים. יום אחד לאחר הצבירה, בדוק את האגרגטים תחת המיקרוסקופ. בהשוואה לצבירה המיידית שלאחר הצנטריפוגה, הם צריכים להיראות שלמים עם קצוות חלקים.
הסר את הסופרנטנט על ידי החזקת צלחת המיקרובאר בצורה אופקית, והנחת קצה המיקרו-פיפטור P-1000 על פני מדיום התרבית, וכנגד קצה הבאר. לאחר מכן, הסר לאט את המדיום, והקפיד לא להפריע לאגרגטים בתחתית המיקרו-בארות. לאחר הפחתת מפלס המדיום לכמילימטר עד שניים ממשטח המיקרובאר המרקם, הטה לאט את הצלחת ושאף לאט את המדיום הנותר מהבאר.
הוסף מילילטר אחד של מדיום אינדוקציה שלב אחד שהוכן מראש על ידי החזקת קצה הפיפטה כנגד הקצה הפנימי של הבאר, וחלוקת המדיום לאט מאוד כנגד הקיר הפנימי של הבאר. החזירו את הצלחת לחממה בתנאים היפוקסיים למשך שלושה ימים. ביום הרביעי, השתמש בפיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר כדי לקצור את האגרגטים מכל באר של צלחת המיקרו-באר
.אוספים עד 10 בארות של מתלה מצטבר בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. אפשר לאגרגטים להתיישב במשך 15 דקות בחממה היפוקסית. לאחר שהאגרגטים התייצבו, שאפו בזהירות את הסופרנטנט, והשעו מחדש את האגרגטים בעשרה מיליליטר של מדיום כביסה שחומם מראש, כדי להסיר שאריות ציטוקינים אינדוקטיביים.
צנטריפוגה את האגרגטים ב 50 פעמים גרם למשך שתי דקות. לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את האגרגטים הגלולים במדיום אינדוקציה שלב 2 שחומם מראש. העבר את מתלה הצבירה לצלחת חיבור נמוכה במיוחד של 24 בארות במיליליטר אחד לבאר.
התבונן באגרגטים מתחת למיקרוסקופ כאשכולות תאים הדוקים אחידים. דגירה בתנאים היפוקסיים עד היום השישי. ביום השישי, אסוף עד 10 מיליליטר אגרגטים לכל צינור חרוטי של 15 מיליליטר כמו קודם.
לאחר שהאגרגטים התייצבו, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את האגרגטים במדיום האינדוקציה שלב 3 שחומם מראש. בעזרת פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר, חלקו מחדש את האגרגטים לצלחת חיבור נמוכה במיוחד של 24 בארות, במיליליטר אחד לבאר. בצע שינוי מדיום מלא ביום העשירי של התרבית.
ביום ה-12, העבירו את התאים לתנאי תרבית נורמוקסיים של 20% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני למשך שארית תקופת התרבית. לאחר 12 ימים של התמיינות, המקבילה לשישה ימים בשלב השראת הלב, נצפו שלושה התכווצויות בינוניות וחזקות ברוחב מצטבר. ביום ה-17, 74.8% מהתאים חיוביים לטרופונין T לבבי, על ידי זרימה ציטומטרית, כפי שמצוין על ידי החלק המלא של ההיסטוגרמה.
מוצגים גם תאים מוכתמים בנוגדנים המשניים בלבד, המוצגים על ידי החלק הלא מלא של ההיסטוגרמה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשטוף היטב את האגרגטים ביום הרביעי, כדי להסיר רמות עקבות של ציטוקינים, במיוחד activin-A, המקדם התמיינות אנדודרם, על חשבון השראת הלב. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון תרבית קרירה של סוגי תאים אינדוקטיביים בתוך הצבר, כדי לענות על שאלות אחרות, כגון כיצד איתות פרקריני מרקמות עובריות שכנות משפיע על התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לשושלת הלב.
סקירה
מאמר זה מציג שיטה חזקה להבדלת לבבית של תאי גזע רב-עוצמתיים אנושיים (hPSCs) באמצעות מיקרו-בארות לייצור אגרגטים בגודל מבוקר. השיטה מטפלת בבעיות של הטרוגניות תרבותית הקשורה לטכניקות קונבנציונליות.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של תאי גזע
- הבדלה לבבית
- הנדסת רקמות
רקע
- תאי גזע רב-עוצמתיים אנושיים (hPSCs) יכולים להתמיין לסוגים שונים של תאים, כולל תאי לב.
- שיטות קונבנציונליות לעיתים קרובות מביאות לאגרגטים בגדלים וצורות שונות, המשפיעים על תוצאות ההבדלה.
- טכנולוגיית המיקרו-בארות מציעה פיתרון ליצירת אגרגטים אחידים.
- תנאים מקדמים ללב חיוניים להבדלה יעילה.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה להפקת אגרגטים של hPSCs בגודל מבוקר.
- לשפר את עקביות תוצאות ההבדלה הלבבית.
- לאפשר מחקר נוסף בתחום הנדסת רקמות לבבית.
שיטות ששימשו
- צנטריפוגציה של השעיה של hPSCs ליצירת אגרגטים.
- שימוש בצלחות מיקרו-בארות כדי לשלוט בגודל האגרגטים.
- דגירה בתנאים חסרי חמצן כדי לקדם הבדלה לבבית.
- שינויי מדיום רציפים כדי לגרום לשלבי ההבדלה.
תוצאות עיקריות
- אגרגטים אחידים נוצרו ונשמרו לאורך כל תהליך ההבדלה.
- הופעה משמעותית של טרופונין T לבבית נצפתה בתאים שעברו הבדלה.
- הסרה משופרת של ציטוקינים אינדוקטיביים שיפרה את המחויבות לשושלת הלבבית.
- צמצומים בכל האגרגט נצפו לאחר 12 ימים של הבדלה.
מסקנות
- שיטת המיקרו-בארות מספקת גישה אמינה להבדלה לבבית של hPSCs.
- אגרגטים בגודל מבוקר מובילים לתוצאות הבדלה עקביות יותר.
- שיטה זו יכולה לשמש לחקר התפתחות לבבית ומודלים של מחלות נוספים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Controlling aggregate size in suspension-based cardiac differentiation addresses a key bottleneck in hPSC-derived cardiomyocyte production: culture heterogeneity leading to variable yields. By enforcing uniform aggregate formation via microwell technology, this method enhances predictive confidence in differentiation outcomes, supporting scalable and reproducible preclinical model generation. This positions the approach as a strategic tool for de-risking cardiac lineage commitment in early discovery and translational workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of size-dependent signaling pathways in cardiac induction, clarifying mechanistic drivers of lineage specification.
- Operational Value: Reduces variability in aggregate formation, improving reproducibility across experiments and teams.
- Predictive Value: Supports dose-response modeling of morphogen exposure by standardizing aggregate geometry as a controlled variable.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces uniform microtissues suitable for high-content imaging and flow cytometry-based cardiomyocyte quantification.
- Scalability: Microwell plate format allows parallel processing of multiple conditions or genetic backgrounds for comparative screening.
- Quantitative Output: Enables consistent measurement of cardiac troponin T-positive cells as a functional readout for compound or genetic perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Generates scalable, homogeneous cardiac aggregates for modeling inherited cardiomyopathies or drug-induced cardiotoxicity.
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage differentiation with preclinical validation by providing lot-to-lot consistent cellular material.
- Mechanistic De-risking: Minimizes confounding variables from aggregate size heterogeneity, increasing confidence in phenotype-to-genotype associations.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized hPSC differentiation, which feeds into downstream applications such as disease modeling, safety pharmacology, and regenerative medicine candidate evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing around biophysical cues in cardiac lineage commitment through precise control of aggregate size and shape.
- Screening: Delivers reproducible microtissue arrays for compound library screening with reduced noise from aggregation variability.
- Analytics: Facilitates quantitative flow cytometry and imaging readouts (e.g., cardiac troponin T) with improved signal-to-noise due to population homogeneity.
- Translational Research: Provides a scalable source of cardiomyocytes for preclinical functional assays, including contractility and electrophysiology.
- Enterprise Reuse: Microwell plates can be reused across projects and cell lines, supporting platform-level standardization in stem cell differentiation workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in differentiation outcomes by minimizing biological noise from aggregate size variation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput via standardized, scalable aggregate formation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in early cardiac programs by reducing false negatives from inefficient differentiation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted resource allocation based on reliable cardiomyocyte yield metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hPSC culture, aggregate handling, and hypoxic incubation systems.
- Dependent on access to microwell plates with defined well dimensions and low-attachment surfaces.
- Necessitates standardized medium exchange protocols to avoid aggregate disruption during washing steps.
- Requires validation across hPSC lines to ensure size-to-differentiation efficiency relationships are consistent.
- Limited by the need for specialized equipment (hypoxic incubators, low-attachment plates) and optimized cytokine wash steps to prevent off-target differentiation.
