אופטימיזציה גודל המצרפי Microwells עבור מבוססי השעיה בידול לב של תאי גזע אנושיים pluripotent
25 בספטמבר 2016
בשיטות מקובלות ליזום בידול מצטבר המבוסס השעית לב של פלוריפוטנטיים אדם נובע תאים (hPSCs) הם הטרידו עם ההטרוגניות תרבות ביחס גודל וצורה המצרפי. כאן אנו מתארים שיטה חזקה לבידול לב העסקת microwells ליצור שבשליטת הגודל hPSC אגרגטים בתרבית בתנאים לקידום לב.
ראשית, צנטריפוגה תא גזע פלוריפוטנטי אנושי חד-תאי, או תרחיף HPSC, ב-200 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגה, שאפו את מדיום הכביסה, והשעו מחדש את התאים במדיום צבירה, בצפיפות של 1.2 פעמים 10 עד התאים השישיים למיליליטר. לאחר מכן, זרעו מיליליטר אחד של תרחיף התאים לכל באר על צלחת המיקרובאר המוכנה, והפיצו את התאים באופן שווה.
כדי לזרוע מספר רב של בארות, מערבל מעת לעת את תרחיף התאים כדי למנוע שקיעה. לאחר הזריעה, צנטריפוגה את הצלחת ב -200 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר הסיבוב, התבונן בצלחת מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר שהתאים הסתובבו לתחתית כל מיקרובאר.
לאחר מכן, דגרו את הצלחת למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור היפוקסי של 5%C-O שתיים, 5%O שתיים. יום אחד לאחר הצבירה, בדוק את האגרגטים תחת המיקרוסקופ. בהשוואה לצבירה המיידית שלאחר הצנטריפוגה, הם צריכים להיראות שלמים עם קצוות חלקים.
הסר את הסופרנטנט על ידי החזקת צלחת המיקרובאר בצורה אופקית, והנחת קצה המיקרו-פיפטור P-1000 על פני מדיום התרבית, וכנגד קצה הבאר. לאחר מכן, הסר לאט את המדיום, והקפיד לא להפריע לאגרגטים בתחתית המיקרו-בארות. לאחר הפחתת מפלס המדיום לכמילימטר עד שניים ממשטח המיקרובאר המרקם, הטה לאט את הצלחת ושאף לאט את המדיום הנותר מהבאר.
הוסף מילילטר אחד של מדיום אינדוקציה שלב אחד שהוכן מראש על ידי החזקת קצה הפיפטה כנגד הקצה הפנימי של הבאר, וחלוקת המדיום לאט מאוד כנגד הקיר הפנימי של הבאר. החזירו את הצלחת לחממה בתנאים היפוקסיים למשך שלושה ימים. ביום הרביעי, השתמש בפיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר כדי לקצור את האגרגטים מכל באר של צלחת המיקרו-באר
.אוספים עד 10 בארות של מתלה מצטבר בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. אפשר לאגרגטים להתיישב במשך 15 דקות בחממה היפוקסית. לאחר שהאגרגטים התייצבו, שאפו בזהירות את הסופרנטנט, והשעו מחדש את האגרגטים בעשרה מיליליטר של מדיום כביסה שחומם מראש, כדי להסיר שאריות ציטוקינים אינדוקטיביים.
צנטריפוגה את האגרגטים ב 50 פעמים גרם למשך שתי דקות. לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את האגרגטים הגלולים במדיום אינדוקציה שלב 2 שחומם מראש. העבר את מתלה הצבירה לצלחת חיבור נמוכה במיוחד של 24 בארות במיליליטר אחד לבאר.
התבונן באגרגטים מתחת למיקרוסקופ כאשכולות תאים הדוקים אחידים. דגירה בתנאים היפוקסיים עד היום השישי. ביום השישי, אסוף עד 10 מיליליטר אגרגטים לכל צינור חרוטי של 15 מיליליטר כמו קודם.
לאחר שהאגרגטים התייצבו, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את האגרגטים במדיום האינדוקציה שלב 3 שחומם מראש. בעזרת פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר, חלקו מחדש את האגרגטים לצלחת חיבור נמוכה במיוחד של 24 בארות, במיליליטר אחד לבאר. בצע שינוי מדיום מלא ביום העשירי של התרבית.
ביום ה-12, העבירו את התאים לתנאי תרבית נורמוקסיים של 20% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני למשך שארית תקופת התרבית. לאחר 12 ימים של התמיינות, המקבילה לשישה ימים בשלב השראת הלב, נצפו שלושה התכווצויות בינוניות וחזקות ברוחב מצטבר. ביום ה-17, 74.8% מהתאים חיוביים לטרופונין T לבבי, על ידי זרימה ציטומטרית, כפי שמצוין על ידי החלק המלא של ההיסטוגרמה.
מוצגים גם תאים מוכתמים בנוגדנים המשניים בלבד, המוצגים על ידי החלק הלא מלא של ההיסטוגרמה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשטוף היטב את האגרגטים ביום הרביעי, כדי להסיר רמות עקבות של ציטוקינים, במיוחד activin-A, המקדם התמיינות אנדודרם, על חשבון השראת הלב. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון תרבית קרירה של סוגי תאים אינדוקטיביים בתוך הצבר, כדי לענות על שאלות אחרות, כגון כיצד איתות פרקריני מרקמות עובריות שכנות משפיע על התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לשושלת הלב.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה חסונה לגילוי לבבי (cardiac differentiation) של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) באמצעות מיקרו-בארים ליצירת אגרגטים בעלי גודל מבוקר. השיטה נותנת מענה לבעיות של הטרוגניות בתרבית הקשורה לטכניקות קונבנציונליות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של תאי גזע
- דיפרנציאציה לבבית
- הנדסת רקמות
רקע
- תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יכולים להפוך לסוגים שונים של תאים, כולל תאי לב.
- שיטות קונבנציונליות מובילות לעיתים קרובות ליצירת אגרגטים בגדלים ובצורות משתנות, דבר המשפיע על תוצאות הדיפרנציאציה.
- טכנולוגיית מיקרו-בארים (Microwell) מציעה פתרון ליצירת אגרגטים אחידים.
- תנאים המעודדים התפתחות תאי לב חיוניים לדיפרנציאציה יעילה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה ליצירת אגרגטים של hPSC בשליטה גודלית.
- שיפור העקביות של תוצרי הגבשה לבבית.
- הסﾗה של מחקרים נוספים בתחום הנדסת רקמות הלב.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- צנטריפוגציה של תגסוס hPSC ליצירת אגרגטים.
- שימוש בלוחות מיקרו-בארים (microwell plates) לשליטה בגודל האגרגטים.
- דגירה בתנאי היפוקסיה לקידום דיפרנציאציה לבבית.
- החלפות מדיום רצופות להשראת שלבי הדיפרנציאציה.
תוצאות עיקריות
- אגרגטים אחידים נוצרו ונשמרו לאורך תהליך ההגבהה.
- נצפתה ביטוי משמעותי של cardiac troponin T בתאים המובחנים.
- הסרה משופרת של ציטוקינים מעודדים הגבירה את המחויבות לשושלה לבבית.
- התכווצויות של כלל האגרגט נצפו לאחר 12 ימים של הגבחה.
מסקנות
- שיטת המיקרו-בארים (microwell) מספקת גישה מהימנה לדיפרנציאציה קרדיאלית של hPSCs.
- אגרגטים שגודלם נשלט מובילים לתוצאות דיפרנציאציה עקביות יותר.
- ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור לעומק את ההתפתחות הקרדיאלית ומידול מחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
בקרה על גודל האגרגטים (צברים) בדיפרנציאציה לבבית מבוססת תמיסות פותרת צוואר בקבוק מרכזי בייצור קרדיומיוציטים המופקים מ-hPSC: הטרוגניות בתרבית המובילה לתבלי רקע משתנה. באמצעות כפייה של יצירת אגרגטים אחידים בעזרת טכנולוגיית מיקרו-בארים (microwells), שיטה זו מגבירה את רמת הוודאות החיזוית של תוצאות הדיפרנציאציה, ובכך תומכת ביצירה של מודלים פרה-קליניים הניתנים להרחבה ולשחזור. הדבר ממיצב גישה זו ככלי אסטרטגי להפחתת סיכונים בתהליך ההתמיינות לקו תאי לבבי במסגרת זרימות עבודה של גילוי מוקדם ומחקרים תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מסלולי סיגנלינג התלויים בגודל במהלך השראה לבבית, ובכך מבהיר את הגורמים המכניסטיים לקביעת השושלת התאית.
- ערך תפעולי: מפחית שונות ביצירת אגרגטים, ובכך משפר את השחזוריות בין ניסויים וצוותים שונים.
- ערך ניבוי: תומך במידול תגובה למספר (dose-response) של חשיפה למורפוגנים, על ידי סטנדרטיזציה של גיאומטריית האגרגט כמשתנה מבוקר.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר מיקרו-רקמות אחידות המתאימות לדימוי בעל תוכן גבוה (high-content imaging) ולכימות קרדיומיוציטים מבוסס ציטומטריית זרימה.
- יכולת הרחבה: פורמט של פלטת מיקרו-בארים מאפשר עיבוד מקבילי של תנאים מרובים או רקעים גנטיים שונים לצורך סריקה השוואית.
- פלט כמותי: מאפשר מדידה עקבית של תאים חיוביים ל-cardiac troponin T כקריאה תפקודית למחקרי הפרעה גנטית או השפעת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מערכת רלוונטית למחלה: מייצרת אגרגטים לבביים הומוגניים ובקנה מידה רחב למידול קרדיומיופתיות תורשתיות או רעילות לבבית מושרית תרופות.
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין שלב הדיפרנציאציה של שלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני על ידי אספקת חומר תאי עקבי בין סדרות ייצור.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: ממזערת משתנים מתערבים הנובעים מהטרוגניות בגודל האגרגטים, ובכך מעלה את רמת הביטחון בקשרים בין הפנוטיפ לגנוטיפ.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שלב הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לגילוי סטנדרטי של דיפרנציאציה של hPSC, המהווה בסיס ליישומים המשכיים כגון מידול מחלות, פרמקולוגיה של בטיחות והערכה של מועמדים לרפואה רגנרטיבית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות סביב רמזים ביופיזיים בהתמיינות לשושלת לבבית באמצעות בקרה מדויקת של גודל וצורת האגרגט.
- סריקה: מספקת מערכים הדירות של מיקרו-רקמות לסריקת ספריות תרכובות עם רעש מופחת הנובע משונות באגרגציה.
- אנליטיקה: מאפשרת קריאות כמותיות של ציטומטריית זרימה והדמיה (למשל, cardiac troponin T) עם יחס אות לרעש משופר הודות להומוגניות האוכלוסייה.
- מחקר תרגומי: מספקת מקור בר-הרחבה של קרדיומיוציטים לבדיקות תפקודיות פרה-קליניות, כולל התכווצות ואלקטרופיזיולוגיה.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להשתמש בלוחיות המיקרו-בארים שוב בפרויקטים ובקווי תאים שונים, מה שתומך בסטנדרטיזציה ברמת הפלטפורמה בתהליכי עבודה של התמיינות תאי גזע.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתוצאות הדיפרנציאציה על ידי מזעור רעש ביולוגי הנובע משונות בגודל האגרגטים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות ואת התפוקה באמצעות יצירת אגרגטים סטנדרטית הניתנת להרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בקבלת החלטות של go/no-go בתוכניות קרדיאליות מוקדמות על ידי הפחתת מספר התוצאות השליליות השגויות הנובעות מדיפרנציאציה לא יעילה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר הקצאת משאבים מותאמת סיכון המבוססת על מדדי תפוקה אמינים של קרדיומיוציטים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול hPSC, טיפול באגרגטים ומערכות דגירה היפוקסיות.
- תלוי בגישה ללוחיות מיקרו-בארים עם ממדי באר מוגדרים ומשטחים בעלי היצמדות נמוכה.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים להחלפת מדיום כדי למנוע פירוק של אגרגטים במהלך שלבי השטיפה.
- דורש תיקוף על פני שורות hPSC שונות כדי להבטיח שהקשרים בין גודל ליעילות דיפרנציאציה הם עקביים.
- מוגבל על ידי הצורך בציוד ייעודי (דגריות היפוקסיות, לוחיות בעלות היצמדות נמוכה) ושלבי שטיפה אופטימליים של ציטוקינים למניעת דיפרנציאציה לא רצויה.
