Name: סידן הדמיה ב תסיסנית ב ביצת הפעלה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: חקור דינמיקת סידן בהפעלת ביצה ב-Drosophila melanogaster באמצעות פרוטוקול ex vivo. שיטה זו מאפשרת רזולוציה מרחבית גבוהה ומיפוי גלי סידן בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לורה Bampton, אלכס דוידסון, ריצ&#39;רד פרטון, אריטה Acharya לסיוע במהלך תקופת ההכנה של כתב היד הזה; מריאנה וולפנר לדיונים על הפעלת ביצה; מאט Wayland לתמיכת הדמיה; ונאן הו עבור תמיכה כללית במעבדה. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת קיימברידג &#39;, ISSF כדי TTW [מספר מענק 097,814].

הערה: ביצוע כל הצעדים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. 1. הכנה לנתיחה הערה: השלבים המתוארים כאן הם בהתאם E. Gavis, אוניברסיטת פרינסטון &amp; וייל et. al. 18. בצע את השלבים הבאים יומיים לפני הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח בקבוקון זבוב המכיל כ 10 מיליליטר של מזון מוצק להוסיף כמות קטנה של שמרים יבשים לאחד בפינה, פחות מ 1 גרם מספיק. הערה: לקבלת מידע אודות בקבוקונים לטוס או מזון לראות &quot;תסיסנית תחזוקה &#39;19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 - 3 טיפות של מים כדי ללחלח את השמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הבקבוקון הצידה בזווית של 45 מעלות ולאפשר 3 - 5 דקות על השמרים כדי לקחת את המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד שמרים סופג את המים, בחר בקבוק זבובים להביע GCaMP5 MYR UASt- 20 מונע על ידי אמבט-VP16GAL4 (המכונה GCaMP5) שצצו לאחרונה (א myristoyטופס lated של GCaMP5 נבחר לספק אות גבוהה יחס רעש דרך קושר את Geci הקרום בתוך הביצה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את הזבובים בבקבוק עם גז CO 2. הקפד לשמור את הבקבוק הפוך כדי לא לאבד זבובים במזון הרטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצת הזבובים מורדמים על כרית CO 2 ולמיין 10 - 15 נקבות ו 5 זכרים באמצעות מכחול תחת מיקרוסקופ לנתח. הערה: זהו תקן לכלול זכרים לספק נקבות בריאות לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר את הבקבוקון משלב 1.3 מוכן, מוסיף את הזבובים שנבחרו כדי הבקבוקון. תשמור על עצמך כדי לשמור על אופקי הבקבוקון עד הזבובים להיות פעילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצנצנת על 25 מעלות צלזיוס למשך כ 36 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את הזבובים הנותרים מפנקס CO 2 על הבקבוק או שנזרק. </li></ol> 2. השחלות תסיסנית ביתור הערה: השלבים המתוארים כאן הם בהתאם וייל et. אל. <sעד&gt; 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 36 שעות, לטשטש הזבובים מבקבוקון yeasted עם 2 CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזבובים בתוך הבקבוקון מורדמים להטות אותם על כרית 2 CO להיות מסודר עם מברשת צבע תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר נקבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד שתי השחלות מן הנקבה. עבור פרוטוקול מפורט מלא לראות וייל et. al. 18. לסיכום: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום טיפה קטנה של שמן halocarbon מחומצן (סדרה 95) על מס &#39;1.5, 22 x 40 מ&quot;מ coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוז הנשי עם מלקחיים על הקדמי של הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזקת הנקבה תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש בקבוצה השנייה של מלקחיים כדי להסיר את האחוריים של הנקבה בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את הרקמה האחורית מן המלקחיים השניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוחט על חלל הבטן עם המלקחיים השניים מן הקדמי אל האחורי של הבטן. שתי ההשחלות האטומות צריכות לדבוק המלקחיים כשבחוץ של FEMAle. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גע השחלות לתוך השמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל רקמה מן המלקחיים על ידי מנגב את המלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים אלה (2.4.1 - 2.4.7) כדי להשיג שלוש coverslips, כל שחלות המכילות בין זבוב אחד. </li></ol></li></ol> 3. בידוד פרט ביציות בשלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח סטנדרטי עם ההגדלה מוגדרת 4X, על coverslip הראשון משלב 2.4, להפריד בין שתי שחלות ידי קריעת oviduct. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג זוג מלקחיים סגורים למרכז בשחלה אחת, נזהר שלא לנקב כל תאי ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כנס חללי לנתח סטנדרטי למרכז השחלה ליד המלקחיים הסגורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגרור החללית לנתח דרך השחלה לכיוון בקוטב האחורי, שבו הביציות הבשלות (שלב 14 תאי ביצה) ממוקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1 - 3.4 2 - 5 פעמים בהתאם לגודל של השחלה ומספר הביצים. הערה: תוספת של CO 2 </sub&gt; בדרך כלל גורם בתצהיר של ביצה אחת אשר תופיע גדול עם נספחים הגבו עלה מאשר ביצים טרום שהופקד. ביצה זה אמור להיות מושלך הדמיה שכן הוא כבר הופעל בתוך גוף הנקבה. הערה: ביציות בשלות צפויות להפריד בקלות מן הרקמה החיבורית שחלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אין ביציות בשלות גלויות מחוץ השחלה, להמשיך מתגרה בעדינות עם החללית לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הביציות הבשלות גלויות על coverslip מחוץ השחלה, לתמרן 3 - 5 בשורה במרכז coverslip. הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הפעל את החללית בעדינות לאורך הצד של הביצים. הערה: הימנע משיכת הנספחים הגבי כמו זה יכול לגרום נזק ביצה. הערה: בהתאם הגדרת הדמיה בעתיד, ליישר את הביצים כ 200 מיקרומטר בנפרד בניצב coverslip לאזור הדמיה מקסימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מיושר, להסיר את שאר רקמת השחלה על ידי גרירתו מן הביצים מיושר באמצעות forceps. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עודף שמן בטופחו עם הפינה של רפואי לנגב. היזהר שלא לגעת ביציות בשלות עם רפואי לנגב ביציות בשלות כמו כי הם פנו יאבדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר crosshair על coverslip בטוש לפשט איתור המדגם תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את coverslip במקום בטוח ולהשאיר את תאי ביצה המוכנים על coverslip לנוח 5 - 10 דקות. זה מאפשר את הביצה להתיישב שמן. דוגמאות ניתן להשתמש עד 1 שעות שלאחר הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1 - 3.11 עבור שאר coverslips עם שחלות עליהם. </li></ol> 4. הכנות לקראת הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא חיץ הפעלה מוכן 15 לטמפרטורת חדר. הערה: חיץ ההפעלה היא חיץ hypotonic: 3.3 מ&quot;מ לאא 2 4 PO, 16.6 מ&quot;מ KH 2 4 PO, 10 mM NaCl, 50 מ&quot;מ KCl, 5% פוליאתילן גליקול 8000, 2 מ&quot;מ CaCl 2, הביא 6.4 pH עם 1: יחס 5 של NaOH: KOH.לפרטים נוספים, ראה Mahowald, 1983 15. Aliquots של חיץ הפעלה יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך חודשים על 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להעביר coverslips מוכן, חיץ הפעלה טפטפות זכוכית למתקן הדמיה. הערה: שדה רחב, confocal, דיסק מסתובב או מיקרוסקופ גיליון האור יכול לשמש. אנו ממליצים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. תוצאות הנציג שלנו התקבלו באמצעות מיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אובייקטיבי מתאים הדמיה ביצית בשלה כולו צריך להיבחר (כאן: 20X 0.7 NA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslip המוכן הראשון על במת מיקרוסקופ. יש להיזהר שלא לשבור את coverslips על הבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איכותי לבחור שדה הראייה עם תא ביצית בשלה עבור הפעלה. האם לא תאי ביצה נקבה תמונה או בעלי blebbing בקרום. הערה: צעדים 4.6 - 4.7, פקודות תוכנה תשתנינה בהתאם מיקרוסקופ ויצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פסק הדמית גדרמטרים עבור עירור GFP רגיל (488 ננומטר) ופליטה (500 - 580 ננומטר). גם הקים נוף שדה בהיר כדי לחזות להתמצא הביצה הבוגרת ושמן עקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את Z-המטוס הנמוך ביותר שבו ביציות בשלות גלויות ולהגדיר Z-מחסנית מלאה להילקח עבור 40 מיקרומטר בכ 2 מיקרומטר לכל צעד. הגדר את הפרמטרים כך שאין עיכוב בין רכישת מחסנית Z. הגדר את סדרת הזמן לתפוס כ -30 דקות. </li></ol> 5. הפעלת ביצת גופיים הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל לכידת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו 1 - מלא 2 Z- ערימות להירכש. זו מציגה את הביצית בשלה לפני ההפעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למשוך כ 300 μl של חיץ ההפעלה לתוך פיפטה מזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיצוב קצה פיפטה זכוכית המכיל חיץ ההפעלה בזווית של 45 מעלות מעל coverslip, לאט להזיז את פיפטה לתוך נתיב קרן עד שהוא ממש מעל להיות הדמיה ביצית בשלה. פיפטה הזכוכית צריכה2 ס&quot;מ מעל שמן - 1 להיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 - 2 טיפות של חיץ ההפעלה בתוך פחות מ -5 שניות מן פיפטה מזכוכית. זה אמור לתפוס את השמן. להימנע מהוספת חיץ הפעלה עודפת או נגיעת הביצה עם פיפטה הזכוכית כפי שהוא יכול לגרום לעקירה של הביצית בשלה. יש להיזהר שלא לגעת coverslip עם פיפטה כמו זה יכול לגרום לשינוי בועות מטוס או אוויר מוקדי להיווצר שמן טבילה בין המטרה לבין coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך הוספת חיץ הפעלה במהלך רכישת תמונה, בדוק את הערוץ בהיר שדה כדי להבטיח שהשמן הוחלף על ידי חיץ ההפעלה. הערה: זה יהיה ראשון להופיע כצל בשל פיפטה שבירה נתיב הקרן אלא גם יגרום להופעת טיפות שמן זעירות. כמה טיפות שמן יכול להישאר הקשורים ביצית בשלה שישפיע תוצאות הניסוי ואיכות תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם השמן לא שנעקר מהתוספת הראשונית של חוזרי חיץ הפעלת צעדי 5.4 - 5.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השמן הוא עקור בהצלחה, לאפשר הסדרת הזמן לרוץ עד לסיום. הערה: בשל נפיחות של ביציות בכל הפעלה, כמה תאי ביצה יעברו בדרמתיות מעל מישור המוקד או שדה הראייה על תוספת של חיץ הפעלה. במצב זה, להפסיק את הרכישה ואת הר coverslip הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר רצף התמונה השלים רכישה, לשמור את הנתונים. </li></ol> 6. לאחר רכישת עיבוד תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את מערך הנתונים באמצעות פיג&#39;י (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), או תוכנת עיבוד תמונה שווה ערך, ובחר את הקבצים הרלוונטיים לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבנות השלכה של הנתונים רכשו לבחור: תמונה&gt; סטאקס&gt; Z-פרויקט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פרוסה-Z התחלת א-פרוסת Z תחנה, בדרך כלל הקטע השלם. בחר סוג הקרנה, בדרך כלל מוגדר &#39;מקס עוצמה &quot;. בדוק תיבת הסימון &#39;בכל הזמנים Frames&#39; כדי להחיל את ההגדרות שנבחרו לסדרה כולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אםיותר מערוץ ניאון אחד כבר צילמו, השתמש בכלי ערוצים לאפשר תנועה בין צבעים, לבצע מרוכבים, או להפוך את גווני האפור בתמונה. כלי תמונה&gt; צבעים בוחרים&gt; ערוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתאים את בהירות התמונה ו בניגוד תמונה בחר&gt; התאם&gt; בהירות / ניגודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצא תמונה אחת, להעביר מחוון זמנים למסגרת רלוונטית בחר File&gt; Save As&gt; Jpeg, או כל פורמט מועדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מיקום וכותרת עבור הקובץ המיוצא, ולאחר מכן שמור. הערת קצב הפריימים מתוכנת ההדמיה יידרש לתת חותמת זמן על התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצא את סדרת הזמן כסרט לבחור: File&gt; Save As&gt; AVI, ולאחר מכן בוחר קצב פריימים (~ 7 פריימים לשניים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מיקום וכותרת עבור הקובץ המיוצא, ולאחר מכן שמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור את הקובץ המותאם בפורמט פיג&#39;י, בחר File&gt; Save. </li></ol>

<ol><li>Stricker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+biology+of+calcium+signaling+during+fertilization+and+egg+activation+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals.</a> Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).</li>
<li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitioning+from+egg+to+embryo%3A+triggers+and+mechanisms+of+egg+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation.</a> Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).</li>
<li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).</li>
<li>Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+inositol+trisphosphate-induced+calcium+release+mechanism+during+maturation+of+hamster+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes.</a> Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).</li>
<li>Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wave+of+free+calcium+at+fertilization+in+the+sea+urchin+egg+visualized+with+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).</li>
<li>Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+sperm-induced+calcium+wave+in+Xenopus+eggs+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy.</a> Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).</li>
<li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%3A+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J Physiol. 578, (Pt 1) 55-67 (2007).</li>
<li>Douglass, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDouglass%2C+A+%22New+Techniques+in+Systems+Neuroscience%22">New Techniques in Systems Neuroscience</a>. , Springer. (2015).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li>
<li>Kaneuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+occur+as+Drosophila+oocytes+activate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).</li>
<li>York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+and+rapid+calcium+wave+at+egg+activation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila.</a> Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).</li>
<li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li>
<li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li>
<li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+by+osmotic+and+hydrostatic+pressure+activates+Drosophila+oocytes+in+vitro+in+a+calcium-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner.</a> Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li>
<li>Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22JoVE+Science+Education+Database%22">JoVE Science Education Database</a>. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).</li>
<li>Melom, J. E., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+a+NCKX+Eliminates+Glial+Microdomain+Calcium+Oscillations+and+Enhances+Seizure+Susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility.</a> J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).</li>
<li>Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+flows+powered+by+asymmetrical+contraction+transport+PAR+proteins+to+establish+and+maintain+anterior-posterior+polarity+in+the+early+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo.</a> Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).</li>
<li>Maruyama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGG-3+regulates+cell-surface+and+cortex+rearrangements+during+egg+activation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).</li>
<li>Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+normal+actin+cytoskeletal+reorganization+affects+cell+cycle+time+in+fertilized+sea+urchin+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs.</a> Mol Biol Cell. 15, 23(2004).</li>
<li>Horner, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+calcipressin+sarah+is+required+for+several+aspects+of+egg+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation.</a> Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

השלב הקריטי הראשון בפרוטוקול זה הוא בידוד הביציות הבוגרות ללא נזק. ניתן להשיג זאת על ידי תמרון גויים של הביצים עם בדיקת הניתוח. תרגול יאפשר לבצע מניפולציה זו ללא נזק לביציות. שלב מכריע שני הוא הימנעות מאובדן הדגימה כאשר מפעילים מאגר הפעלה על הביצה הבוגרת בשמן. יישום מאגר ההפעלה צריך להיעשות לאט וללא מגע עם הכיסוי. שלב זה יכול להיות מאתגר אם הגדרת המיקרוסקופ אינה מאפשרת גישה נוחה לדגימה. רצוי להזיז חלקים מבית השחי של המיקרוסקופ, כגון חממת טמפרטורה. 
ניתן לבצע שינויים בפרוטוקול זה על מנת לדמיין גורמים אחרים המתויגים פלואורסצנטית, במקום Ca2+ בעת הפעלת הביצית. באופן כללי יותר, ניתן לנתח שלבים שונים של התפתחות דרוזופילה או את התוצאות של הוספת מאגר אחר באמצעות פרוטוקול זה. 
ייתכן שיידרש פתרון בעיות אם ההגדרות במיקרוסקופ אינן אופטימליות להמחשת האות מהדגימה. ניתן להשיג זאת על ידי הגדלה או הקטנה של עוצמת הלייזר, שינוי טווח הלכידה והתאמת פרמטרי Z-stack. בעיה נוספת עשויה להיות ביצים שיוצאות באופן עקבי משדה הראייה עם הוספת מאגר ההפעלה. אם זה קורה באופן קבוע, אפשר לביצים הבוגרות להתיישב על החלקות הכיסוי לפרק זמן ארוך יותר, 15 עד 20 דקות. היזהר ששימוש בשמן בעל צמיגות גבוהה יותר ישנה את תזוזה של השמן על ידי מאגר הפעלה. 
טכניקה זו המוצגת כאן מוגבלת על ידי מרחק העבודה של המטרה, התייבשות הביצים הבוגרות והיכולת לנתח את הביצים הבוגרות ללא נזק. עם זאת, בהשוואה לשיטות הדמיה in vivo שבהן הביצית הבוגרת עוברת דרך הנקבה הבוגרת ומופקדת 13, השיטה שלנו מאפשרת רזולוציה מרחבית רבה יותר, אפשרות לתפעל פיזית את הביצית הבוגרת לפני ההפעלה ויכולת לבדוק את תפקיד הפעלת הביצית ללא הפריה. 
ישנם יישומים עתידיים פוטנציאליים רבים של טכניקה זו, כולל בדיקת מבני מדווח לרכיבים תאיים בהפעלת ביצית והדמיה של גל Ca2+ על רקע מוטנטי 14,24. יחד עם כלים ניסיוניים וגנטיים, מבחן הפעלת הביציות ex vivo המוצג כאן מאפשר לחקור את ההשפעות של הטריגר, ההתפשטות וההשפעות במורד הזרם של גל Ca2+ השמור באופן אוניברסלי.

שינוי Ca 2 + ריכוז התאי על הפעלת ביצה (ביצית) הוא מרכיב משומר של כל היצורים שנחקרו 1,2. אירוע זה יוזם מגוון רחב של התהליכים התלויים 2+ Ca, כולל חידוש של מחזור התא ותרגום של mRNAs מאוחסן. בשל דרישה זו עבור Ca 2 +, לדמיין את השינויים החולפים בריכוזים תאיים Ca 2 + כבר עניין מפתח. מבחינה היסטורית, אורגניזמים מודל נבחרו מחקרים על הפעלת ביצה בהתבסס על גודל וזמינות של ביציהן. גישות להדמיה שונות כבר נוצלו לעקוב ולכמת שינויים התאי Ca 2 + ריכוזים במערכות אלה, ובכלל זה: aequorin photoprotein בדגי medaka 3; Ca צבעי ניאון 2 + רגישים כגון פורעה-2 ב קיפוד ים ו אוגר 4,5; וסידן ירוק-1-dextran ב Xenopus 6. הדור ושיפור אינדיקטורים סידן מקודדים הגנטי (GECIs) שינה את היכולת לדמיין Ca 2+ דינמיקת in vivo 7. הבונה הגנטית אלה באים לידי ביטוי ברקמות ספציפיות ולהגביל את צורך הכנות רקמות פולשנית 8. GCaMPs הוא חלבון פלואורסצנטי ירוקה (GFP) בכיתה מבוססת של GECIs שהיה מאוד יעיל, בשל הזיקה הגבוהה Ca 2+ שלהם, יחס אות לרעש ואת היכולת להיות מותאם אישית 9-11. בנוכחות של Ca 2 +, במתחם GCaMP עובר סדרה של שינויים מרחביים, החל עקידת Ca 2+ כדי calmodulin, שתוצאתה היא עוצמת פלורסנט מוגברת של רכיב ה- GFP 9. GCaMPs נעשה שימוש נרחב במחקר על נוירונים תסיסנית לדמיין שינויי סידן התאי 12. Applicati האחרונהעל הטכנולוגיה GCaMP לדמיין Ca 2 + ביצים תסיסנית בוגרת גילה גל יחיד Ca 2 + חולף על הפעלת ביצה 13,14. גל Ca 2+ ניתן דמיין בהגדלה נמוכה בזמן ביוץ in vivo 13 או בהגדלה גבוהה יותר באמצעות assay הפעלת vivo לשעבר 13,14. ב assay vivo לשעבר, ביציות בוגרות בודדות מבודדות מן השחלות והופעלו באמצעות פתרון hypotonic, המכונה חיץ הפעלה, אשר הוכח לשחזר את אירועי in vivo הפעלת 15-17. Assay vivo לשעבר זו מאפשר ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה הקלה של גל Ca 2+ תחת תנאי ניסויים שונים כולל שיבוש תרופתי, מניפולציות פיסיות מוטציות גנטיות. מאמר זה מדגים הכנת ביצים תסיסנית בוגרת vivo לשעבר הפעלה הדואר עוקבת מיקרוסקופיה רגילה לחזות גל Ca 2+ באמצעות GCaMP. גישה זו יכולה לשמש כדי לבחון את החניכה ובקר על גל Ca 2 + ו לחקור תוצאות במורד זרם.

<table><tbody><tr><td>שמרים פעילים יבשים</td><td>פליישמן' s</td><td>#2192</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>שונים יעבדו</td></tr><tr><td>מנורת</td><td>Mircotec סיבים אופטיים</td><td>MF0-90</td><td>שונים יעבדו</td></tr><tr><td>מגבונים רפואיים</td><td>תאגיד קימברלי-קלארק</td><td>KLEW3020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>עט סמן</td><td>Stabilo</td><td>841/46</td><td>OHPen אוניברסלי, שחור - זמין ברוב החנויות הנייחות. רוחב דק במיוחד 0.4 מ"מ</td></tr><tr><td>CO2 pad</td><td>&nbsp; Genesee Scientific</td><td>59-114 (789060 Dutscher)</td><td></td></tr><tr><td>תלוש כיסוי מס' 1.5, 22 x 50 מ"מ</td><td>בינלאומי- No1-VWR Cat=631-0137-22-50 מ"מ</td><td>מנזל-גלזר-22-50 מ"מ-MNJ 400-070T&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>שמן הלוקרבון, סדרה 95</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td>מפיץ באירופה:</td><td></td></tr> <tr><td>Solvadis (GMBH)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>שמן 10 S</td><td>VWR כימיקלים</td><td>24627.188</td><td>ניתן להשתמש במקום שמן הלוקרבון, סדרה 95</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>בעוד שכלים אלה צריכים להיות נקיים, אין צורך בשימוש בחיטוי, אתנול יספיק.</td></tr><tr><td>Probe</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה מזכוכית</td><td>פישרברנד,</td> <td>FB50251</td><td>פיפטות פסטר, זכוכית, לא מחובר, אורך 150 מ"מ&nbsp;</td></tr><tr><td>בקבוקון</td><td>רג'ינה תעשיות</td><td>P1014</td><td>GPPS&nbsp; 80 מ"מ x 25 מ"מ</td></tr></tbody></table>

סידן הדמיה ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; ב ביצת הפעלה

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

הפעלת ביצית היא תהליך אוניברסלי הכולל סדרה של אירועים המאפשרים לביצית המופרית להשלים מיוזה וליזום התפתחות עוברית. היבט אחד של הפעלת ביציות, שנשמר בכל האורגניזמים שנבדקו, הוא שינוי בריכוז התוך תאי של סידן (Ca2+) המכונה לעתים קרובות 'גל Ca2+'. בעוד שהמהירות ומספר התנודות של גל Ca2+ משתנים בין המינים, השינוי ב-Ca2+ התוך-תאי הוא המפתח בהבאת אירועים חיוניים להתפתחות העוברית. שינויים אלה כוללים חידוש מחזור התא, ויסות mRNA, אקסוציטוזיס גרגיר קליפת המוח וסידור מחדש של השלד הציטולוגי.
בביצית הדרוזופילה הבוגרת, ההפעלה מתרחשת בביצית הנקבית לפני ההפריה, ויוזמת סדרה של אירועים תלויי Ca2+. כאן אנו מציגים פרוטוקול להדמיית גל Ca2+ בדרוזופילה. גישה זו מספקת מערכת מודל הניתנת למניפולציה כדי לחקור את המנגנון של גל Ca2+ ואת השינויים במורד הזרם הקשורים אליו.

כאן אנו מדגימים כיצד להכין ביצים תסיסנית בוגרת הפעלת vivo לשעבר. ביצים להביע הדמיה לאפשר Geci של Ca 2 + הדינמיקה בבית ההפעלה ביצה ותחילת ההתפתחות העוברית (איור 1). יצוין כי בהתאם GCaMP בשימוש, במיוחד בנוכחות קבוצת myristoyl, תוצאות עשויות להיות הבדלים איכותיים קלים 13 14. יש לנו גם הפגין תפקיד עבור אקטין תפקודי במהלך הפעלת ביצה על ידי התוספת של מעכב פילמור יקטין, cytochalasin D, למאגר ההפעלה (איור 2) 14. דרישת שלד התא ב הפעלת ביצה נשמרת. ב C. elegans, לאחר הפריה, רכיבי cytoskeletal הם מחדש להכין את העובר-תא אחד לחלוקת הסימטרית הראשונה 21,22. בשנת קיפוד ים, שיבוש cytoskeletal-ארגון מחדש לאחר ההפעלה הוכח להשפיע על מחזור התא על ידי מניעת טבעת התכווצות היווצרות 23. תפקידיו של תקטין בתיווך גל Ca 2+ ותפקוד ההמשך שלה ב הפעלת ביצת תסיסנית נשארו הובהרו באופן מלא. ב תסיסנית, שיתוף להדמיה של שלד התא Ca 2 + גל אקטין יכולה להיות מושגת באמצעות assay ההפעלה vivo לשעבר זה. סדרת זמן של ערוצים מרובים ניתן לרכוש ודינמיקה של Ca התאי 2+ ניתן להתאים עם שינויים בארגון יקטין הביצית (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> איור 1:. גל אחד Ca 2 + ב תסיסנית ביצה הפעלת סדרת זמן של vivo לשעבר בוגרת ביצה תסיסנית להביע UASt- myrGCaMP5 הבאים אddition של חיץ ההפעלה (AH). העלייה Ca ציטופלסמית 2+ מקורו בקוטב האחורי (ב &#39;) מתפשטת (BF) עם מהירות ממוצעת של כ -1.5 מיקרומטר / sec. ייזום של גל בדרך כלל הוא ציין בתוך 3 דקות של תוספת של חיץ ההפעלה. בעקבות ההפעלה, רמות סידן תאיים של ביצית בשלה חוזר טרום הפעלת רמות (G, H). ראה השלים סרט 1 (דקות בסה&quot;כ זמן 33). ברי סולם = 50 מיקרומטר. מקס הקרנה = 40 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> איור 2: תוספת של Cytochalasin D כדי הפעלת מאגר מדאיג Ca2 + גל רביה. סדרת זמן של vivo לשעבר בוגרת ביצה תסיסנית להביע UASt- myrGCaMP5 הבאים תוספת של חיץ ההפעלה המכיל 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל cytochalasin D הריכוז הסופי (AH). בעוד גל Ca 2+ הוא יזם בקוטב האחורי (א), זה נפגע ואינו להגיע הקדמי של הביצה (F) (ראשי החץ לבנים מציינים חלק הקדמי של הגל). אין עוד שינויי Ca 2 + נצפו למעלה מ -30 דקות). ראה השלים סרט 2 (דקות בסה&quot;כ זמן 30). ברי סולם = 50 מיקרומטר. מקס הקרנה = 40 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> איור 3: Co-להדמיה של אקטין Ca 2 + ב Eהפעלת gg תסיסנית. סדרת זמן של vivo לשעבר בוגרת ביצה תסיסנית להביע UASt- myrGCaMP5 (ציאן) ו UASp -f-Tractin.tdTomato (מגנטה) התוספת הבאה של חיץ ההפעלה (AH). גל Ca 2+ יוזם מהקוטב האחורי ומשחזר כמו באיור 1. תקטין נראה שינוי לאורך זמן, ראשי חץ לבנים (A נגד H). העדר זיהוי אותות Ca 2 + במרכז ביצית בשלה הוא עקב תנועה של המדגם במהלך לכידת תמונה. ברי סולם = 50 מיקרומטר. מקס הקרנה = 40 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

מאמר זה מתאר פרוטוקול לשעבר vivo להתאמה המאפשר הדמיה Ca 2+ במהלך ההפעלה ביצה תסיסנית.

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדמיות של סידן במהלך הפעלת הביצית ב-Drosophila melanogaster. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית, כגון מהם המקור, הדינמיקה והתפקידים הבאים לזרם (downstream) של הסידן בעת הפעלת הביצית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם אפשרות לרזולוציה מרחבית גבוהה יותר, מניפולציה פיזית של הביצית הבשלה לפני ההפעלה, ובחינת תפקידה של הפעלת הביצית ללא הפריה.באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בבידוד הביצים הבשלות ללא גרימת נזק, ובהחלת באפר אקטיבציה על הביצה הבשלה מבלי לאבד את הדגימה. כדי להתחיל בהליך זה, הגדירו את ההגדלה של מיקרוסקופ הסטריאו ל-4X. בכיסוי זכוכית ראשון, הפרידו בין שתי השחלות על ידי קריעת צינור הביצות בעזרת פינצטה סגורה ופרוב נתיחה, תוך הקפדה לא לנקב אף אחד מתיבת הביצים.לאחר מכן, הכניסו מחט דיסקציה סטנדרטית למרכז השחלה, לצד הפינצטה הסגורה. גררו בעדינות את מחט הדיסקציה דרך השחלה, לכיוון הקוטב האחורי, שם נמצאים הביצים הבשלות. ברגע שהביצים הבשלות נראות על זכוכית המכסה מחוץ לשחלה, סדרו שלוש עד חמש מהן בשורה במרכז.בשלב הבא, הסירו את שאר רקמת השחלה על ידי גרירתה הרחק מהביצים המסודרות. לאחר מכן, הסירו עודפי שמן על ידי טפיחה עם פינה של מגב רפואי. שרטטו סימון של כוונת (crosshair) על זכוכית המכסה בעזרת מרקר כדי לאתר את הדגימה תחת המיקרוסקופ.לאחר מכן, השאירו את תאי הביצים שהוכנו על לביבת הזכוכית למשך חמש עד 10 דקות כדי לאפשר לביצים לשקוע בשמן. הביאו למתקן הדימוג את לביבות הזכוכית המוכנות, את באפר ההפעלה בטמפרטורת החדר ופיפטות זכוכית. בחרו עדשה מתאימה לדימוג של הביצה הבשלה בשלמותה.לאחר מכן, מקמי את כיסית הזכוכית הראשונה שהוכנה עלבמת המיקרוסקופ. לאחר מכן, בחרי שדה ראייה של לשכת ביצית בוגרת לצורך הפעלה. הגדירי את פרמטרי הדימות עבור עירור ופליטה סטנדרטיים של GFP.לאחר מכן, הגדירו תצוגת שדה בהיר (bright field) כדי להדמיז ולכוון את הביצה הבשלה ואת השמן שהוזז. כעת, בחרו את מישור ה-Z הנמוך ביותר שבו הביצים הבשלות נראות. הגדירו צילום Z-stack מלא למרחק של 40 micrometers, במרווחים של two micrometers לכל שלב.לאחר מכן, הגדירו את סדרת הזמנים לצילום תמונות למשך 30 דקות. בהליך זה, התחילו בצילום התמונות, ורכשו אחת עד שתיים של ערימות Z מלאות (Z-stacks) כדי להציג את הביצית הבשלה לפני ההפעלה. לאחר מכן, שאבו כ-300 µL של תמיפת הפעלה (activation buffer) לתוך פיפטת זכוכית.מקמו את קצה פיפט הזכוכית המכילה את תמיסת ההפעלה (activation buffer) בזווית של 45 מעלות מעל לכיסוי הזכוכית (coverslip), והזיזו את הפיפט באיטיות אל נתיב הקרן, עד שיהיה ישירות מעל הביצית הבשלה המצולמת. הוסיפו טיפה אחת עד שתיים של תמיסת ההפעלה בתוך פחות מחמש שניות, כדי לדחוק את השמן. יש להוסיף טיפה אחת עד שתיים של תמיסת ההפעלה בזווית הנכונה, בעדינות ובמהירות.בעת הוספת תמיסת אקטיבציה במהלך רכישת התמונה, יש לבדוק את ערוץ השדה המואר (bright-field) כדי לוודא שהשמן נדחף. לאחר שהשמן נדחף בהצלחה, יש להמתין עד לסיום סדרת הזמנים. כדי ליצור היטל של הנתונים שנרכשו, יש לבחור פרוסת Z התחלה ופרוסת Z סיום עבור החתך כולו.לאחר מכן, בחרו סוג היטל, לדוגמה, עצימות מקסימלית (maximum intensity). לאחר מכן, סמנו את תיבת הבחירה All time frames כדי להחיל את ההגדרות שנבחרו על הסדרה כולה. כדי לכוונן את בהירות התמונה והניגודיות, בחרו ב-Image, לאחר מכן ב-Adjust, ולאחר מכן ב-Brightness/Contrast.כדי לייצא את סדרת הזמנים כסרטון, בחרו ב-File, לאחר מכן ב-Save As, ולאחר מכן ב-AVI. לאחר מכן, בחרו את קצב הפריימים. מוצגת כאן סדרת זמנים של ביצת Drosophila בוגרת ex vivo המבטאת אינדיקטור סידן מקודד גנטית לאחר הוספת תמיסת הפעלה (activation buffer).העלייה בריכוז הסידן הציטופלזמי מתחילה בקוטב האחורי, ואז מתפשטת במהירות ממוצעת של כ-1.5 micrometers per second. התחלת הגל נצפית בדרך כלל בתוך שלוש דקות מהוספת בופר ההפעלה. לאחר ההפעלה, רמות הסידן התוך-תאיות של הביצית הבשלה חוזרות למצבן הרגיל.ב-Drosophila, ניתן להשיג ויזואליזציה משולבת של גל הסידן ושל שלד האקטין באמצעות בדיקת הפעלה ex vivo זו. נראה כי האקטין משתנה לאורך זמן, כפי שמוצג על ידי ראשי החצים הלבנים. היעדר גילוי של אות סידן במרכז הביצה הבשלה נובע מתזוזת הדגימה במהלך לכידת התמונה.לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע את כל הטכניקה הזו בפחות משעה, במידה שהיא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לפעול בסבלנות בעת תמרון תאי הביצים, ובעת הגדרת הפרמטרים לרכישת הנתונים. ניתן להתאים פרוצדורה זו להדמיה של חלבונים אחרים המסומנים פלואורסצנטית, אבניות או אינדיקטורים של סידן בעת הפעלת הביצה.דבר זה עשוי לסייע במתן מענה לשאלות הנוגעות למקור הסידן ולהשפעות הנגזרות ממנו.

imaging-calcium-in-drosophila-at-egg-activation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מתארים טכניקה הוקמה כדי למדוד ולנתח ריח עוררו תגובות סידן באונה מחושים...

סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

סרטון זה מתאר הדמיית סידן in vivo בנוירונים דרוזופילה באמצעות GCaMP. סרטון הפרוטוקול המוצג מראה כיצד לתעד שינויים בפלואורסצנטיות GCaMP מנוירונים בגוף פטריות במהלך ניסוי מיזוג ריח.

דרוזופילה אין ויוו דימות סידן: שיטה לדימות פונקציונלי של פעילות עצבית

סרטון זה מדגים טכניקה להדמיית סידן בתאי עצב בודדים של Caenorhabditis elegans המתנהגים באמצעות חלבוני כתב פלואורסצנטיים מקודדים גנטית. הוא מתאר את השלבים המעורבים בהדמיית תנועת תולעים ומדידת יחסי פלואורסצנטיות של כתב מתאי עצב כדי לקשר בין רמות הסידן התוך-תאיות לפעילות עצבית ושינויים התנהגותיים במהלך הטלת ביצים.

הדמיית סידן בתאי עצב בודדים המווסתת את התנהגות הטלת הביצים ב- Caenorhabditis elegans

מקור: Ishimoto, H. et. al., הדמיית סידן ex vivo להמחשת תגובות המוח לאיתות אנדוקריני בדרוזופילה. J. Vis. exp. (2018)}{{}}} {{}}} סרטון זה מדגים הדמיית סידן למחקרDrosophila תגובות מוח לנוירופפטידים. נוירונים המבטאים אינדיקטור סידן פלואורסצנטי חושפים דינמיקת סידן תוך תאית ותגובות תפקודיות למולקולות איתות.

הדמיית סידן ex vivo לחקר תגובות המוח של דרוזופילה לנוירופפטידים

שיטת ההדמיה הזקופה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת הדמיה מפורטת של הקטבים של ביצית דרוזופילה מלנוגסטר מתפתחת.  מבט מקצה לקצה זה מספק פרספקטיבה חדשה על הסידורים והמורפולוגיה של סוגי תאים מרובים באפיתל הזקיקים.

הדמיה זקופה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; לשכות ביצה

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור ex-vivo סידן הדמיה של המוח דרוזופילה . בשיטה זו, תרכובות טבעי או סינתטי ניתן להחיל את המאגר כדי לבחון את היכולת שלהם להפעיל את המסוים הנוירונים במוח.

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

כאן אנו מציגים פרוטוקול שבו ניתן לדמיין את הסידן הטרום ו/או הפוסט-סינפטיות בהקשר של למידה וזיכרון של דרוזוהילה . בשנת הדמיה vivo סידן באמצעות synaptically חיישנים סידן מקומי משולב עם הפרדיגמה הקלאסית מיזוג ריח כגון הפלסטיות הסינפטית הבסיסית בבסיס סוג זה של למידה אסוציאטיבית עשוי להיקבע.

ב-Vivo סידן הדמיה אופטית של למידה הנגרמת הפלסטיות הסינפטית בדרוזופילה מלאנוסטר

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לגילוי ולוקליזציה של חלבון עובר Drosophila ו- RNA מאוסף להטבעה והטבעה מראש, אימונוסטיור ו- mRNA בהכלאה במקום .

פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והפצת RNA In-situ בתוך עובר דרוזופילה מוקדם

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 לניטור פעילויות אפילפטיפורמיות. הפרוטוקול מספק כלי רב ערך לחקר אירועים איקטליים בדרוזופילה בוגרת באמצעות הדמיית סידן ex vivo , המאפשר לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של אפילפסיה ברמה התאית.

אקס ויוו הדמיית סידן למודל דרוזופילה לאפילפסיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים וכלים להמחשת סידן במהלך הפריה ועובריות מוקדמות באמצעות מדווח סידן מקודד גנטית המתבטא בקו הנבט של נמטודת המודל C. elegans.

הדמיה in vivo של מעברי סידן במהלך הפריה והתפתחות מוקדמת ב - C. elegans

אנו מציגים פרוטוקולי הדמיית סידן עבור נוירון ריח של זחל דרוזופילה, באמצעות דבק רקמות מקומי לקיבוע. שיטה זו משפרת את היציבות, ומאפשרת ניסויים אמינים in vivo ו-ex-vivo. סקריפטים מותאמים אישית של R מנתחים אותות סידן, ומספקים פלטפורמה יעילה למחקר נוירופיזיולוגי מפורט.

הדמיית סידן in vivo ו-ex-vivo של נוירון במעגל הריח בזחל Drosophila melanogaster בכוכב השלישי

חקור דינמיקת סידן בהפעלת ביצה ב-Drosophila melanogaster באמצעות פרוטוקול ex vivo. שיטה זו מאפשרת רזולוציה מרחבית גבוהה ומיפוי גלי סידן בביולוגיה התפתחותית.

סידן הדמיה ב

גלה סרטונים נוספים