סידן הדמיה ב תסיסנית ב ביצת הפעלה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין סידן במהלך הפעלת ביצית ב-Drosophila melanogaster. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית, כגון מהו המקור, הדינמיקה והתפקידים במורד הזרם של הסידן בהפעלת הביצית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם לאפשר רזולוציה מרחבית גבוהה יותר, מניפולציה פיזית של הביצית הבוגרת לפני ההפעלה, ובדיקת תפקיד הפעלת הביצית ללא הפריה.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו לבודד את הביציות הבוגרות ללא נזק, ולהפעיל חיץ הפעלה על הביצה הבוגרת מבלי לאבד את הדגימה. כדי להתחיל בהליך זה, הגדר את ההגדלה של המיקרוסקופ המנתח ל-4X. בכיסוי הראשון, הפרד את שתי השחלות על ידי קריעת צינור הביצית עם זוג מלקחיים סגורים ובדיקה לניתוח, תוך הקפדה לא לנקב תאי ביצים.

לאחר מכן, הכנס בדיקת ניתוח סטנדרטית למרכז השחלה, ליד המלקחיים הסגורים. גרור בעדינות את בדיקת החיתוך דרך השחלה, לכיוון הקוטב האחורי, שם ממוקמות הביציות הבוגרות. ברגע שהביציות הבוגרות נראות על הכיסוי מחוץ לשחלה, תמרנו שלוש עד חמש מהן בקו במרכז.

לאחר מכן, הסר את שאר רקמת השחלה על ידי גרירתה הרחק מהביציות המיושרות. לאחר מכן, הסר עודפי שמן על ידי טפיחה בפינת מגבון רפואי. צייר כוונת על הכיסוי עם טוש כדי לאתר את הדגימה מתחת למיקרוסקופ.

לאחר מכן, השאירו את תאי הביצים המוכנים על הכיסוי לנוח במשך חמש עד 10 דקות כדי לאפשר לביצים להתיישב בשמן. הביאו למתקן ההדמיה את פתקי הכיסוי המוכנים, מאגר ההפעלה בטמפרטורת החדר ופיפטות הזכוכית. בחר מטרה המתאימה להדמיית הביצית הבוגרת כולה.

לאחר מכן, התקן את הכיסוי המוכן הראשון על שלב המיקרוסקופ. לאחר מכן, בחר שדה ראייה של תא ביצים בוגר להפעלה. הגדר את פרמטרי ההדמיה עבור עירור ופליטה סטנדרטיים של GFP.

לאחר מכן, הגדר תצוגת שדה בהירה על מנת לדמיין ולכוון את הביצה הבוגרת והשמן העקור. כעת, בחר את מישור ה-Z הנמוך ביותר שבו הביצים הבוגרות נראות לעין. והגדר ערימת Z מלאה שתילקח ל-40 מיקרומטר בשני מיקרומטר לכל שלב.

לאחר מכן, הגדר את סדרת הזמן לצילום התמונות למשך 30 דקות. בהליך זה, התחל לצלם תמונה ורכוש ערימת Z אחת עד שתיים מלאות כדי להציג את הביצית הבוגרת לפני ההפעלה. לאחר מכן, משוך כ-300 מיקרוליטר של מאגר הפעלה לתוך פיפטה מזכוכית.

מקם את קצה פיפטת הזכוכית המכילה מאגר הפעלה בזווית של 45 מעלות מעל החלקת הכיסוי, והעבר לאט את הפיפטה לנתיב האלומה, עד שהיא נמצאת ישירות מעל הביצה הבוגרת המצולמת. הוסיפו טיפה אחת או שתיים של מאגר הפעלה בפחות מחמש שניות, כדי לעקור את השמן. הוספה של טיפה אחת עד שתיים של מאגר הפעלה צריכה להיעשות בזווית הנכונה, בעדינות ובמהירות.

בעת הוספת מאגר הפעלה במהלך רכישת התמונה, בדוק את ערוץ השדה הבהיר כדי לוודא שהשמן נעקר. לאחר שהשמן נעקר בהצלחה, אפשר לסדרת הזמן לפעול עד לסיום. כדי לבנות הקרנה של הנתונים שנרכשו, בחר פרוסת Z התחלתית ופרוסת Z עצירה עבור כל הקטע.

לאחר מכן, בחר סוג הקרנה, לדוגמה, עוצמה מקסימלית. לאחר מכן, סמן את תיבת הסימון כל מסגרות הזמן כדי להחיל את ההגדרות שנבחרו על כל הסדרה. כדי לכוונן את הבהירות והניגודיות של התמונה, בחרו 'תמונה', לאחר מכן 'התאם', ולאחר מכן בחרו 'בהירות/ניגודיות'.

כדי לייצא את סדרת הזמנים כסרט, בחר/י ״קובץ״ ולאחר מכן ״שמור בשם״ ולאחר מכן AVI. לאחר מכן, בחר את קצב הפריימים. מוצגת כאן סדרת הזמן של ביצת דרוזופילה בוגרת ex vivo המבטאת אינדיקטור סידן מקודד גנטית לאחר הוספת מאגר הפעלה.

העלייה בסידן הציטופלזמי מקורה בקוטב האחורי, ואז מתפשטת במהירות ממוצעת של כ-1.5 מיקרומטר לשנייה. התחלת הגל נצפית בדרך כלל תוך שלוש דקות מהוספת מאגר ההפעלה. לאחר ההפעלה, רמות הסידן התוך תאיות של הביצית הבוגרת מתאוששות.

בדרוזופילה, ניתן להשיג הדמיה משותפת של גל הסידן ושלד הציטו אקטין באמצעות מבחן הפעלה ex vivo זה. נראה שהאקטין משתנה עם הזמן, כפי שמצוין על ידי ראשי החצים הלבנים. היעדר זיהוי אות סידן במרכז הביצית הבוגרת נובע מתנועת הדגימה במהלך צילום התמונה.

לאחר שליטה, ניתן לבצע את כל הטכניקה הזו פחות משעה, אם מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לקחת את הזמן בעת תמרון תאי הביצים, ובעת הגדרת הפרמטרים לרכישה. ניתן להתאים הליך זה להמחשת חלבונים, אברונים או מדדי סידן אחרים המסומנים בפלורסנט בעת הפעלת הביצית.

זה יכול לעזור לענות על שאלות הנוגעות למקור הסידן וההשפעות במורד הזרם.