שיטה של ​​בידוד תא ממוקד באמצעות Functionalization משטח הזכוכית

המטרה הכללית של תהליך פונקציונליזציית משטחי הזכוכית היא לאפשר לכידה ושחרור עדינים של תאי העניין. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מרכזיות בתחום של אנגיוגנזה גידולית, והיא מאפשרת סריקה של סמני תאים (biomarkers) המעידים על עמידות לתרופות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא ניתנת להתאמה מלאה עבור כמעט כל סוג תא רלוונטי.

כל עוד קיים נוגדן ספציפי לסוג התא, ניתן להתאים את הפני השטח ללכידתו. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי אנגיוגנזה בסרטן, ניתן להחילה גם על מחלות אחרות, שכן דגימות מטוהרות נחוצות לפיתוח משטרי טיפול מותאמים אישית יותר. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר ניסינו לפתח מנגנון שחרור הפיך ללכידת תאים, תוך שימוש באינטראקציה בין desthiobiotin למשפחת ה-adivin.

לאחר ניקוי משטח זכוכית במכונת פלסמה של חמצן למשך חמש דקות בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכינו 2.5 מיליליטר של תמיסת 3-Aminopropyl triethoxysilane, או APTES, בריכוז 2% לאחר שחזור, על ידי ערבוב של 50 מיקרוליטר של APTES ו-2.45 מיליליטר של אתנול בפסולת קונית (conical tube). העבירו בעזרת פפטה את תמיסת ה-APTES למשטחי הזכוכית, לאחר מכן כסו את המשטחים והניחו אותם על שייקר פלטפורמה בטמפרטורת החדר למשך 50 דקות כדי להבטיח פיזור אחיד של שכבת ה-APTES. בינתיים, חממו מראש את התנור ל-55 מעלות צלזיוס עבור פלטות בעלות 8 ו-24 בארות, או ל-90 מעלות צלזיוס עבור צלחות זכוכית.

לאחר הוצאת הפלטות מהמנער, שטפו את משטחי הזכוכית באתנול בהתאם לפרוטוקול הכתוב. ייבשו את המשטחים באמצעות גז חנקן 100%. לאחר מכן, הכניסו את הפלטות בעלות 8 ו-24 בארות לתנור למשך שעתיים, או את צלחות הזכוכית לתנור למשך שעה אחת.

בשלב הבא, הכינו 2.5 milliliters של d-Desthiobiotin, או תמיסת DSB, על ידי ערבוב של 1.5 milligrams per milliliter של DSB ב-37.5 µL של DMSO, והוספה של 5 milligrams per milliliter של EDC ל-2,462.5 µL של MES buffer בריכוז 0.1 M, pH 6. לאחר מכן, שלבו את שתי התמיסות. לאחר 15 דקות, הוסיפו 1 µL של BME כדי לעצור את התגובה בין DSB ל-EDC.

הוצא את משטחי הזכוכית החמים שעברו פונקציונליזציה ב-APTES מהתנור, והשאר אותם להתקרר למשך חמש עד 10 דקות. הוסף MES buffer למשטחי הזכוכית כדי לשטוף אותם, תוך החזקת הפ pipette בזווית של 70 מעלות כך שהחוד לא יופנה ישירות אל המשטח. לאחר מכן, רוקן ושאב את הבאפר מנקודה קבועה, כגון פינת הבאר.

לאחר מכן, השתמשו בבופר MES לשטיפה פעמיים נוספות. מרחו תמיסת DSB על משטחי הזכוכית. העבירו אותם לנייר סופג לח בתוך צלח פטרי, כסו את הצלח והדגירו במקרר למשך 18 עד 24 שעות.

לאחר הדגירה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, השתמשו ב-PBS כדי לשטוף כל משטח זכוכית שלוש פעמים, כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. לאחר מכן, דללו את תמיסת המקור של Streptavidin, או SAV, לריכוז של 0.4 milligrams per milliliter, ומרחו אותה באופן אחיד על משטחי הזכוכית כך שייווצר שכבה דקה. לאחר הדגירה של הזכוכית למשך 18 עד 24 שעות, השתמשו ב-150 microliters של PBS כדי לשטוף כל משטח שלוש פעמים.

לאחר מכן, הרטיבו נייר סופג במים ד-יוניים והניחו אותו בצורה שטוחה בתוך צלחת פטרי בקוטר 14 סנטימטרים סביב הפלטות כדי לשמר לחות בבארות. כסו את צלחת הפטרי עם משטחי הזכוכית, והניחו אותה במקרר בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס ברמת בטיחות ביולוגית 1 (biosafety Level 1) עד למועד השימוש. לצורך ביצוע לכידת התאים, שאבו את המצע מבקבוקי תרבית T175 של תאים.

לאחר מכן, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים ושאב את הבופר. הוסף לבקבוק 10 milliliters של חומר הרמה לא-אנזימטי, כגון Cell Dissociation Solution. לאחר מכן, דגור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שש דקות.

לאחר שש דקות, יש להוסיף 10 milliliters של HBSS קר כדי לדלל את חומר ההרמה. לאחר מכן, יש לשאוב בפיפטה 20 microliters מהתאים ולהשתמש בהמוציטומטר כדי לספור אותם. סבבו את תסמיך התאים בצנטריפוגה ב-500 x g, בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלסיוס, למשך חמש דקות.

השתמשו ב-HBSS כדי לסספנד את התאים בריכוז של 10⁶ תאים למיליליטר. בצעו פיפוט מעלה ומטה כדי לסספנד את התאים בתמיסה ולהפחית גשמיות של תאים שעלולה להפחית את קישור הנוגדנים. לאחר מכן, חלקו את סספנד התאים לתמיסות נפרדות עבור הבקרה והניסוי.

הוסיפו את הנוגדנים הביוטיניליים לתמיסות התאים המתאימות והדגירו במיקסר מסוג end-over-end בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות. השתמשו ב-150 µL של HBSS כדי לשטוף שלוש פעמים את הזجاج הפונקציונלי בלוחיות בעלות שמונה בארות, כפי שהודגם קודם לכן בסרטון. הוסיפו את תמיסת התאים לבארות, והדגירו על קרח על השייקר למשך 45 דקות.

בינתיים, הכין תמיסה של 20 millimolar של biotin ב-HBSS סטרילי. לאחר מכן, לאחר האינקובציה, השתמש בעדינות ב-150 microliters של HBSS כדי לשטוף את תמיסת התאים מהזכוכית. לאחר חזרה על השטיפה פעמיים נוספות, הוסף 150 microliters של תמיסת ה-biotin לכל באר שחרור בהתאמה, והדגר למשך 20 דקות כדי לאפשר לתגובה להתבצע.

אספו תאים שנקשרו באופן לא ספציפי באמצעות שטיפת התאים ב-HBSS. לאחר מכן, המשיכו לדימות פלואורסצנטי ולניתוח בהתאם לפרוטוקול הכתוב. כללו תמונות של תאים חיים בבקבוק תרבית (flask) כביקורת.

בניסוי זה, תאי MCF7GFP נחשפו למשטח הפונקציונלי. 60% מהתאים נלכדו באמצעות הנוגדן HLA-ABC. לאחר חשיפה ל-20 millimolar biotin, 80% מהתאים שנלכדו שוחררו.

כפי שמוצג כאן, כאשר תאי MCF7GFP ערבבו עם תאי RAW 264.7, נלכדו 50% ממאקרופאגי RAW, והוספה של 20 micromolar biotin שחררה לאחר מכן 80% מתאי RAW הנלכדים. איור זה ממחיש כי מאקרופאגי RAW המשמשים כביקורת חיובית אינם מראים פעילות פלואורסצנטית. עם זאת, תאי MCF7GFP המשמשים כביקורת שלילית חיוביים לפלואורסצנציית GFP.

מכיוון שעודף נוגדנים עלול להפחית את לכידת התאים, ריכוז הנוגדנים עבר אופטימיזציה באמצעות טיטרציה מ-0 עד 10,000 ננוגרם למיליליטר של נוגדי HLA. התוצאות הראו כי ריכוז הנוגדנים האידיאלי היה בין 100 ל-1,000 ננוגרם למיליליטר. בנוסף, ניסויי אופטימיזציה של תאים קבעו כי ריכוז התאים האידיאלי שניתן ללכוד הוא בין 1×10⁵ ל-1×10⁶ תאים, מכיוון שכמויות הנמוכות ממספר זה נמוכות מרמת הרקע.

לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצעה בשלושה ימים, עם פחות משישה שעות של זמן ניסויי, ללא הכללת הדגירות במהלך הלילה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לאסוף את שטיפות התאים במהלך הניסויים, שכן הן יכולות לספק מידע חיוני על יעילותו של השטח. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ציטומטריה זרימה (flow cytometry) במטרה לענות על שאלות נוספות, כגון רמות הביטוי של הרצפטורים בתאים הנבדקים.

לאחר פיתוחה, הפונקציונליזציה של פני השטח סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הביומטריאלים לבחון שילוב ביו-בטוח של חומרים, כגון שתלים בחולים עבור מגוון מחלות ופציעות. לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להגיע להבנה טובה של אופן ביצוע פונקציונליזציה של פני שטח של זכוכית לצורך לכידה ושחרור של תאים רלוונטיים, המאפשרת ניתוחים המשכיים. זכרו כי עבודה עם תאים חיים בנוכחות sodium azide עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון הכשרה מתאימה, ציוד מיגון אישי (PPE) ופינוי נאות בעת ביצוע פרוצדורה זו.