שיטה של ​​בידוד תא ממוקד באמצעות Functionalization משטח הזכוכית

המטרה הכוללת של תהליך פונקציונליזציה זה של משטח זכוכית היא לאפשר לכידה ושחרור עדינים של תאים מעניינים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום אנגיוגנזה של גידולים, ולאפשר סינון של סמנים ביולוגיים תאיים המצביעים על עמידות לתרופות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ניתנת להתאמה אישית לחלוטין, כמעט לכל סוג תא מעניין.

כל עוד יש נוגדן ספציפי לסוג התא, ניתן להתאים את פני השטח ללכידתו. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אנגיוגנזה של סרטן, היא עשויה להיות מיושמת גם על מחלות אחרות מכיוון שדגימות מטוהרות נחוצות לפיתוח משטרי טיפול מותאמים אישית יותר. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כשניסינו לפתח מנגנון שחרור הפיך ללכידת תאים, תוך שימוש באינטראקציה בין דסטיוביוטין למשפחת האדיווינים.

לאחר ניקוי משטח זכוכית במכונת פלזמת חמצן למשך חמש דקות על פי פרוטוקול הטקסט, הכינו 2.5 מיליליטר של 2% משוחזר 3-Aminopropyl triethoxysilane, או תמיסת APTES, על ידי שילוב של 50 מיקרוליטר APTES ו -2.45 מיליליטר אתנול בצינור חרוטי. שפכו את תמיסת ה-APTES על משטחי הזכוכית, ואז כסו את המשטחים והניחו אותם על שייקר פלטפורמה בטמפרטורת החדר למשך 50 דקות כדי לפזר את שכבת ה-APTES באופן שווה. בינתיים, מחממים את התנור ל -55 מעלות צלזיוס לצלחות שמונה ו -24 בארות, או 90 מעלות צלזיוס לכלי הזכוכית.

לאחר הוצאת הצלחות מהשייקר, השתמש באתנול כדי לשטוף את משטחי הזכוכית על פי פרוטוקול הטקסט. עם 100% גז חנקן, יבש את המשטחים. לאחר מכן הכניסו את צלחות שמונה ו -24 בארות לתנור למשך שעתיים, או את כלי הזכוכית בתנור למשך שעה.

לאחר מכן, הכינו 2.5 מיליליטר של תמיסת d-Desthiobiotin, או DSB, על ידי ערבוב של 1.5 מיליגרם למיליליטר של DSB ב-37.5 מיקרוליטר של DMSO, והוספת חמישה מיליגרם למיליליטר של EDC ל-2,462.5 מיקרוליטר של 0.1 מאגר MES מולר, pH 6. ואז שלב את שני הפתרונות. לאחר 15 דקות, הוסף מיקרוליטר אחד של BME כדי להרוות את התגובה בין DSB ל-EDC.

הוציאו את משטחי הזכוכית הפונקציונליים החמים של APTES מהתנור, והניחו להם להתקרר במשך חמש עד 10 דקות. הוסף מאגר MES למשטחי הזכוכית כדי לשטוף אותם על ידי החזקת הפיפטה בזווית של 70 מעלות כך שהקצה לא יופנה ישירות אל פני השטח. ואז לפרוק ולמשוך את המאגר מנקודה קבועה, כמו פינת הבאר.

לאחר מכן, השתמש במאגר MES כדי לשטוף פעמיים נוספות. החל תמיסת DSB על משטחי הזכוכית. מעבירים אותם למגבת נייר לחה בתוך צלחת פטרי, מכסים את התבשיל ודוגרים במקרר למשך 18 עד 24 שעות.

לאחר הדגירה בארבע מעלות צלזיוס, השתמש ב-PBS כדי לשטוף כל משטח זכוכית שלוש פעמים, כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. לאחר מכן, יש לדלל את תמיסת הסטרפטווידין, או SAV, ל-0.4 מיליגרם למיליליטר, ולמרוח אותו באופן שווה על משטחי הזכוכית כך שתיווצר שכבה דקה. לאחר דגירה של הכוס למשך 18 עד 24 שעות, השתמש ב -150 מיקרוליטר PBS כדי לשטוף כל משטח שלוש פעמים.

לאחר מכן הרטיבו מגבת נייר במים נטולי יונים, והניחו אותה שטוחה בצלחת פטרי בגודל 14 סנטימטר המקיפה את הצלחות כדי לשמור על לחות בבארות. מכסים את צלחת הפטרי במשטחי הזכוכית, ומניחים אותה במקרר ברמת בטיחות ביולוגית של ארבע מעלות צלזיוס עד הצורך. כדי לבצע לכידת תאים, שאפו את המדיום מצלוחיות T175 של תאים.

לאחר מכן השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים ולשאוף את המאגר. הוסף לבקבוק 10 מיליליטר של חומר הרמה לא אנזימטי, כגון תמיסת דיסוציאציה של תאים. לאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שש דקות.

לאחר שש דקות, הוסף 10 מיליליטר HBSS קר כדי לדלל את חומר ההרמה. לאחר מכן פיפטה 20 מיקרוליטר מהתאים והשתמש בהמוציטומטר כדי לספור אותם. צנטריפוגה את מתלה התא ב -500 x גרם, בארבע מעלות צלזיוס, למשך חמש דקות.

והשתמש ב-HBSS כדי להשעות את התאים ל-10 פעמים 10 עד שישית תאים למיליליטר. פיפטה למעלה ולמטה כדי להשהות מחדש את התאים בתמיסה, ולהפחית גושים תאיים שעשויים להפחית את קשירת הנוגדנים. לאחר מכן, פצלו את המתלה הסלולרי לפתרונות בקרה וניסיוניים נפרדים.

הוסף את הנוגדנים הביוטיניים לתמיסות התאים המתאימות ודגירה על מערבל קצה קצה בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. השתמש ב-150 מיקרוליטר של HBSS כדי לשטוף את הזכוכית הפונקציונלית בצלחות של שמונה בארות שלוש פעמים, כפי שהודגם מוקדם יותר בסרטון. מוסיפים את תמיסת התאים לבארות, ודוגרים על קרח על השייקר למשך 45 דקות.

בינתיים, הכינו תמיסה של 20 מילי-מולרית של ביוטין ב-HBSS סטרילי. לאחר מכן, לאחר הדגירה, השתמש בעדינות ב -150 מיקרוליטר של HBSS כדי לשטוף את תמיסת התא מהזכוכית. לאחר חזרה על השטיפה פעמיים נוספות, הוסיפו 150 מיקרוליטר מתמיסת הביוטין לכל באר שחרור בהתאמה, ודגרו למשך 20 דקות כדי לאפשר לתגובה להמשיך.

זכור תאים קשורים באופן לא ספציפי על ידי שימוש ב-HBSS כדי לשטוף את התאים. לאחר מכן, המשך להדמיה וניתוח פלואורסצנטי על פי פרוטוקול הטקסט. כלול תמונות של תאים חיים בבקבוק כבקרה.

בניסוי זה, MCF7GFP התאים נחשפו למשטח הפונקציונלי. 60% מהתאים נלכדו באמצעות נוגדן HLA-ABC. עם חשיפה לביוטין של 20 מילי-מולאר, 80% מהתאים שנלכדו שוחררו.

כפי שמוצג כאן, כאשר תאי MCF7GFP עורבבו עם תאי RAW 264.7, 50% מהמקרופאגים הגולמיים נלכדו, ותוספת של 20 ביוטין מיקרו-מולרי שחררה לאחר מכן 80% מתאי ה-RAW שנלכדו. איור זה ממחיש כי המקרופאגים החיוביים של RAW אינם מציגים פעילות פלואורסצנטית. עם זאת, תאי הבקרה השליליים MCF7GFP חיוביים לפלואורסצנטיות GFP.

מכיוון שעודף נוגדנים יכול להפחית את לכידת התאים, ריכוז הנוגדנים עבר אופטימיזציה על ידי טיטרציה מאפס ל-10,000 ננוגרם למיליליטר של נוגדן HLA. התוצאות הראו כי ריכוז הנוגדנים האידיאלי היה בין 100 ל-1,000 ננוגרם למיליליטר. בנוסף, ניסויי אופטימיזציה של תאים קבעו כי הריכוז האידיאלי של תאים שניתן ללכוד הוא בין אחד כפול 10 לתאים החמישיים, ואחד כפול 10 לתאים השישיים, מכיוון שכמויות מתחת למספר זה נמוכות מהרקע.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה ימים, עם פחות משש שעות של זמן ניסוי, לא כולל דגירות הלילה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לאסוף את שטיפות התאים במהלך הניסויים, מכיוון שהם יכולים לתת מידע חיוני על יעילות המשטח. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו זרימה ציטומטרית על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו אילו רמות ביטוי קולטנים עשויות להיות לתאים המעניינים.

לאחר פיתוחו, פונקציונליזציה של פני השטח סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביו-חומרים לחקור שילוב ביו-בטוח של חומרים, כגון שתלים בחולים למגוון מחלות ופציעות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע פונקציונליזציה של משטחי זכוכית כדי ללכוד ולשחרר תאים מעניינים, מה שמאפשר ניתוח במורד הזרם. אל תשכח שעבודה עם תאים חיים בנתרן אזיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון הכשרה מתאימה, PPE וסילוק בעת ביצוע הליך זה.