תלת ממדי Assay תרבות לחקור הפולשנות תאים סרטניים היווצרות גידולים בלוויין

המטרה הכוללת של הליך זה היא לסנדוויץ' תאי סרטן משובצים בקולגן בתוך ג'ל פיברין כדי ליצור מערכת תרבית תלת מימדית לניטור פולשניות והיווצרות גידול לווין. מערכת התמונות התלת-ממדית שלנו יכולה להציע דרכים חדשות לחקירת תאים שונים וגרסאות מפתח רבות במהלך אפופטוזיס או נדידה של תאים סרטניים או להעריך את היעילות של אובדן תאים אנטי-סרטניים. מאפיין אטרקטיבי של מודל תרבית תאים תלת מימדית זה הוא היכולת לשנות את ריכוז המטריצה התאית הנוספת או להשתמש במטריצה תאית נוספת להרכבת מערכת התלת מימד.

מי שתדגים את ההליך תהיה מארי-פרנס קוט. עוזרת מחקר, המעבדה שלי, ואודרי טורקוט, סטודנטית לתואר שני בהנחייתי. התחילו בערבוב קולגן מסוג 1 בגיד זנב עכברוש מיובש בהקפאה למשך חמש תערובות של שתי דקות במהירות גבוהה כדי לפזר את הקולגן באופן אחיד.

בזמן שילוב הקולגן, קצרו את תאי הגידול המעניינים עם תמיסת ניתוק האנזים המתאימה. ואחריו אי הכללה כחולה של טריפן בספירה. לדלל את התאים המנותקים לריכוז של 50,000 תאים לכל תקע ב-DMEM.

כאשר הקולגן מוכן, הוסף במהירות 1,250,000 תאים לתמיסת הקולגן עם פיפטינג כדי לפזר את התאים בצורה הומוגנית. הוצא מיד 200 מיקרוליטר ממתלה התא היחיד לכל באר של צלחת 96 בארות. טפח בעדינות על הצלחת על משטח אזור העבודה לאחר כל הוספה כדי להסיר בועות אוויר ולפזר את התמיסה באופן שווה בתוך הבארות.

לאחר הוספת כל התאים, הניחו את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות, והוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית לכל באר לאחר השעתיים הראשונות אם יש לתרבית את התאים למשך הלילה. להכנת שכבת ג'ל הפיברין הראשונה, הביאו את הפיברינוגן המיובש בהקפאה לטמפרטורת החדר לפני פתיחת הבקבוקון כדי למנוע היווצרות גבישי לחות. לאחר מכן העבירו את הפיברינוגן לכוס זכוכית והוסיפו טיפת HBSS של 37 מעלות צלזיוס לאבקה כדי להמיס את שברי הפיברינוגן.

לאחר מכן, השתמשו במרית כדי לפרק את חתיכות החלבון הגדולות יותר, וערבבו את הכוס מדי פעם לפי הצורך כדי להקל על הערבוב. פיפט את התרחיף מספר פעמים כדי להמיס את החלבון שנותר, ולסנן לעקר את התמיסה דרך פילטר 22 מיקרון. לאחר מכן כסה מיד את פני השטח של כל באר של צלחת 24 באר עם 200 מיקרוליטר של הפיברינוגן, תוך הקפדה על הימנעות מבועות אוויר.

לאחר שכל הבארות צופו היטב, הטה את הצלחת בזווית של 45, ואז זרוק 1.5 מיקרוליטר של תמיסת תרומבין למרכז באר אחת וסובב בעדינות את הצלחת אופקית למשך שנייה עד שתיים. לאחר טיפול בחמש בארות נוספות עם טרומבין באותו אופן, הנח את הצלחת במצב אופקי יציב מתחת למכסה זרימה למינרי למשך חמש עד 10 דקות, עד שהתמיסות ג'ל. למיקום מיידי של פקק הקולגן, הטה בזהירות את הצלחת כדי לוודא שג'ל הפיברין מפולמר לחלוטין.

לאחר מכן הניחו את צלחת 96 בארות פקקי ג'ל הקולגן ליד צלחת 24 בארות ג'ל פיברין והוסיפו טיפה אחת של HBSS לכל פקק קולגן. לאחר מכן, השתמש בכף מיקרו כדי להעביר פקק קולגן בודד למרכז כל אחת משכבות ג'ל הפיברין הראשונות בצלחת 24 הבארות. לאחר העברת כל התקעים, הוסף 300 מיקרוליטר תמיסת פיברינוגן לכל באר, ולאחר מכן תוספת של 2.25 מיקרוליטר תרומבין כפי שהודגם זה עתה.

כדי לצפות את פקקי הקולגן בשכבה דקה של קרום בסיס מופחת גורם גדילה לפני מיקומם, העבירו כל פקק לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר על קרח המכיל 100 מיקרוליטר של קרום בסיס מופחת גורם גדילה טהור. לאחר שתי דקות של השרייה, העבירו פקק קולגן מצופה יחיד למרכז כל שכבת פיברין ודגרו את הפקקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי למצק את קרום הבסיס המופחת של גורם הגדילה. לאחר מכן מוסיפים את שכבת הפיברין השנייה כפי שהודגם זה עתה.

כאשר הג'לים מפולמרים במלואם, מלאו כל באר ב -400 מיקרוליטר ממדיום התרבות המתאים ותוספי מזון. לאחר מכן, הוסף חומר אנטי-פיברינוליטי לבארות. ולדגור את תרביות התלת מימד בתנאים המתאימים לקו תאי הגידול הנבדק.

בימי האכלת התאים המתאימים, הטה את הצלחת בזווית של 30 עד 35 מעלות והטה פיפטה על הקיר של כל באר כדי לשאוב את המדיום מבלי להפריע לג'לים. לאחר מכן הוסף 400 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים טרי וחומר אנטיפיברינוליטי לכל תרבית ג'ל. בדיקת תרבית תאים תלת מימדית זו מאפשרת הדמיה ישירה של נדידת תאים סרטניים מתקע הקולגן לג'ל הפיברין הסמוך להקמת גידולים משניים, ומאפשרת השוואה של ההתנהגות או התאים הגרורתיים הידועים לזו של תאים שאינם גרורתיים או חלשים.

לדוגמה, בניסוי זה, גידולי לוויין רבים התפזרו באופן אקראי ברחבי ג'ל הפיברין המכיל את קו התאים הגרורתי B16 F10 בעוד שלא נצפו גידולי לוויין עבור קו התאים B16 F0 הגרורתי החלש. לעומת זאת, תאי קרצינומה אלה של בלוטת החלב של העכברים שהם גרורתיים גרורות גרורות אך פולשניות מאוד באופן מקומי יוצרים חזית נדידה המשתרעת רדיאלית לתוך ג'ל הפיברין. לאחר 14 יום של תרבית, תאי קרצינומה של בלוטות החלב מתרחקים מהחזית הנודדת ויוצרים מבנים בצורת כוכב הדומים מאוד למבני בלוטות החלב.

ניתן לבדוק תרופות כימותרפיות על תאי הסרטן המוטבעים כמו בניסוי מייצג זה שבו נצפתה כמות הולכת וגדלה של פיצול DNA במקביל למקרים המוגברים של אפופטוזיס של תאי סרטן המושרה על ידי חומר כימותרפי. כאשר שולטים בטכניקה זו, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כשש שעות או להתפרש על פני יומיים. תלוי בתקופת הדגירה הראשונית של פקק הקולגן.

בזמן שאני מנסה את ההליך הזה, חשוב למנוע היווצרות פערים בממשק בין הג'ל המרכזי וההיקפי מכיוון שהם יכולים להפחית את יכולתם של תאי הסרטן לפלוש לג'ל הפיברין. לאחר הליך זה, ניתן לבצע ניתוח מטאלוגרפי או פרוטאומי במושבות הלוויין, בתקעי הקולגן או בתאי הסרטן כדי לזהות את הביטוי הדיפרנציאלי של גנים וחלבונים מעניינים. לאחר פיתוחה וטכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של הסרטן לחקור את הנדידה, אפופטוזיס ביטוי גנים מדכא גרורתי יכול לשים קץ לאנגיוגנזה למגוון קווי תאים סרטניים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להטמיע תאים סרטניים בג'ל קולגן ולסנדוויץ' אותם בתוך ג'ל פיברין כדי לפקח על הפולשניות והיווצרות גידולי לוויין.