Name: במבחנה מודלים Vivo ללמוד קרנית האנדותל-mesenchymal מעבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: חקור מנגנון מעבר אנדותל-מזנכימלי בקרנית באמצעות תרביות תאי אנדותל בקר ומודל פציעת קרח בעכברוש. שיטה זו מסייעת בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למחלות קרנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לצוות מעבדת הליבה השנייה, המחלקה למחקר רפואי, בית החולים האוניברסיטאי הלאומי של טייוואן על תמיכתם הטכנית.

כל הנהלים המיושמים במחקר זה עולה בקנה אחד עם האגודה לחקר משפט חזון עיניים עבור שימוש בבעלי חי עיניים וחזון המחקר אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש בבית החולים האוניברסיטאי הלאומיים בטייוואן. 1. ניתוק, הכנת התרבות ראשית ולאחר Immunostaining של השור CECs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת עיני שור טריות מטבחיים מקומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את העיניים בתוך 10% w / v פתרון povidone יוד במשך 3 דקות. לשטוף אותם עם תמיסת מלח פוספט שנאגר (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את הכפתור הקרני עם אזמל ומספריים בתנאים סטריליים. מקלף את הממברנה של Descemet עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח (לציין כי במחקר זה, בעיני השור היו enucleated ידי מטבחיים מקומי, ולכן הליך המחקר הראשון היה חיטוי בעיני preenucleated במעבדה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה של Descemet ב 1 מ&quot;ל של לנסותpsin על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אסוף את CECs שור על ידי צנטריפוגה ב 112 XG במשך 5 דקות. Resuspend תאי 1 מיליליטר של מדיום אפיתל הורמונלי השלים (שם) המכיל כמויות שווות של מדיום הנשר HEPES שנאגר השונה של Dulbecco והבינוני F12 של חם, בתוספת 5% בסרום שור עוברי, sulfoxide דימתיל 0.5%, 2 ng / ml של אפידרמיס אדם גורם הגדילה, 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של אינסולין, 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של transferrin, 5 ng / ml של סלניום, 1 nmol / L של רעלן הכולרה, 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של גנטמיצין, ו -1.25 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של B. amphotericin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים תאים (כ 1 x 10 5 תאים לכל עין) לתוך צלחת 6 ס&quot;מ. תרבות אותם שם. דגירת הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס אווירה של 5% CO 2 באוויר. שינוי התרבות בינוני כל 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים מגיעים למפגש, לשטוף אותם PBS דגירה אותם ב 1 מ&quot;ל של טריפסין על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. אסוף אותם על ידי צנטריפוגה ב 112 XG במשך 5 דקות. Re- להשעות את התא גלולה ב 1 מ&quot;ל של שם טוב. <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים ב hemocytometer. זרעים התאים בשקופיות כיסוי בצפיפות של 1 x 10 4 לכל היטב צלחת 24 גם, והתרבות התאים שם טוב. על חקירת השפעת EnMT-הדיכוי של marimastat, דגירת התאים שם טוב עם 10 מיקרומטר של marimastat הוסיפו לתוך מדיום התרבות, ולשנות את מדיום התרבות כל 3 ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים בנקודת זמן מצוינת עם 250 μl של paraformaldehyde 4%, pH 7.4, למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. Permeabilize עם 250 μl של 0.5% Triton X-100 במשך 5 דקות. חסום עם אלבומין בסרום שור 10% למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים עם נוגדנים ראשוניים נגד-קטנין ביתא הפעיל (ABC), חילזון, חילזון הלילה ב 4 ° C.. הדילול של הנוגדנים העיקריים בשימוש הוא 1: 200. הנוגדנים הם מדולל diluent נוגדן מורכב של 10 מ&quot;מ PBS, 1% w / v אלבומין בסרום שור, ו 0.09% w / v אזיד הנתרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים פעמיים עם PBS במשך 15 דקות, דגירהמ &#39;עם נוגדנים משני מצומדות פלואוריד אלקסה (1: 100 ב diluent נוגדן) בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain בגרעין התא על ידי כיסוי התאים עם 2 מיקרוגרם / מיליליטר של 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole, לשטוף את התאים פעמים עם PBS במשך 15 דקות, ו הר איתם נגד דהיית פתרון גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג תמונות immunofluorescent על אורכי גל עירור של 405 ו 488 ננומטר באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר עם 20X ההגדלה אובייקטיבי. </li></ol> 2. מודל עכברוש קרנית האנדותל Cryoinjury הזרקת Intracameral <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים 12 שבועות בן חולדות Sprague-Dawley זכר עם זריקה תוך שרירית של 2% xylazine (5.6 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו tiletamine בתוספת zolazepam (18 מ&quot;ג / ק&quot;ג). בעדינות לצבוט את העור של החיות כדי לאשר הרדמה תקינה בהעדר מתעוות עור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחדיר טיפה אחת של hydrochloride proparacaine 0.5% אל עינו הימנית של כל העכברים כדי למזער את הכאב העין ואת רפלקס מצמוץ. לְהַחדִירמשחת טטרציקלין לעין השמאל כדי למנוע יובש קרני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב בדיקת נירוסטה (קוטר = 3 מ&quot;מ) בחנקן נוזלי. החלת את חללית הנירוסטה אל הקרנית המרכזית של עין ימין למשך 30 שניות. לעתים קרובות להנחיל PBS על עינו הימנית במהלך ההליך כדי למנוע יובש קרני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחדיר 0.1% אטרופין סולפט גנטמיצין 0.3% מייד לאחר cryoinjury ופעם יומי כדי להקל על כאב עיני נובע התכווצות ריסים ולמנוע זיהום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההליך, לשמור על החולדות לחמם באמצעות מנורת חום, ולבחון החלים כל 15 דקות אחרי ההרדמה עד שהם להחזיר שליטה מוטורית. בנוסף, החל משח טטרציקלין לעין הזכות למנוע יובש קרני במהלך תקופת ההחלמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על cryoinjury הקרנית במשך 3 ימים רצופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אספקת marimastat או bFGF לתוך החדר הקדמי של עיני החולדה, להרדים החולדות כפי שתואר לעיל. להחדיר טיפה אחתשל hydrochloride proparacaine 0.5% אל תוך עינו הימנית כדי למזער את כאב עין ואת רפלקס המצמוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשקות את פני השטח של העין עם PBS סטרילית. בצע ניקור הלשכה הקדמית תחת מיקרוסקופ ההפעלה על ידי החדרת מחט 30 G מצורף מזרק 1 מ&quot;ל על הקרנית ברור paralimbal במטוס מעל ובמקביל הקשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובבו את המחט שפוע למעלה, ומעט לדכא את הפצע בקרנית לנקז קצת הומור מימית ולהפחית את הלחץ התוך עיני. להזריק 0.02 מ&quot;ל של התרופה intracamerally. בעדינות לדחוס את דרכי מחט עם קצה כותנה בזמן נסיגת המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם את שלהוציא בנקודת זמן מצוינת מתחת למיקרוסקופ ההפעלה. </li></ol> 3. קצירי העכברוש קרני לחצן ו Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להרדים את החולדות, למקם אותם בתא המתת חסד להשרות 100% CO 2 בקצב מילוי של 10-30% מנפח התא לדקה. שמור עירוי CO 2 עבורדקה נוספת אחרי חוסר נשימת צבע עיניים דהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדור לעין עכברוש בבית לימבוס עם להב חד. חותך את הקרניות במספריים קרניים לאורך לימבוס. שטח את הקרניות בשקופית. ודא חתכים רדיאליים נוספים אם הקרניות להתכרבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את קרניות עם 250 μl של paraformaldehyde 4%, pH 7.4, למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. Permeabilize עם 250 μl של 0.5% Triton X-100 במשך 5 דקות, ולחסום עם אלבומין בסרום שור 10% למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קרנית עם נוגדנים ראשוניים נגד ABC הלילה ב 4 ° C עם דילול של 1: 200 ב diluent נוגדן. שטפו את קרניות פעמיים עם PBS במשך 15 דקות, דגירה אותם עם נוגדנים משני (1: 100 ב diluent נוגדן) בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. Counterstain בגרעין התא על ידי כיסוי תאים עם 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הקרני בתמיסה נגד דהייה גוברת. אובטיין התמונות immunofluorescent באורכי גל עירור של 405 ו 561 ננומטר באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר ב 20X ההגדלה אובייקטיבי. </li></ol>

<ol><li>Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+location+of+the+fluid+pump+in+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The location of the fluid pump in the cornea.</a> J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).</li>
<li>Joyce, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+capacity+of+the+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Proliferative capacity of the corneal endothelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (3), 359-389 (2003).</li>
<li>Morishige, N., Sonoda, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bullous+keratopathy+as+a+progressive+disease%3A+evidence+from+clinical+and+laboratory+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Bullous keratopathy as a progressive disease: evidence from clinical and laboratory imaging studies.</a> Cornea. 32, Suppl 1 77-83 (2013).</li>
<li>Bates, A. K., Cheng, H., Hiorns, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudophakic+bullous+keratopathy%3A+relationship+with+endothelial+cell+density+and+use+of+a+predictive+cell+loss+model.+A+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Pseudophakic bullous keratopathy: relationship with endothelial cell density and use of a predictive cell loss model. A preliminary report.</a> Curr Eye Res. 5 (5), 363-366 (1986).</li>
<li>Wilson, S. E., Lloyd, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+and+its+receptor%2C+basic+fibroblast+growth+factor%2C+transforming+growth+factor+beta-1%2C+and+interleukin-1+alpha+messenger+RNA+production+in+human+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor and its receptor, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta-1, and interleukin-1 alpha messenger RNA production in human corneal endothelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (10), 2747-2756 (1991).</li>
<li>Chen, K. H., Harris, D. L., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta2+in+aqueous+humor+suppresses+S-phase+entry+in+cultured+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">TGF-beta2 in aqueous humor suppresses S-phase entry in cultured corneal endothelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 40 (11), 2513-2519 (1999).</li>
<li>Senoo, T., Obara, Y., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDTA%3A+a+promoter+of+proliferation+in+human+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">EDTA: a promoter of proliferation in human corneal endothelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 2930-2935 (2000).</li>
<li>Yue, B. Y., Sugar, J., Gilboy, J. E., Elvart, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+human+corneal+endothelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Growth of human corneal endothelial cells in culture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (2), 248-253 (1989).</li>
<li>Peh, G. S., Beuerman, R. W., Colman, A., Tan, D. T., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+endothelial+cell+expansion+for+corneal+endothelium+transplantation%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview.</a> Transplantation. 91 (8), 811-819 (2011).</li>
<li>Zhu, C., Rawe, I., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+expression+in+human+corneal+endothelial+cells+cultured+from+young+and+older+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Differential protein expression in human corneal endothelial cells cultured from young and older donors.</a> Mol Vis. 14, 1805-1814 (2008).</li>
<li>Ko, M. K., Kay, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+role+of+FGF-2+on+type+I+collagen+expression+during+endothelial+mesenchymal+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulatory role of FGF-2 on type I collagen expression during endothelial mesenchymal transformation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4495-4503 (2005).</li>
<li>Lee, H. T., Kay, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-2+induced+reorganization+and+disruption+of+actin+cytoskeleton+through+PI+3-kinase%2C+Rho%2C+and+Cdc42+in+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">FGF-2 induced reorganization and disruption of actin cytoskeleton through PI 3-kinase, Rho, and Cdc42 in corneal endothelial cells.</a> Mol Vis. 9, 624-634 (2003).</li>
<li>Pipparelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+Inhibitor+Enhances+Adhesion+and+Wound+Healing+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">ROCK Inhibitor Enhances Adhesion and Wound Healing of Human Corneal Endothelial Cells.</a> PloS one. 8 (4), e62095(2013).</li>
<li>Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Theriault, M., Proulx, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1228-1237 (2015).</li>
<li>Jakobiec, F. A., Bhat, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrocorneal+membranes%3A+a+comparative+immunohistochemical+analysis+of+keratocytic%2C+endothelial%2C+and+epithelial+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Retrocorneal membranes: a comparative immunohistochemical analysis of keratocytic, endothelial, and epithelial origins.</a> Am J Ophthalmol. 150 (2), 230-242 (2010).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+ZEB1+and+Snail1+in+excessive+production+of+extracellular+matrix+in+Fuchs+endothelial+corneal+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy.</a> Lab Invest. 95 (11), 1291-1304 (2015).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+on+primate+corneal+endothelial+cell+survival+in+vitro+by+a+ROCK+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3680-3687 (2009).</li>
<li>Zhu, Y. T., Chen, H. C., Chen, S. Y., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+p120+catenin+unlocks+mitotic+block+of+contact-inhibited+human+corneal+endothelial+monolayers+without+disrupting+adherent+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions.</a> J Cell Sci. 125 (15), 3636-3648 (2012).</li>
<li>Ho, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Matrix+Metalloproteinase+Activity+Reverses+Corneal+Endothelial-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Matrix Metalloproteinase Activity Reverses Corneal Endothelial-Mesenchymal Transition.</a> Am J Pathol. 185 (8), 2158-2167 (2015).</li>
<li>Kay, E. D., Cheung, C. C., Jester, J. V., Nimni, M. E., Smith, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+collagen+and+fibronectin+synthesis+by+retrocorneal+fibrous+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Type I collagen and fibronectin synthesis by retrocorneal fibrous membrane.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 22 (2), 200-212 (1982).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+Signal+Regulates+Corneal+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Notch Signal Regulates Corneal Endothelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Am J Pathol. 183 (3), 786-795 (2013).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+Inhibitor+Eye+Drop+Accelerates+Corneal+Endothelium+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The ROCK Inhibitor Eye Drop Accelerates Corneal Endothelium Wound Healing.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 2493-2502 (2013).</li>
<li>Mannermaa, E., Vellonen, K. S., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transport+in+corneal+epithelium+and+blood-retina+barrier%3A+emerging+role+of+transporters+in+ocular+pharmacokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Drug transport in corneal epithelium and blood-retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmacokinetics.</a> Adv Drug Deliv Rev. 58 (11), 1136-1163 (2006).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים להצהיר עליהם.

CECs ידוע נטייתן לעבור EnMT במהלך התפשטות תאים. כדי לפתח אסטרטגיות דיכוי תהליך EnMT למטרות טיפוליות, הבנה מעמיקה של מנגנון EnMT הכרחית. תיארנו 2 דגמים לחקור EnMT, כלומר CEC שור במודל תרבות במבחנה דגם cryoinjury האנדותל עכברוש הקרנית. התוצאות שלנו הוכיחו את תהליך EnMT בשני המודלים. יתר על כן, השפעת מדכאי EnMT של marimastat שוחזרה בשני המודלים, דבר המצביע על כך 2 דגמים אלה לשתף אותו המנגנון. ועדת ...

תאי אנדותל קרנית (CECs) ממלאים תפקיד חיוני בשמירה על בהירות הקרנית ובכך על חדות הראייה על ידי ויסות מצב ההידרציה של סטרומה הקרנית באמצעות שאיבה פעילה1. בגלל פוטנציאל ההתפשטות המוגבל של CECs אנושיים, מספר התאים יורד עם הגיל, ותיקון פצעי אנדותל בקרנית לאחר פציעה מושג בדרך כלל באמצעות הגדלה ונדידה של תאים, ולא מיטוזה של תאים2. כאשר ספירת ה-CEC יורדת מתחת לסף של כ-500 תאים/מ"מ2, לא ניתן לשמור על מצב ההתייבשות של סטרומה הקרנית, מה שמוביל לקרטופתיה בולוסית וללקות ראייה3,4.
פוטנציאל ההתפשטות המוגבל של CECs אנושיים יוחס למספר גורמים, כולל ביטוי מופחת של גורם הגדילה האפידרמיס והקולטן שלו בתאים מזדקנים5, TGFβ2 אנטי-פרוליפרטיבי בהומור מימי6 ועיכוב מגע2,7. למרות שגורמי גדילה מסוימים, כגון גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF), יכולים להגביר את ההתפשטות באנדותל קרנית אנושי מתורבת, יעילות התרבות נשארת מוגבלת8,9. יתר על כן, CECs עשויים לעבור שינוי פנוטיפי במהלך התרחבות ex vivo, בדומה למעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) 10-13. מעבר אנדותל-מזנכימלי (EnMT) מאופיין בחוסר יציבות של צומת התאים, אובדן קוטביות אפיקלית-בסיסית, סידור מחדש של השלד הציטו, ביטוי אקטין של שריר אלפא חלק והפרשת קולגן מסוגI 14. כל המאפיינים הללו עשויים לבטל את התפקוד התקין של CECs, ולפגוע בשימוש ב-CECs בתרבית ex vivo בהנדסת רקמות. יתר על כן, EnMT נקשר לפתוגנזה של מספר מחלות אנדותל בקרנית, כולל ניוון קרנית אנדותל פוקס והיווצרות קרום רטרו-קרנית15,16. לכן, הבנת המנגנון של EnMT עשויה לסייע במניפולציה של תהליך EnMT ולהקל על התחדשות של CECs כדי לאפשר תפקוד מוכשר. 
במחקר זה, תיארנו שיטה לבידוד CECs של בקר מכפתור הקרנית. בתרבית הראשונית במבחנה, נצפה תהליך EnMT, כולל שינוי פנוטיפי, טרנסלוקציה גרעינית של β-catenin, ומווסתי EMT חילזון ושבלול. תיארנו עוד שיטה להדגמת EnMT in vivo על ידי שימוש במודל פגיעה באנדותל קרנית של חולדות. באמצעות שני המודלים הללו, הראינו כי מרימסטט, מעכב מטריצה מטאלופרוטאינאז (MMP) רחב ספקטרום, יכול לדכא את תהליך ה-EnMT. הפרוטוקולים המתוארים מקלים על ניתוח מפורט של מנגנון EnMT ופיתוח אסטרטגיות למניפולציה של תהליך EnMT להמשך יישום קליני.

<table><tbody><tr><td>טריפסין</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו s שונה Eagle medium ו-Ham's F12 medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמיס אנושי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין, טרנספרין, סלניום&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>רעלן כולרה</td><td>סיגמא</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>גנטמיצין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>אמפוטריצין B</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>111219</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא</td><td>T8787&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>מרימסטט</td><td>סיגמא</td><td>M2699-25MG</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן בטא-קטנין אנטי אקטיבי</td><td>Millpore</td><td>05-665</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד חלזונות</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc28199</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד שבלול</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc15391</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG (H+L) משני נוגדן</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>לצביעה של ABC של בקר CECs עזים</td></tr><tr><td>נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11003</td><td>לצביעה של ABC של חולדה אנדותל</td></tr><tr><td>קרנית עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>לצביעה של חילזון ושבלול של בקר CECs</td></tr><tr><td>מדלל נוגדנים</td><td>Genemed ביוטכנולוגיות</td><td>10-0001</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>הרכבה בינונית</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר</td><td>ZEISS</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין&nbsp;</td><td>באייר</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>טילטמין בתוספת zolazepam</td><td>Virbac</td><td>N/A</td><td>תרופה וטרינרית</td></tr><tr><td>פרופרקאין הידרוכלוריד תמיסת עיניים</td><td>Alcon</td><td>N/A</td><td>תרופה וטרינרית</td></tr><tr><td>0.1% אטרופין</td><td>Wu-Fu Laboratories Co., Ltd</td><td>N/A</td><td>תרופה קלינית&nbsp;</td></tr><tr><td>0.3% גנטמיצין סולפט</td><td>תרופה קלינית</td> <td>Sinphar Group</td><td>N/A</td>&nbsp;</tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק</td><td>PHG0024</td><td>תרופה קלינית&nbsp;</td></tr></tbody></table>

במבחנה מודלים vivo ללמוד קרנית האנדותל-mesenchymal מעבר

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

תאי אנדותל קרנית (CECs) ממלאים תפקיד מכריע בשמירה על בהירות הקרנית באמצעות שאיבה פעילה. ספירת CEC מופחתת עלולה להוביל לבצקת בקרנית ולירידה בחדות הראייה. עם זאת, CECs אנושיים נוטים לפגיעה בפוטנציאל ההתפשטות. יתר על כן, גירוי של צמיחת תאים מסובך לעתים קרובות על ידי מעבר אנדותל-מזנכימלי הדרגתי (EnMT). לכן, הבנת המנגנון של EnMT נחוצה כדי להקל על התחדשות של CECs עם תפקוד מוכשר. במחקר זה, הכנו תרבית ראשונית של CECs בקר על ידי קילוף ה-CECs עם הממברנה של Descemet מכפתור הקרנית והראינו כי CECs בקר הציגו את תהליך EnMT, כולל שינוי פנוטיפי, טרנסלוקציה גרעינית של β-catenin, ומווסתי EMT חילזון ושבלול, בתרבית במבחנה. יתר על כן, השתמשנו במודל פגיעה באנדותל קרנית של חולדות כדי להדגים את תהליך EnMT in vivo. באופן קולקטיבי, התרבות הראשונית במבחנה של CECs בקר ומודלים של פגיעות קריותל בקרנית של חולדות in vivo מציעה פלטפורמות שימושיות לחקירת המנגנון של EnMT.

לאחר בידוד של CECs שור, התאים היו בתרבית במבחנה. איור 1 מציג את התמונות בניגוד שלב של CECs שור. צורת המשושה של התאים בנקודת המפגש ציינה כי התאים לא היו מזוהמים על ידי פיברובלסטים סטרומה הקרניים במהלך בידוד תא. איור 2 מתארים את immunostaining כי בוצע באמצעות נוגדנים נגד ABC, חילזון, חילזון בנקודת זמן מצוינת. מלבד שינויים פנוטיפי בתרבות במבחנה, טרנסלוקציה גרעין מקבילה של רגולטורי ABC ו- EMT נצפתה. <...

תרבות עיקרית של תאי אנדותל קרניים שור שמשה לחקור את המנגנון של מעבר אנדותל-mesenchymal הקרני. יתר על כן, מודל cryoinjury האנדותל עכברוש הקרני שמש להפגין מעבר אנדותל-mesenchymal קרני in vivo.

במבחנה מודלים Vivo ללמוד קרנית האנדותל-mesenchymal מעבר

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור את המנגנון של מעבר מזנכי-אפיתליאלי של האנדותל הקרני (Corneal Endothelial-mesenchymal Transition) In Vitro ו-In Vivo. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות הנוגעות למעבר מזנכי-אפיתליאלי של האנדותל הקרני בתחום של רגנרציה של האנדותל הקרני. היתרון של טכניקה זו הוא שניתן להחילה אותה הן על מודלים In Vitro והן על מודלים In Vivo.והוא קל למניפולציה. ההשלכות של טכניקה זו נוטות לעבר טיפול במחלות הקשורות למעבר אנדותליאלי-מזנכימי של קרנית. כגון התגבשות, מכיוון שניתן להשתמש במודלים כדי לבחור עבורנו חומרים המעכבים את תהליך המעבר האנדותליאלי-מזנכימי של קרנית.את הפרוצדורה תבצע ג'ונג-שן צ'אנג, טכנאית ממעבדה. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, חטאו עיניים של בקר טריות בתמיסת Povidone-iodine בריכוז 10% משקל לנפח למשך שלוש דקות. לאחר מכן, שטפו אותן ב-PBS.קצור את כפתור הקרנית באמצעות סקלפל ומספריים ושטוף אותו ב-PBS. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, קלף את ממבצת דסמט (Descemet's Membrane) בעזרת פינצטה. לאחר מכן, דגור את ממבצת דסמט במיליליטר אחד של Trypsin בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, אסוף את תאי ה-CEC של הבקר על ידי צנטריפוגה ב-112 ×g למשך חמש דקות.לאחר סנטריפוגציה, השהו מחדש את התאים ב-1 ml של SHEM. זרעו את התאים בצלחת בקוטר 6 ס"מ וגדלו אותם ב-SHEM. לאחר מכן, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2, והחליפו את מצע התרבית מדי שלושה ימים.כאשר התאים מגיעים להסתגלות (confluence), שטפו אותם ב-PBS. לאחר מכן, דגרו אותם ב-1 mm של Trypsin בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות. אספו אותם על ידי סרכוז במהירות של 112 ×g למשך חמש דקות.לאחר חמש דקות, השהו שוב את משקע התאים ב-1 מ"ל של SHEM. לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות המוסימטר (Hemacytometer). בהמשך לכך, זרעו את התאים על לוחות כיסוי בתוך פלטה בעלת 24 בארות וגודלו את התאים ב-SHEM.כדי לבחון את ההשפעה של Maramastat על דיכוי ENMT, דגרו את התאים ב-SHEM עם 10 micromolar Maramastat במצע התרבית והחליפו את מצע התרבית מדי שלושה ימים. לאחר מכן, קבעו את התאים בנקודת זמן מסומנת באמצעות 250 microliters של 4%Paraformaldehyde למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הפכו אותם לחדירים באמצעות 250 microliters של 0.5%Triton X-100 למשך חמש דקות.חסום אותם עם 10% BSA למשך 30 דקות. לאחר מכן, דגור את התאים עם נוגדנים ראשוניים נגד ABC, snail ו-slug למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטוף את התאים פעמיים עם PBS למשך 15 דקות בכל פעם.הדגרימו אותם עם הנוגדן המשני הצמוד ל-Alexa Fluor בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר מכן, בצעו צביעה נגדית של גרעין התא על ידי כיסוי התאים ב-DAPI בריכוז של 2 µg/mL. שטפו את התאים פעמיים עם PBS למשך 15 דקות בכל פעם.והרכיבו אותם באמצעות תמיסת הרכבה למניעת דהייה לפני קבלת תמונות האימונופלואורסצנציה. לאחר הרדמה של חולדה זכר מסוג SD בת 12 שבועות, צבטו בעדינות את עור החיה כדי לוודא הרדמה תקינה על ידי היעדר רעידות של העור. לאחר מכן, טפטפו טיפה אחת של 0.5% Proparacaine Hydrochloride לעינו הימנית של החולדה כדי למזער את הכאב ואת רפלקס המצמוץ.לאחר מכן, מרח משחת Tetracycline לעין שמאלית כדי למנוע התייבשות של הקרנית. בשלב הבא, קרר גשושית (probe) מפלדת אל חלון בחנקן נוזלי. הנח את הגשושית מפלדת האל חלון על מרכז הקרנית של העין הימנית למשך 30 שניות.יש לטפטף PBS לעין ימין בתדירות גבוהה במהלך הפרוצדורה כדי למנוע התייבשות של הקרנית, ולהחיל 0.1%Atropine ו-0.3%Gentamicin Sulfate מיד לאחר הפגיעה בקור פעם ביום כדי להקל על כאבים עיניים הנובעים מספרסום סיליארי (Ciliary spasm) ולמנוע זיהום. לאחר הפרוצדורה, יש לשמור על החולדה חמה באמצעות מנורת חימום ולעקוב אחר התאוששותה עד להסדרת השליטה המוטורית. יש למרוח משחת Tetracycline בעין ימין למניעת התייבשות של הקרנית במהלך תקופת ההתאוששות, ולחזור על פרוצדורת הפגיעה בקור בקרנית במשך שלושה ימים רצופים.כדי להחדיר Maramastat או basic FGF אל תוך התא הפנימי של עיני החולדה, טפטפו טיפה של 0.5% Proparacaine Hydrochloride לעינה הימנית של החולדה המורדמת כדי למזער את הכאב ואת רפלקס המצמוץ. לאחר מכן, שטפו את פני השטח של העין ב-PBS סטרילי. תחת מיקרוסקופ ניתוחי, בצעו פאראקנטזה (ניקור) של התא הקדמי על ידי החדרת מחט בכילוי 30 Gauge המחוברת למזרק של 1 mm לתוך הקרנית השקופה באזור הפרה-לימבלי, במיקום שטוח, מעל ובמקביל לקשתית. לאחר מכן, הפנו את פיית המחט כלפי מעלה ולחצו קלות על פצע הקרנית כדי לנקז מעט נוזל עיניים ולהפחית את הלחץ התוך-עיני.הזריקו 0.02 milliliters של התרופה לתוך תא הקרנית (intracamerally) והפעילו לחץ עדין על נתיב המחט בעזרת טיפ צמר בעת הוצאת המחט. איור זה מציג תמונות במיקרוסקופ ניגודיות פאזה (phase contrast) של תאי CECs בקרים ותרביות שלהם. הצורה המשושה של התאים בעת הגעה לקונפלואנס (confluence) מעידה על כך שהתאים אינם מזוהמים על ידי פיברובלסטים של הסטרומה הקרנית במהלך בידוד התאים.במהלך תרבית In Vitro של תאי CECs בקרים, זוהתה טרנסלוקציה גרעינית של ABC, snail ו-slug עד היום ה-14. איור זה ממחיש את ההשפעה של Maramastat, מעכב MMP רחב ספקטרום, על תהליך ה-ENMT של תאי CECs בקרים שגודלו בתרבית In Vitro. כאן מוצגות תצריפי עיניים חיצוניות של חולדות לאחר פגיעת קור, ואחריהן הזרקה תוך-לשקיתית.התמונות מראות הפחתה של בצקת קרנית לאחר הזרקת basic FGF. בעוד ש-Maramastat הפחיתה את בצקת הקרנית עוד יותר בהשוואה ל-basic FGF לבדו. ודמות זו מראה צביעה אימונוהיסטוכימית של כפתור קרנית של חולדה באמצעות נוגדן נגד ABC לאחר פגיעת קור, ולאחריה הזרקה תוך-לשקית (intracameral).הטרנסלוקציה הגרעינית של ABC נצפתה בקבוצת ה-PBS והיא מוגברת באופן משמעותי בקבוצת ה-basic FGF, דבר המעיד על הפעלת שגורר ה-Wnt Beta-catenin ותהליך ה-ENMT. לאחר הזרקה תוך-לשקית (intracameral), של basic FGF ולאחריו Maramastat, הצביעה הגרעינית של ABC פחתה, מה שמרמז על ההשפעה המעכבת של Maramastat על ה-ENMT. לאחר פיתחו, סלל טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום של מעבר אנדותליאלי-מזנכימלי של קרנית, In Vitro ו-In Vivo.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן בידוד תאי אנדותל של קרנית בקר, ובמידה שווה, כיצד לבצע פגיעת קור בקרנית והזרקה תוך-לשקית (intracameral injection)

in-vitro-vivo-models-to-study-corneal-endothelial-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הפרוטוקול מתאר את assay micropocket הקרנית כפי שפותח בעכברים.

קרנית Micropocket Assay: דגם של אנגיוגנזה בעין העכבר

עכברים שימשו כמודל לחקר צורות רבות של השתלה, כולל השתלת קרנית.  אנו מתארים בדוח זה מודל עכברי להשתלת קרנית חריפה ומאוחרת כאחד.

השתלת קרנית עכברית: דגם לחקר הצורה נפוצה ביותר של Solid השתלות איברים

מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) מאפשר לסרטן להפוך לפולשני. כדי לחקור EMT, מתואר מודל מבחנה מבוסס תאי גזע עצביים (NSC) נטול סרום ואנזימים. מערכת סטנדרטית זו מאפשרת הערכה כמותית ואיכותית של נדידת תאים, ביטוי גנים וחלבונים. המודל מתאים לגילוי תרופות.

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

פרוטוקול זה מתאר את הרומן תלת מימדי במבחנה מודל, שבו תאי סטרומה הקרנית ואת תאים עצביים מתורבתים יחד כדי לסייע בדיקה והבנה של האינטראקציות של תא שני הסוגים.

הנדסת רקמות הקרנית: במבחנה מודל של אינטראקציות סטרומה-עצב של הקרנית האנושית

עבור במבחנה אינדוקציה של המעבר אנדותל-mesenchymal (EndMT), אשר הוא שימושי עבור חוקרים הסלולר איתות המסלולים מעורב EndMT, פרוטוקול המתואר. במודל זה ניסיוני, EndMT הנגרמת על ידי טיפול עם TGF-β בתאי האנדותל MS-1.

אנליזה מולקולרית של אנדותל-mesenchymal מעבר המושרה על ידי הפיכת גורם גידול-β איתות

פרוטוקול עבור אקסית vivo איברים הקרנית תרבות מודל שימושי עבור לימודי ריפוי הפצע מתואר. מערכת מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות של סוכני כדי לקדם ריפוי משובי או רעילות התרופה סביבה מאורגנת multicellular תלת-ממד.

Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים

כאן, פרוטוקול צעד אחר צעד להכנה וטיפוח של כפתורי הקרנית מפוצל חזירי מוצג. כמו זה אורגאנו-מעובד בדרך כלל מודל תרבות האיברים מראה שיעורי מוות של תאים בתוך 15 ימים, המקבילה לקרנית התורם האנושי, הוא מייצג את המודל הראשון המאפשר טיפוח לטווח ארוך של קרניות לא אנושיות מבלי להוסיף דקטרן רעיל.

מודל של הקרנית של הקרניות הפותל באמצעות לחצני הקרנית מפוצלת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתק את תאי הקרניות של הקרנית (CEC) מהקרום של האישה (DM) באמצעות "YAG" (בלייזר) של ממברנה הvivo לשעבר של המחלה של keratopathy בולולס (BK).

פיתוח של מודל פולשני, בסיוע לייזר של הקרנית הפסד של תא אנדותל

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הקריטיים הנדרשים כדי ליצור ולגדל תרביות תאים של הקרנית מפני הצמח של רקמת האדם או הכבשים. שיטה לתאי הקרנית משנית של תאים אנדותל על קרומי ביוארילים מוצג גם.

צמיחת הקרנית של האדם והכבשים שכבות של תאי-על ביומטריה

אנו מתארים שיטות לחקור TGF-β2-induced EndMT בתאי אנדותל על ידי התבוננות בשינויים במורפולוגיה של התא ובחינת הביטוי שינויי סמן הקשורים EndMT באמצעות כתמי כשל חיסוני. עריכת גנים CRISPR/Cas9 תוארה ושימשה לרוקן את חילזון קידוד הגנים כדי לחקור את תפקידה ב- EndMT הנגרמת על ידי TGF-β2.

אנדותל בתיווך TGF-β למעבר מסנצ'ימלי (EndMT) וההערכה הפונקציונלית של אפקטי EndMT באמצעות עריכת גנים CRISPR/Cas9

כאן, מודלים של בעלי חיים המבוססים על עכבר וארנב מפותחים עבור פגיעה מכנית וכימית של אפיתל הקרנית כדי לסנן טיפולים חדשים ואת המנגנון הבסיסי.

מודלים של בעלי חיים של Ex Vivo ו-In Vivo לפציעות מכניות וכימיות של אפיתל הקרנית

חקור מנגנון מעבר אנדותל-מזנכימלי בקרנית באמצעות תרביות תאי אנדותל בקר ומודל פציעת קרח בעכברוש. שיטה זו מסייעת בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למחלות קרנית.

במבחנה מודלים Vivo ללמוד קרנית האנדותל-mesenchymal מעבר

גלה סרטונים נוספים