המצאה של הפוך קולואיד קריסטל פולי (אתילן גליקול) פיגום: פלטפורמת תרבית תאים תלת ממדי עבור הנדסת רקמות כבדה

המטרה הכללית של הליך זה היא לייצר פיגומים של גבישים קולואידליים הפוכים מבוססי PEG עם מטריצה חוץ-תאית המקודדת עבור יישומי הנדסת רקמת כבד. הנדסת רקמת כבד היא תחום מרגש עבור הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית. אנו יוצרים פיגום הנדסי תלת-ממדי המאפשר לתאי כבד לשמור על תפקודם למשך זמן רב.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות עד לבדיקת תרופות, שכן תאי כבד שגודלו במערכת זו עשויים לשמר את תפקודם למשך זמן רב יותר ולהגיב טוב יותר לתרופות. אף על פי ששיטה זו יכולה לספק תובנות בתחום הנדסת הרקמות, ניתן להחילה אותה גם על מערכות אחרות, כגון מערכות המשתמשות בתאי גזע. את הפרוצדורה תדגים היטומי, סטודנטית לתואר מתקדם מהמעבדה שלי.

להכנת תבניות המיקרו-beads, ראשית חסכו את הקצוות של מבחנות מיקרו-צנטריפוגה עמידות לחום בנפח 0.2 milliliter בגובה של 40 µL. השתמשו בדבק עמיד למים כדי להדביק את החלקים העליונים של המבחנות הגזורות ללוחיות כיסוי מזכוכית של מיקרוסקופ, ולאחר מכן מרחו דבק מסביב לתבניות. לאחר מכן, החליפו את המים בבקבוקון של מיקרוספירות פוליסטירן ב-70% ethanol.

הניחו את תמיסת הכדורים באמבט אולטרסוניאלי ובצעו סוניקציה לתערובת בהספק של 30 watts למשך שלוש דקות כדי לשחרר את הכדורים המצברים. לאחר הכנת המיקרוספירות, העבירו באמצעות פיפט 100 µL של אתנול לכל אחת מהתבניות. לאחר מכן, גזרו ארבעה מילימטרים מקצה של טיפ פיפט של 200 µL והשתמשו בו כדי להעביר 25 µL של מיקרוספירות פוליסטירן לתוך התבנית פעמיים.

הניחו את התבניות על שייקר נדנוד (rocking shaker) והגדירו אותו ל-120 RPM. הניחו לדגימות להישאר על השייקר למשך הלילה. למחרת, הניחו את התבניות תחת מיקרוסקופ ובדקו שהספירות מסודרות במבנה הקסגונלי.

הניחו לאתנול להתאדות בטמפרטורת החדר למשך שני לילות. בשלב זה, הניחו בזהירות את תכנית התבנית והחרוצים בתנור בטמפרטורה של 130 degrees Celsius למשך שש שעות כדי לבצע התמסוך של חרוזי הפוליסטירן וליצור את התבנית השלילית של הפיגום התלת-ממדי. ראשית, סנתזו מקרומרים של פוליאתילן גליקול דיאקרילט באמצעות פרוטוקולים מבוססים כפי שמתואר בשני המקורות הללו.

בשלב הבא, הכינו תמיסה של 50% PEGDA במים דה-יוניים וסובבו את התערובת בצנטריפוגה עד להמסה מלאה. עבור פיגומים המחוברים למטריצה חוץ-תאית, הוסיפו 10% נוספים של krill oil PEG NHS לתמיסת ה-50% PEGDA. לאחר מכן, הכינו תמיססת מלאי של 20% של הפוטו-איניציאטור ב-70% ethanol.

הוסיפו 50 µL של תמיסת הפוטו-יוזם (photo-initiator) עבור כל מיליליטר של תערובת ה-PEGDA. לאחר מכן, ערבבו את התערובת בעזרת וורטקס למשך דקה אחת. לאחר מכן, קלפו את התבניות מהשקופיות, הוציאו את הסריגים בזהירות בעזרת שפכטל והעבירו אותם למבחנות צנטריפוגה נפרדות בנפח 1.5 mL.

העבירו בפיפט 300 microliters של תמיסת ה-PEGDA לתוך כל מבחנה, ולאחר מכן סבבו את המבחנות בצנטריפוגה כדי לאפשר לתמיסת ה-PEGDA לחלחל אל תוך סריג הפוליסטירן. לאחר מכן, הוציאו את הסריג מהמבחנה באמצעות פינצטה וספגו בזהירות שאריות של תמיסת ה-PEGDA מהפני השטח. הניחו את הסריג על זכוכית מכוסה בסרט פראפין, כאשר הפני השטח העגול והשטוח פונה כלפי מעלה.

לאחר מכן, חשפו את הפיגור לקרינת ultraviolet באורך גל של 365 ננומטר למשך חמש דקות באמצעות מנורת UV spot. העבירו כעשרה סבכים גבישיים פולימריים של PEGDA לבקריקה חדשה והוסיפו 20 מיליליטר של THF. נערו את הבקריקות על שייקר אורביטלי במהירות של 300 RPM למשך שש שעות.

הוציאו את המבחנה בכל שעה עד שעתיים והחליפו את הממס המכיל את הפולימר ב-THF טרי. לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו מים לתמיסת ה-THF המשומשת כדי לבדוק אם כדורי ה-PS התמוססו לחלוטין. אם התמיסה לבנה, בצעו שטיפות נוספות עד שהתמיסה תהיה שקופה.

על מנת לעקר את הפיגומים, הכינו מבחורת מיקרוצנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר עם 2 מיליליטר של 70% ethanol עבור כל פיגום, והעבירו את הפיגומים למבחורת באמצעות שפכטל. השאירו את הפיגומים להשריה ב-ethanol למשך שעה אחת. לאחר שעה, שפכו בזהירות את ה-ethanol והחליפו אותו בנפח שווה של PBS סטרילי.

לאחר מכן, סובב את הפיגומים בצנטריפוגה כדי להסיר בועות אוויר. שמור את הפיגומים מהצנטריפוגה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס והוצא אותם בכל שעה עד שעתיים כדי להחליף את התמיסה ב-PBS טרי. לאחר מספר החלפות של PBS, הוצא את הפיגומים לציפוי בקולגן והנח אותם במבחנה המכילה מילליטר אחד של קולגן מסוג one לכל פיגום המיועד לציפוי.

בשלב הבא, סובב את המבחנה בצנטריפוגה כפי שנעשה קודם לכן, ולאחר מכן, נער את הפיגומים ב-400 RPM במנער אורביטלי למשך 30 דקות. אחסן את הפיגומים למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. תרבל תאי קרצינומה של הכבד בצלחות תרבית תאים של 100 מילימטר עם 10 מיליליטר של מצע תרבית.

החליפו את המצע מדי שלושה ימים עד שצפיפות התאים תגיע ל-75 עד 80% משטח התרבית. כאשר התאים מוכנים, הניחו בזהירות את הפיגומים (scaffolds), כאשר הצד השטוח פונה כלפי מעלה, לתוך פלטה בעלת 24 בארות. לאחר מכן, שטפו כל פיגום בשני מיליליטר של PBS.

שאבו את ה-PBS והוסיפו שני מיליליטרים של מצע גידול לפיגומים. לאחר 30 דקות, הסירו את המצע והניחו לפיגום להתייבש למשך שעה אחת. לאחר מכן, קצרו את תאי ההפטאטוקרצינומה באמצעות שיטת עיכול בטריפסין.

לאחר השקעת התאים, הסר את העליון (supernatant) ושחזר את השהייה של המשקע כך שיהיו מיליון תאים ל-25 µL. טפטף באיטיות 25 µL מתליון התאים ישירות על כל פיגום (scaffold). לאחר מכן, כס את הפלטה והצב אותה באינקובטור למשך הלילה.

בשלב הבא, העבירו בזהירות את הפיגומים לפלטה חדשה בעלת 24 בארות והוסיפו באמצעות פפט 2 milliliters של מצע לכל בארה לפני החזרת הפלטה לאינקובטור. כאן מוצגת תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של הפיגום. הוא מורכב ממערך של נקבים במבנה הדוק ביותר משושה (hexagonal closest packed), שקוטרם הממוצע נע בין 100 ל-105 microns, היוצרים קישורי חיבור עם הנקבים השכנים, שקוטרם נע ברובו בין 35 ל-40 microns.

בעת זריעה של תאי הפטוקרצינומה, התאים גדלו והתרבו על פיגומים מצופים מראש בקולגן מסוג 1, אך לא התרבו על פיגומים נטולי ציפוי. בנוסף, תאי ההפטוקרצינומה על הפיגומים מצופי הקולגן הראו תפקוד תאי גבוה יותר באופן התלוי בריכוז. ביום 14, תאי ההפטוקרצינומה שגודלו בפיגומים מסוג ICC מצופים בריכוז של 400 microgram per milliliter הפרשו כמות אלבומין הגדולה פי שלושה מאשר אלו שגודלו בפיגומים נטולי ציפוי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לוודא שכדורי הפוליסטירן בסריג מסודרים כראוי. סידור לקוי יוביל לקישוריות בין-מולקולרית נמוכה, דבר שעלול להשפיע לרעה על פעילות התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מייצרים פיגומים של גבישים קולואידיים הפוכים מבוססי PEG עם ציפוי.

יש לזכור כי עבודה עם tetrahydrofuran עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון עבודה במC M罩 (מנדף) וחבישה של כפפות ומשקפי מגן בעת ביצוע הליך זה.