תפוקה גבוהה ג'ין תיוג ב Trypanosoma brucei

הוספת תג לחלבון היא דרך רבת עוצמה לקבל תובנה לגבי תפקודו. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לתיוג אנדוגני של מאות חלבוני Trypanosoma brucei במקביל כך שניתן להשיג תיוג בקנה מידה גנומי.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לתייג חלבונים ב-Trypansoma brucei בצורה בעלת תפוקה גבוהה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הקינטופלסידים לגבי לוקליזציה ותפקוד פוטנציאלי של קבוצות גדולות של חלבונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לתייג מספר רב של חלבונים במהירות ובקלות במקביל.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי לוקליזציה, ניתן לחקור אינטראקציות של קבוצות גדולות של חלבונים גם באמצעות תגים אחרים. לדוגמה, תג BirA לניסוי מיפוי קרבה של bio-ID. מי שידגים את ההליך יהיה רוס מאדן, עוזר מחקר מהמעבדה שלנו.

לפני תחילת הליך זה, הקפיאו מראש מקרר PCR של 96 בארות במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס. הכן מאסטר מיקס A על ידי שילוב הדברים הבאים בשפופרת של 10 מיליליטר. 2, 100 מיקרוליטר של מים מזוקקים דה-יונים, 105 מיקרוליטר של DMSO בדרגת PCR, 105 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי dNTPs ו-105 מיקרוליטר של תבנית pPOT.

יוצקים את מאסטר מיקס A למאגר ריאגנטים ומכניסים 23 מיקרוליטר של מאסטר מיקס A לכל באר של צלחת PCR של 96 בארות. בעזרת פיפטה רב-ערוצית P20 12 ערוצים, הוסף שני מיקרוליטר של 100 פריימרים מאוגדים מיקרו-מולאריים לכל באר טעונה. אוטמים את הצלחת בסרט.

הנח אותו על מצנן ה-PCR שהתקרר מראש ואפשר לו להקפיא למשך 20 דקות לפחות במינוס 80 מעלות צלזיוס. הקפאת PCR Master Mix A היא קריטית כדי להבטיח תגובת התחלה חמה יעילה, גם בעת שימוש בפולימראז התחלה חמה ספציפי. זה מוביל להגברה ניתנת לשחזור ותשואה גבוהה.

בזמן שלוחית ה-PCR במקפיא, הכינו את Master Mix B.שלב את הדברים הבאים בשפופרת של 10 מיליליטר. 2,048 מיקרוליטר מים מזוקקים דה-יונים, 525 מיקרוליטר של מאגר 10X ו-52.5 מיקרוליטר פולימראז, לנפח כולל של 2,626 מיקרוליטר לצלחת. הסר את לוחית ה-PCR ומצנן ה-PCR מהמקפיא במינוס 80 מעלות צלזיוס.

כשהצלחת עדיין על מצנן ה-PCR, הוסף במהירות 25 מיקרוליטר של מאסטר מיקס B על גבי המאסטר מיקס A הקפוא בכל באר לנפח תגובה כולל של 50 מיקרוליטר. זה קריטי לזמן ויש להשלים אותו לפני שמאסטר מיקס A יוכל להפשיר. אוטמים את הצלחת בסרט.

הגדר את המחזור התרמי באופן הבא. 94 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, לאחר מכן, 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 65 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, ולאחר מכן תקופת הארכה סופית של 72 מעלות צלזיוס למשך שבע דקות. לאחר שהבלוק הגיע ל-94 מעלות צלזיוס, טען את לוחית ה-PCR במחזור התרמי והתחל את תוכנית ההגברה.

התחל הליך זה על ידי הכנת ג'ל אגרוז גדול של 1% במאגר ריצה Tris-acetate EDTA או TAE, עם ארבע שורות של בארות. טען סולם DNA של קילו-בייט אחד לבארות הראשונה וה-28 של כל שורה. השלב הבא הוא העברת שני מיקרוליטר של מוצר PCR ישירות, ללא מאגר טעינת DNA, לכל נתיב של הג'ל, בהתאם לדפוס המוצג כאן.

לדוגמה, מוצרי ה-PCR משורות A ו-B של לוחית ה-PCR נטענים לנתיבים האי-זוגיים והזוגיים של השורה הראשונה של הג'ל, בהתאמה. פועלים במהירות כדי להפחית את האפשרות לזהם את הגברים, טען את מוצרי ה-PCR משורה A של לוחית ה-PCR לנתיבים האי-זוגיים של השורה הראשונה של הג'ל. לאחר מכן, טען את מוצרי ה-PCR משורה B של לוחית ה-PCR לנתיבים הזוגיים של השורה הראשונה של הג'ל.

טען את מוצרי ה-PCR משורות C ו-D של לוחית ה-PCR באמצעות אותה תבנית, כאשר שורה C לנתיבים האי-זוגיים ושורה D לנתיבים הזוגיים של השורה השנייה של הג'ל. המשך בדפוס טעינה זה עד שכל באר של לוחית ה-PCR נטענת על הג'ל. הכניסו את הג'ל למיכל הריצה ומלאו את המיכל במאגר ריצה TAE עד שהג'ל שקוע.

הפעל ב 100 וולט למשך 30 דקות. דמיין באמצעות משדר UV. מוצג כאן ג'ל אימות PCR מייצג של 96 בארות, שבו 95 מתוך 96 בדיקות PCR הצליחו.

ה-PCR שלא הצליח היה H11. הליך זה משתמש ב-Trypansoma brucei, צורה פרוציקלית, קו תאים SMOXP9. גדל את התאים לצפיפות המתאימה כמתואר בטקסט הפרוטוקול וקצור את מספר התאים הנדרש על ידי צנטריפוגה ב-800 פעמים G למשך 10 דקות.

התחל להתכונן לאלקטרופורציה בזמן שהתאים עוברים צנטריפוגה. חבר את המטפל בצלחת לאלקטרופורטור. ביחידת האלקטרופורטור, הגדר את המתח ל-1, 500 וולט, את אורך הדופק ל-100 מיקרו-שניות, את מספר הפולסים ל-12 ואת מרווח הדופק ל-500 אלפיות השנייה.

במטפל הצלחת, הגדר את ספירת הדופק לאחת. באמצעות פיפטה רב-ערוצית P200 12 ערוצים, העבירו את תגובות ה-PCR מלוח ה-PCR לצלחת אלקטרופורציה חד פעמית של 96 בארות. שוטפים את התאים ב -10 מיליליטר של ציטומיקס וצנטריפוגה שונה, שוב ב -800 פעמים G למשך 10 דקות.

השעו מחדש את התאים ב -23 מיליליטר של ציטומיקס שונה לריכוז סופי של חמישה פעמים 10 עד התאים השביעיים למיליליטר. העבר את תרחיף התא למאגר מגיב. פיפטה 200 מיקרוליטר מתמיסת התא לכל באר של צלחת האלקטרופורציה וערבב עם מוצר ה-PCR על ידי פיפטינג.

השתמש בטישו כדי להסיר טיפות מהחלק העליון של הצלחת כדי למנוע קצר חשמלי. מרחו סרט איטום על החלק העליון של לוחית האלקטרופורציה, ומקמו אותה כך שתשאיר את החורים לאלקטרודות חשופות בחלק העליון והתחתון של כל עמודה. הימנע מכיסוי הנקודות המוגבהות המשמשות להנחיית הסרט.

טען את לוחית האלקטרופורציה לתוך מטפל הצלחת וסגור את המכסה. לחץ על הדופק" ביחידת האלקטרופורטור. לאחר האלקטרופורציה, יש להעביר את התאים במהירות לארבע צלחות תרבית רקמה בנות 24 בארות המכילות מיליליטר אחד של מדיה SDM-79 לבאר לצורך התאוששות.

השתמש בפיפטה רב-ערוצית P200 12 ערוצים כאשר כל קצה שני חסר, כך שששת הקצוות הנותרים מסתדרים עם שש השורות בצלחת תרבית רקמה בת 24 בארות. לאחר העברת התאים מצלחת 96 הבארות לצלחת 24 הבארות, שטפו את הבארות בצלחת 96 הבארות במדיה מהבארות המתאימות בצלחת 24 הבארות. לאחר מכן, העבירו את השטיפה בחזרה לבארות בצלחת 24 הבארות.

העבר את התאים האלקטרופורטיים מלוח האלקטרופורציה של 96 הבארות ללוחות תרבית הרקמה של 24 הבארות בתבנית המוגדרת מראש המוצגת כאן. לדוגמה, תאים מהבארות האי-זוגיות של שורה A של לוח 96 הבארות מועברים לשורה A של לוח A, ואילו תאים מהבארות הזוגיות של שורה A מלוח 96 הבארות מועברים לשורה A של לוח C.לאחר כל העברה של התאים מלוח 96 הבארות לצלחת 24 הבארות, שוטפים את הבארות בצלחת 96 בארות עם מדיום מהשורה המתאימה של צלחת 24 הבארות. לאחר מכן, העבירו את הכביסה בחזרה לצלחת 24 הבארות.

העברת תאים לצלחות של 24 בארות היא מבלבלת, אך אתה חייב להיות מסוגל לעקוב אחר קווי התאים המתקבלים לגן הנכון ID.It הוא קריטי כדי לבצע את הצעד הזה במהירות כדי לשמור על בריאות התאים. לאחר שכל התאים האלקטרופורטיים הועברו לארבע צלחות 24 הבארות, הניחו את צלחות 24 הבארות בקופסת פלסטיק נקייה עם מכסה היוצר אטימה הדוקה. הכניסו את הקופסה לאינקובטור של 28 מעלות צלזיוס.

בין שש לשמונה שעות לאחר מכן, הוסיפו לכל באר מיליליטר אחד של SDM-79 עם 10% FCS המכיל אנטיביוטיקה סלקטיבית. דגירה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך תשעה עד 10 ימים עד שקווי תאים טרנסגניים נראים לעין. לאחר טרנספקציה של 96 בארות לתיוג 96 חלבונים שונים בקצה הקצה, התאים מועברים ללוחות תרבית רקמה של 24 בארות לצורך התאוששות ובחירה.

לאחר מכן כל באר מוערכת כדי לקבוע אם היא מכילה תאים בריאים ועמידים לתרופות. באר בריאה מכילה בעיקר תאים פעילים מאוד ובהירים במיקרוסקופ ניגודיות פאזה. בסכימה זו בדוגמה, ירוק מייצג באר עם טרנספקציה מוצלחת, ואפור מייצג באר עם תאים מתים בלבד.

88 מתוך 96, או 92% מהבארות, מכילים טפילים שעברו טרנספטציה מוצלחת לאחר 15 יום של סלקציה. לאחר השליטה, ייקח כשעה מספירת התאים ועד לציפוי שלהם לאחר אלקטרופורציה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להוסיף את התרופות הסלקטיביות שש עד שמונה שעות לאחר הטרנספקציה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתייג קבוצות גדולות של חלבונים ב-Trypansoma brucei.