Name: תפוקה גבוהה גין תיוג ב Trypanosoma brucei (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: למד שיטת תיוג חלבונים בקנה מידה רחב ב-Trypanosoma brucei באמצעות PCR ואלקטרופורציה. פרוטוקול זה מאפשר חקר לוקליזציה ופונקציה של קבוצות גדולות של חלבונים בפרוטוזואה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

SD נתמך על ידי מלגת סר הנרי וולקאם [092201/Z/10/Z]. עבודה זו מומנה על ידי מענקי קרן וולקאם [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] לפרופסור קית' גול. ברצוננו להודות לפרופסור קית' גול על שיחות ותובנות מועילות.

1. 96-היטב ארוך פריימר PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא קדם 96-היטב קריר PCR במקפיא -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 10 מ&quot;ל, להכין מיקס מאסטר: 2,100 μl DDH 2 O, 105 μl PCR כיתה DMSO, 105 μl 10 מ&quot;מ dNTPs, 105 μl תבנית pPOT (25 ng / μl) 9 עבור בנפח כולל של 2,415 μl לכל צלחת . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 23 μl לבאר כל צלחת 96-היטב PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של 100 מיקרומטר ונקוו פריימרים לכל טעון היטב בעזרת פיפטה רבה P20 12 ערוץ. חותם עם הסרט, מקום צלחת על קריר PCR מראש צונן ולאפשר להקפיא למשך תקופה מינימלית של 20 דקות ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 10 מ&quot;ל, להכין מיקס מאסטר B: 2,048 μl DDH 2 O, 525 μl 10x חיץ, 52.5 פולימראז μl עבור בנפח כולל של 2,626 μl לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת קרירה PCR מהמקפיא -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הצלחת עדיין על מקרר PCR, להוסיף 25 μl מיקס מאסטר B על גבי קפאn מיקס מאסטר A עבור נפח תגובה כולל של 50 μl. זהו זמן קריטי, ואת אמור להסתיים לפני לערבב יכול להפשיר. חותם צלחת עם סרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר Cycler תרמית כדלקמן: 94 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 65 ° C למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ואחריו תקופת הארכה סופית של 72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צלחת ה- PCR לאחר הבלוק הגיע 94 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. אימות של 96-היטב ארוך פריימר PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עופרת 1% גדול (w / v) agarose ג&#39;ל טריס Acetate EDTA (TAE) הפעלת המאגר במסרקות 4 x 28-גם לתת ג&#39;ל עם 4 שורות של בארות. יישר שיניים חלופיות של המסרק בקצות טפטפו רב 12 ערוץ. בזהירות להטביע את ג&#39;ל בטאי הפעלת המאגר לאחר נתיבים נטענים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סולם DNA 1 טען kb לתוך -1 ו -28 th היטב של כל שורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רב ערוצי P20 12 ערוץ, להעביר 2 μl של dir המוצר PCRectly לכל נתיב של (איור 1 א) ג&#39;ל. עשה זאת מהר כדי לצמצם את האפשרות של זיהום amplicons. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מוצרי ה- PCR משורה א &#39;של הצלחת ה- PCR לתוך נתיבי בעל מספר אי זוגי של השורה ה -1 של ג&#39;ל (A1 - מסלול 3, A2 - מסלול 5 ...... A11 - ליין 23, A12 - ליין 25) ולטעון את מוצרי ה- PCR משורה ב &#39;של הצלחת ה- PCR לתוך נתיבי הזוגיים של שורה 1 st של הג&#39;ל (B1 - מסלול 4, A2 - מסלול 6 ...... B11 - ליין 24, B12 - ליין 26). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מוצרי ה- PCR מן השורה C ו- D של הצלחת ה- PCR באמצעות אותו דפוס כפי שתואר לעיל, עם שורה C לתוך נתיבי האי-זוגיים ושורה D לתוך נתיבי הזוגיים. המשך דפוס טעינה זה עד היטב כל צלחת ה- PCR נטען על ג&#39;ל. חיץ טעינת ה- DNA אינו נדרש לטעון ג&#39;ל זה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הג&#39;ל לתוך הטנק ריצה למלא את המיכל עם TAE הפעלת המאגר עד ג&#39;ל הוא שקוע. הפעל ב -100 V למשך 30 דקות ולאחרלדמיין באמצעות transilluminator UV. ראה איור 1B עבור ג&#39;ל למשל. הערה: מוצרי ה- PCR יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות לפני transfection </li></ol> 3. Transfection 96-היטב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ט תא brucei טופס procyclic קו 10 SMOXP9 עבור הליך זה ולגדול התקשורת SDM-79 המכיל 10% 10 FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1 x 10 7 תאים לכל transfection (סה&quot;כ 1.1 x 10 9 תאים) בעת תיוג על הקצה האמין של החלבון ו -2 x 10 7 תאים לכל transfection (סה&quot;כ 2.2 x 10 9 תאים) בעת תיוג על התחנה הסופית ג &#39; החלבון. לשמור על התאים ב-יומן באמצע (1.2 x 10 6 -1 x 10 7 תאים / מ&quot;ל) במשך כמה ימים לפני transfection ו לקצור את התאים עבור transfection בצפיפות של 5-8 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מוצרי ה- PCR קפוא עבור transfection להפשיר בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות haemocytometer או נגד תא אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה נדרש מספר תאי צינורות 50 מ&quot;ל מספר 800 XG במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה להשליך supernatant ו resuspend התאים ב 10 מ&quot;ל cytomix שונה (0.8 מ&quot;מ EGTA, 24 KCl מ&quot;מ, 0.15 מ&quot;מ CaCl 2, 10 מ&quot;מ pH7.6 חיץ אשלגן פוספט, 25 מ&quot;מ HEPES-KOH pH7.6, 2.6 מ&quot;מ MgCl 2, 0.5% (w / v) גלוקוז, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​BSA, 1 מ&quot;מ hypoxanthine, 144 סוכרוז מ&quot;מ) לכל צינור. להעביר את כל פתרונות לתא צינור יחיד ספין שוב ב 800 XG במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, להשליך supernatant ו resuspend התאים 23 מ&quot;ל של cytomix שונה ריכוז סופי של 5 x 10 7 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד התאים ספינינג, להוסיף 1 מ&quot;ל של SDM-79 התקשורת היטב כל 4 x 24 גם צלחות בתרבית רקמה. לייבל צלחות לספירה ולהסיק טבעת סביב היטב A1 על כל צלחת בטוש לסייע להתמצאות צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המטפל הצלחת אל electroporator. על electroporaיחידת טור להגדיר את המתח ל -1,500 V, אורך הפולס ל -100 μsec ומספר פולסים עד 12 ואת המרווח הדופק ל -500 מילי-שניות. על מטפל הצלחת, להגדיר את ספירת הדופק ל -1 זה מבטיח כי electroporator יחול דופק יחיד בין 12 העמודים של צלחת electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רב ערוצי ערוץ 12 P200, להעביר את התגובות PCR מהצלחת PCR על צלחות electroporation הפנויה 96-היטב, 4 מ&quot;מ הפער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים כבר הסתובב הם resuspended לריכוז סופי של 5 x 10 7 תאים / מ&quot;ל (שלב 3.7), להעביר למאגר מגיב. פיפטה 200 μl של פתרון התא לתוך הבאר כל צלחת electroporation באמצעות פיפטה רב ערוץ 12 P200, לערבב עם מוצר ה- PCR על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות רקמות להסיר כל טיפות מהחלק העליון של הצלחת להימנע-קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בסרט איטום מסופק באריזה צלחת לראש צלחת electroporation, positioning זה כדי להשאיר את החורים עבור אלקטרודות שנחשפו בחלק העליון והתחתון של כל עמודה. הימנע מכסה את הנקודות שהועלו נהג להנחות את הסרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צלחת electroporation לתוך מטפל הצלחת ולסגור את המכסה. &#39;דופק&#39; לחץ על יחידת electroporator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electroporation, במהירות ולהעביר את התאים מצלחת electroporation 96-היטב צלחות תרבית 4 x 24 גם רקמה. כדי להעביר את התאים, להשתמש פיפטה רב ערוץ 12 P200 עם כל הטיפ השני חסר כאלה כי 6 טיפים הנותרים ליישר קו עם 6 שורות על צלחת בתרבית רקמה 24 גם. העברת תאי electroporated ב צלחות electroporations 96-היטב תבנית מוגדרת מראש על הצלחות בתרבית רקמת 24 גם (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הטיפים פיפטה P200 - לכל transfection 96-גם להכין 2 קופסאות של 96 טיפים עם כל עמודה אחרים יוסרו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות העברת A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 על צלחת electroporation 96-היטבצלחת שורת הצלחות תרבות 24 גם רקמות, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 לתוך שורה B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 לתוך שורה C ו- D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 לתוך שורה ד לאחר העברת כל סט של 6 בארות מהצלחת 96-היטב צלחת 24 גם, בארות בצלחת 96-היטב ולאחר מכן נשטפים עם התקשורת מבארות מקביל 24- גם צלחת ואת לשטוף מועבר בחזרה אל בארות בצלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות העברת E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 על צלחת electroporation 96-היטב 24 גם שורת צלחת B, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 לתוך שורה B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 לתוך שורה C ו- H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 לתוך שורה ד לאחר העברת כל סט של 6 בארות מהצלחת 96-היטב צלחת 24 גם, מהבארות 96 צלחת &quot;טוב הם מכן לשטוף עם תקשורת מבארת המקבילה צלחת 24 היטב בכביסה הוא הועברה לאחר מכן חזרה אל הבארות בצלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות העברת A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 על צלחת electroporation 96-היטב לשורה C צלחת 24 גם, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 לתוך שורה B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 לתוך שורה C ו- D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 לתוך שורה ד לאחר העברת כל סט של 6 בארות מן 96 צלחת &quot;טוב לצלחת 24 באר, בארות בצלחת 96-היטב ולאחר מכן לשטוף עם התקשורת מבארות מקביל צלחת 24 היטב בכביסה הוא הועבר לאחר מכן חזרה אל בארות בצלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות העברת E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 על צלחת electroporation 96-היטב 24 גם שורת צלחת D, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 לתוך שורה B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 לתוך שורה C ו- H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 לתוך שורה ד לאחר העברת כל סט של 6 בארות מהצלחת 96-היטב צלחת 24 גם, מהבארות 96 צלחת &quot;טוב הם מכן לשטוף עם תקשורת מבארת המקבילה צלחת 24 היטב בכביסה הוא הועברה לאחר מכן חזרה אל הבארות בצלחת 24 גם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב הפוך, לבחון 1 היטב מכל עמודה לבדוק את התאים. יהיו תערובת של תאים חיים ומתים עםכמות משמעותית של פסולת התא. ניתן להבחין בתאי חיים מן התאים מתים משום שהם יהיו בהירים תחת מיקרוסקופ לעומת השלב יתקדמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את 24 גם צלחות בקופסא נקיה, פלסטיק עם מכסה המהווה חותם חזק. להניח את התיבה C חממה 28 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין 6-8 שעות מאוחר יותר, להוסיף 1 מ&quot;ל של SDM-79 עם 10% FCS המכיל אנטיביוטיקה סלקטיבית 2x היטב כל אחד. מניסיוננו, שורות תאים שבם הגנים מתויגים על הקצה האמין עמידות ריכוזים גבוהים יותר של תרופה סלקטיבית. לכן, באמצעות blasticidin כדוגמא, תיוג על הקצה האמין דורש ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מיליליטר blasticidin ותיוג על התחנה הסופית C דורש ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר blasticidin. הערה: שורות תאים מהונדסות תהפוכנה 9-10 ימים גלויים לאחר transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר לפחות פעמי תרופה טריה תקשורת לפני הניתוח. איור 2B מראה את התוצאות של transfe 96-היטב טיפוסיction לתיוג 96 חלבונים שונים על הקצה האמין. להעריך כל טוב על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב כדי לקבוע אם הוא מכיל תאים עמידים בריאים, סמים. באר בריא מכיל בעיקר (&lt;95%) תאים פעילים מאוד כי הם בהירים במיקרוסקופ חוזה שלב. ניתוח לאחר מכן על ידי מיקרוסקופיה epifluorescence או כתם המערבי נדרש לקבוע אם החלבון תויג בהצלחה. </li></ol>

<ol><li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei%3A+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li>
<li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).</li>
<li>Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interference+in+Trypanosoma+brucei+by+heritable+and+inducible+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA.</a> RNA. 6 (7), New York, NY. 1069-1076 (2000).</li>
<li>Alsford, S., Turner, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+phenotyping+using+parallel+sequencing+of+RNA+interference+targets+in+the+African+trypanosome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome.</a> Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).</li>
<li>Alsford, S., Eckert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+decoding+of+antitrypanosomal+drug+efficacy+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance.</a> Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).</li>
<li>Mony, B. M., MacGregor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+dissection+of+the+quorum+sensing+signalling+pathway+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).</li>
<li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Séraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration+%3A+Abstract+Nature+Biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology.</a> Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Los, G. V., Encell, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HaloTag%3A+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li>
<li>Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+enabling+efficient%2C+scalable+and+reproducible+gene+tagging+in+trypanosomatids%5BTitle%5D)+AND+%22Open+biol%22%5BJournal%5D)">A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids.</a> Open biol. 5 (1), 140197(2015).</li>
<li>Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+and+optimized+single+marker+system+for+generating+Trypanosoma+brucei+cell+lines+expressing+T7+RNA+polymerase+and+the+tetracycline+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22Open+biol%22%5BJournal%5D)">A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor.</a> Open biol. 2 (2), 110037(2012).</li>
<li>Lam, S. S., Martell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+meth%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).</li>
<li>Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells%2C+tissues%2C+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS biology. , (2011).</li>
<li>Schimanski, B., Nguyen, T. N., Günzl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+tandem+affinity+purification+of+trypanosome+protein+complexes+based+on+a+novel+epitope+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination.</a> Eukaryotic Cell. , (2005).</li>
<li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שיפור דרמטי את הרגישות של חקר החלבונים ושיטות transcriptomics ב 5-10 השנים האחרונות סיפקה נתונים חשובים על אלפי גנים ומוצריהם. עם זאת, את הכלים כדי להתמודד עם תפקודם של חלבונים אלה לא עמדו בקצב. תיוג חלבון הופך לפשוט ניסויים רבים כדי לקבוע את תפקידו. לדוגמא, חלבון יכול להיות התמזג חלבון פלואורסצנטי במגוון צבעים שונים כדי להקל על מחקרי לוקליזציה שיתוף לוקליזציה. תגיות שפותחו עבור במיקרוסקופ אלקטרונים, כגון APEX2 או miniSOG 11,12, לאפשר לוקליזציה ultrastructural של החלבון המתויג. תגיות עבור ביוכימיה, כגון תג TAP, ו ProtC-TEV-ProtA (PTP) לתייג 7,13 לאפשר טיהור של מתחמים הקשורים החלבון לזיהוי שותפים מחייבים או מבחני ביוכימיים במבחנה. הצעדים הספציפיים הם קריטיים להצלחת protocol הוא: השילוב של DMSO לתערובת 1 מאסטר PCR, מקפיא של מיקס מאסטר PCR 1 לפני התוספת של מיקס מאסטר 2, השימוש פולימראז המסחרי מיקס מאסטר 2 ואת השינוי של חיץ electroporation cytomix. מניסיוננו, יש צורך להשתמש כפול ממספר תאים עבור transfections תיוג מסוף C ובאשר transfections תיוג מסוף N על מנת להשיג שיעור דומה של בארות חיוביות. לכן, כל הצעדים צריכים להתבצע כפי שתוארו. טכניקה זו עשויה היחידה להצליח כאשר transfecting trypanosome טופס procyclic חרקים. יש צורות דם יעילה transfection נמוך 14, יתר על כן הם צפויים למות במהלך בחירה בשל רעילויות צפיפות תלויה כי אינה קשורה לתרופה סלקטיבית. לכן, הפרוטוקול הקודם שלנו מייצג את הטכנולוגיה הטובה ביותר הנוכחית עבור תיוג של trypanosomes טופס דם 9. כמו כן סביר להניח כי טרנסיעילות fection תשתנה תלוי לבודד trypanosome הספציפי. פרוטוקול זה היה מותאם באמצעות 927 SMOX צורות procyclic - זנים אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה נוספת. צעדים שעשויים להגביר את סיכויי הצלחת כוללים: הגדלת הסכום של amplicon PCR, הגדלת מספר התאים הכלולים transfection. אנו מציגים שיטה שבה מאה חלבונים יכולים להיות מתויגות במקביל. זה יקל מחקרים בקנה מידה גדול על לוקליזציה ואינטראקציה, המשלימה מערכי נתונים גדולים קיימים ומתן מידע שלא יסולא בפז לקהילה. תבניות פריימר יימסרו לכל מבקש ורשימת תבניות פלסמידים זמין מ: http://www.sdeanresearch.com/

Trypanosoma brucei הוא טפיל protozoan שגורמת trypanosomasis אדם אפריקאי nagana בבקר. ט brucei הוא אורגניזם אידיאלי לניתוח תפקוד חלבון עקב השילוב של הגנום באיכות גבוהה, פרוטאומיקה רב מערכי נתוני transcriptomics וכלים מולקולריים מפותחים 1-3. התקדמות פרוטאומיקה וסדר גרמה מערכי נתונים גדולים המדגישים גנים מעניינים פוטנציאל 4-6; יש עם זאת, גנים רבים מידע מינימאלי הקשורים בהם במסדי הנתונים הקיימים. לכן יש צורך שיטת תפוקה גבוהה כדי לסייע ואפיון חלבונים פונקציונלי. ביטוי של חלבון מתויג יכול לתת ריבוי תובנה הפונקציה של חלבון. לדוגמה, חלבון מסומן בחלבון או epitope ניאון יכול להיות מקומי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר נותן מידע על המקום ממנו protעין עלולה להיות הפעלת ההשפעה הביולוגית שלה. לחלופין, חלבון מתויג עם ברז 7, HaloTag 8 או התג שלו יכול להיות מטוהר עבור מבחני ביוכימיים ואיתור שותפי האינטראקציה שלה. אנחנו לאחרונה פתחנו מתודולוגיה תיוג חזקה ט brucei 9. זה זמן רב בשימוש פריימר PCR על מנת ליצור את ה- DNA עבור transfection ואפשר התיוג של עשרות חלבונים במקביל - שיפור משמעותי כדי פרוטוקולים קיימים. עכשיו שיפרנו את יכולת ההרחבה של פרוטוקול זה בצורות procyclic ידי סדר גודל. כאן, אנו מציגים את השיטה שלנו שבו אנחנו מבצעים את PCR ו transfection לתוך צלחות 96-היטב, עם ההתאוששות והבחירה המתרחשים 24 גם צלחות. צירופם של מאות חלבונים יכול עכשיו להיות מתויג במקביל שיטה זו מספקת חסכונית ריאלי שיטה תיוג הגנום trypanosome כולו.

<table><tbody><tr><td>אוליגונוקלאוטיד</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>עם</td><td>מלח בלבד (אין להשתמש בטיהור נוסף)</td></tr> <tr><td>DMSO</td><td>Roche</td><td>כלול בחבילת הרחבת HiFi</td><td>חייב להיות בדרגת PCR</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>כל מכובד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>הרחב HiFi פולימראז</td><td>רוש</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM830</td><td>הרווארד מכשיר</td><td></td><td>אלקטרופורטור</td></tr><tr><td>HT-200 מטפל בלוחות</td><td>הרווארד מכשיר</td><td>HT-200</td><td>מטפל בפלטות האלקטרוניות 96 בארות</td></tr><tr><td>MOS 96 ELECTROPLATE 4 מ"מ</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>45-0452</td><td>Electroplate עבור אלקטרופורציה של 96 בארות</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>Melford</td><td>3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin b Gold</td><td>Invivogen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Phleomycin</td><td>Melford</td><td>P0187</td><td></td></tr><tr><td>225 ס"מ בקבוק TC, צוואר משומר, כובע פנולי</td><td>Appletonwoods</td><td>BC006</td><td></td></tr><tr><td>24 צלחות תרבית באר</td><td>Appletonwoods</td><td>BC017</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&reg; PCR Cooler, מערכת אחסון קר ללא קרח ל-96 צלחות באר וצינורות PCR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96-well Multiply&reg; לוחית PCR עם חצאית רוחבית</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.203</td><td></td></tr></tbody></table>

תפוקה גבוהה ג&#39;ין תיוג ב<em&gt; trypanosoma brucei</em

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

שיפורים בספקטרומטריית מסה, ריצוף וביואינפורמטיקה יצרו מערכי נתונים גדולים של גנים בעלי פוטנציאל מעניין. תיוג חלבונים אלה יכול לתת תובנות לגבי תפקודם על ידי קביעת הלוקליזציה שלהם בתוך התא ומתן אפשרות לזיהוי שותפים לאינטראקציה. לאחרונה פרסמנו שיטה מהירה וניתנת להרחבה ליצירת קווי תאי Trypanosoma brucei המבטאים חלבון מתויג מהלוקוס האנדוגני. השיטה התבססה על פלסמיד שיצרנו, שכאשר הוא משולב עם PCR פריימר ארוך, ניתן להשתמש בו כדי לשנות גן לקידוד חלבון המתויג בכל אחד מהקצות. זה מאפשר תיוג של עשרות חלבוני טריפנוזום במקביל, מה שמקל על אימות בקנה מידה גדול של גנים מועמדים מעניינים. ניתן להשתמש במערכת זו כדי לתייג חלבונים ללוקליזציה (באמצעות חלבון פלואורסצנטי, תג אפיטופ או תג מיקרוסקופ אלקטרונים) או ביוכימיה (באמצעות תגים לטיהור, כגון תג TAP (טיהור זיקה טנדם). כאן, אנו מתארים פרוטוקול לביצוע ה-PCR הארוך והאלקטרופורציה בצלחות של 96 בארות, כאשר ההתאוששות והבחירה של טריפנוזומים טרנסגניים מתרחשים בצלחות של 24 בארות. עם זרימת עבודה זו, ניתן לתייג מאות חלבונים במקביל; זהו שיפור בסדר גודל לפרוטוקול הקודם שלנו ותיוג קנה מידה גנומי אפשרי כעת.

בשנת transfection נציג זה, פריימרים תוכננו באמצעות סקריפט perl תגית 9 ו מסונתז מסחרית. 96-גם PCR בוצע ומאומת כמתואר (איור 1 א); בדוגמה זו, 95/96 PCRs היו מוצלחים (איור 1B). מניסיוננו, חוזר תגובות נכשלו גם עם פריימרים המקורי או פריימרים-מסונתז מחדש לא לגרום PCR מוצלח. Amplicons הועבר לתוך צלחות electroporation 96-היטב עבור electroporation (איור 2 א) ולאחר מכן מועבר צלחות תרבות 24 גם להתאוששות ובחירה. אחרי מספיק זמן כדי לאפשר את הבחירה להתרחש, הבארות דורגו להישרדות לפני ניתוח נוסף. בדוגמה זו, 88/96 בארות (92%) היו חיוביות לאחר בחירת 15 ימים. <ialt מ&quot;ג = &quot;איור 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54,342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; איור 1: אימות של פריימר ארוך PCR (א) תבנית להעברת מוצרים PCR מ 96-גם צלחת PCR על ג&#39;ל agarose למתן תוקף של PCR.. (ב) ג&#39;ל אימות 96-היטב PCR נציג תיוג 95 גנים על הקצה האמין, ו -1 amplicon המכיל מס &#39;5 &quot;הומולוגית מיקוד לפעול כביקורת שלילית transfection. הדגימות הועמסו על 1% (w / v) agarose ג&#39;ל והחליטו ב -100 V למשך 30 דקות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> איור 2: 96-היטב electroporation ובחירה (א) תבנית להעברת תאי electroporated מ -96 היטב plat electroporation.דואר צלחות בתרבית רקמה 24 גם. (ב) סכימטי מראה ניקוד חי / מת בדרך כלל אחרי 15 ימים של בחירת 24 גם צלחות. הירוק מייצג transfection מוצלח, אפור מייצג היטב עם תאים מתים בלבד. בדוגמא זו, 88/96 (92%) של בארות כלולות טפילי transfected בהצלחה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

הוספת תג לחלבון היא דרך רבת עוצמה לקבל תובנה לגבי תפקודו. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לתיוג אנדוגני של מאות חלבוני Trypanosoma brucei במקביל כך שניתן להשיג תיוג בקנה מידה גנומי.

תפוקה גבוהה ג&#39;ין תיוג ב<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

המטרה הכללית של שיטה זו היא לתג תבליטים בחלבונים ב-Trypansoma brucei באופן בעל תפוקה גבוהה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הקינטופלסטידים בנוגע למיקום ולתפקוד הפוטנציאלי של קבוצות גדולות של חלבונים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לתג מספר רב של חלבונים במהירות ובקלות במקביל.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי לוקליזציה, ניתן לחקור אינטראקציות של קבוצות גדולות של חלבונים גם באמצעות תגים אחרים. לדוגמה, תג BirA עבור ניסוי מיפוי קרבה מסוג bio-ID. את הפרוצדורה ידגים Ross Madden, עוזר מחקר מהמעבדה שלנו.לפני תחילת הפרוצדורה, הקפיאו מראש קירור PCR בעל 96 בארות במקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. הכינו את תערובת מאסטר A על ידי ערבוב של הרכיבים הבאים במבחנה של 10 מיליליטר: 100 מיקרוליטר של מים מזוקקים ודה-יוניים, 105 מיקרוליטר של DMSO בדרגת PCR, 105 מיקרוליטר של dNTPs בריכוז 10 מילימולר, ו-105 מיקרוליטר של תבנית pPOT.שפכו את Master Mix A למכל ריאגנטים והעבירו מנה של 23 µL של Master Mix A לכל באר בלוח PCR בעל 96 בארות. באמצעות פיפט רב-ערוצי P20 בעל 12 ערוצים, הוסיפו 2 µL של תערובת פריימרים בריכוז 100 µM לכל באר מלאה. אטמו את הלוח באמצעות סרט איטום.הנח אותו על קירור ה-PCR שקולל מראש והשאר אותו להקפאה למשך 20 דקות לפחות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. הקפאת ה-PCR Master Mix A היא קריטית כדי להבטיח תגובת hot start יעילה, גם כאשר משתמשים ב-hot start polymerase ספציפי. דבר זה מוביל להגברה בעלת תפוקה גבוהה וניתנת לשחזור.בזמן שפלטת ה-PCR נמצאת במקפיא, הכינו את תערובת המאסטר B. ערבבו את הרכיבים הבאים במבחנה של 10 milliliter: 2,048 µL של מים מזוקקים ודה-יוניים, 525 µL של 10X buffer, ו-52.5 µL של polymerase, לנפח כולל של 2,626 µL לכל פלטה. הוציאו את פלטת ה-PCR ואת מקירר ה-PCR מהמקפיא של 80°C-.כאשר הפלטה עדיין נמצאת על קירור ה-PCR, הוסיפו במהירות 25 µL של Master Mix B על גבי Master Mix A הקפוא בכל באר, לנפח תגובה כולל של 50 µL. שלב זה הוא קריטי מבחינת זמן ויש להשלימו לפני ש-Master Mix A יפשיר. אטמו את הפלטה באמצעות סרט איטום (film).הגדירו את המעגל התרמי באופן הבא: 94 °C למשך 10 דקות, לאחר מכן 30 מחזורים של 94 °C למשך 15 שניות, 65 °C למשך 30 שניות ו-72 °C למשך שתי דקות, ואז שלב הארכה סופי של 72 °C למשך שבע דקות. לאחר שהבלוק הגיע ל-94 °C, הכניסו את פלטת ה-PCR למעגל התרמי והפעילו את תוכנית ההגברה.התחילו את ההליך בהכנת ג'ל אגרוזה גדול בריכוז 1% בבופר הרצה Tris-acetate EDTA או TAE, עם ארבע שורות של בארות. טענו סולם DNA של 1 kb לבארה הראשונה והבארה ה-28 בכל שורה. השלב הבא הוא העברה של שני מיקרוליטרים של תוצר PCR באופן ישיר, ללא בופר טעינה של DNA, לכל נתיב בג'ל, בהתאם לדפוס המוצג כאן.לדוגמה, את תוצרי ה-PCR משורות A ו-B של פלטת ה-PCR טוענים לתעלות בעלות המספרים האי-זוגיים והזוגיים של השורה הראשונה בג'ל, בהתאמה. כדי לצמצם את האפשרות לזיהום האמפליקונים, עבדו במהירות וטענו את תוצרי ה-PCR משורה A של פלטת ה-PCR לתעלות בעלות המספרים האי-זוגיים של השורה הראשונה בג'ל. לאחר מכן, טענו את תוצרי ה-PCR משורה B של פלטת ה-PCR לתעלות בעלות המספרים הזוגיים של השורה הראשונה בג'ל.טענו את תוצרי ה-PCR משורות C ו-D של פלטת ה-PCR לפי אותה תבנית, כאשר שורה C תיטען למסלולים בעלי המספרים האי-זוגיים ושורה D למסלולים בעלי המספרים הזוגיים בשורה השנייה של הג'ל. המשיכו בתבנית טעינה זו עד שכל באר בפלטת ה-PCR תיטען לג'ל. הניחו את הג'ל בתוך מיכל ההרצה ומלאו את המיכל בבופר הרצה TAE עד שהג'ל יהיה שקוע.הרץ במתח של 100 volts למשך 30 דקות. בצע ויזואליזציה באמצעות UV transilluminator. מוצג כאן ג'ל אגרוזה מייצג לאישור PCR של 96 בארות, שבו 95 מתוך 96 תגובות ה-PCR הצליחו.ה-PCR שלא הצליח היה H11. הליך זה משתמש ב-Trypansoma brucei, צורה פרוציקלית, שורת תאים SMOXP9. גדלו את התאים לצפיפות המתאימה כפי שמתואר בטקסט הפרוטוקול ואספו את מספר התאים הנדרש על ידי סבוב בצנטריפוגה ב-800 times G למשך 10 דקות.התחילו בהכנות לאלקטרופורציה בזמן שהתאים נמצאים בצנטריפוגה. חברו את ידית הפלטות (plate handler) למכשיר האלקטרופורטור. ביחידת האלקטרופורטור, הגדירו את המתח ל-1,500 volts, את אורך הפולס ל-100 microseconds, את מספר הפולסים ל-12, ואת מרווח הפולסים ל-500 milliseconds.במטפל הפלטות (plate handler), הגדירו את מספר הפולסים לאחד. באמצעות פיפט רב-ערוצי 12-ערוצים P200, העבירו את תגובות ה-PCR מפלטת ה-PCR לפלטת אלקטרופורציה חד-פעמית בעלת 96 בארות. שטפו את התאים ב-10 milliliters של cytomix משופר וסבבו שוב בצנטריפוגה ב-800 times G למשך 10 דקות.שחזר את התאים ב-23 milliliters של cytomix משופר לריכוז סופי של 5×10⁷ תאים ל-milliliter. העבר את תליית התאים למאגר ריאגנטים. טפטף 200 microliters של תמיסת התאים לכל באער של פלטת האלקטרופורציה וערבב עם תוצר ה-PCR באמצעות פיפטור.השתמשו בנייר סופג כדי להסיר טיפות נוזל מחלקו העליון של הפלטה כדי למנוע קצרים חשמליים. הצמידו סרט איטום לחלקו העליון של פלטת האלקטרופורציה, תוך מיקום הסרט כך שחורי האלקטרודות בחלקם העליון והתחתון של כל עמודה יישארו פתוחים. הימנעו מכיסוי הנקודות הבולטות המשמשות להנחיית הסרט.הכנס את פלטת האלקטרופורציה למטפל בפלטות (plate handler) וסגור את המכסה. לחץ על pulse"on ביחידת האלקטרופורטור. לאחר האלקטרופורציה, יש להעביר את התאים במהירות לארבע פלטות תרבית רקמה בעלות 24 בארות, המכילות 1 ml של מצע SDM-79 בכל בארה לצורך התאוששות.השתמשו בפיפט רב-ערוצי בעל 12 ערוצים (P200) כאשר כל טיפ שני חסר, כך שששת הטיפים הנותרים יתאימו לשש השורות בלוח תרבית רקמות בעל 24 בארות. לאחר העברת התאים מהלוח בעל 96 הבארות ללוח בעל 24 הבארות, שטפו את הבארות בלוח בעל 96 הבארות באמצעות מצע מהבארות המתאימות בלוח בעל 24 הבארות. לאחר מכן, העבירו את נוזל השטיפה בחזרה לבארות בלוח בעל 24 הבארות.העבירו את התאים שעברו אלקטרופורציה מלוח האלקטרופורציה בעל 96 בארות ללוחות תרבית רקמה בעלי 24 בארות, לפי התבנית שהוגדרה מראש ומוצגת כאן. לדוגמה, תאים מהבארות בעלות המספרים האי-זוגיים בשורה A של לוח ה-96 מועברים לשורה A של לוח A, בעוד שתאים מהבארות בעלות המספרים הזוגיים בשורה A של לוח ה-96 מועברים לשורה A של לוח C. לאחר כל העברה של תאים מלוח ה-96 ללוח ה-24, שטפו את הבארות בלוח ה-96 באמצעות מצע מהשורה המתאימה בלוח ה-24. לאחר מכן, העבירו את נוזל השטיפה בחזרה ללוח ה-24.העברת התאים לפלטות בעלות 24 בארות עלולה להיות מבלבלת, אך עליך להיות מסוגל לעקוב אחר שורות התאים שהתקבלו ולהקשרן למזהה הגן (gene ID) הנכון. קריטי לבצע שלב זה במהירות כדי לשמור על בריאות התאים. לאחר שכל התאים שעברו אלקטרופורציה הועברו לארבע הפלטות בעלות 24 הבארות, הנח את הפלטות בקופסת פלסטיק נקייה עם מכסה האוטם אותה היטב. הכנס את הקופסה לאינקובטור בטמפרטורה של 28 °C.בין שש לשמונה שעות מאוחר יותר, הוסף לכל באער מילליטר אחד של SDM-79 עם 10% FCS המכיל אנטיביוטיקה סלקטיבית. דגור בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך תשעה עד 10 ימים עד ששורות תאים טרנסגניות יהיו נראות. לאחר טרנספקציית 96 באערים לתיוג של 96 חלבונים שונים בקצה הטרמינוס, התאים מועברים לצלחות תרבית רקמות של 24 באערים לצורך התאוששות וסלקציה.לאחר מכן כל באער מוערך כדי לקבוע אם הוא מכיל תאים בריאים ועמידים לתרופות. באער בריא מכיל בעיקר תאים פעילים מאוד הנראים בהירים במיקרוסקופיית ניגוד מופע (phase-contrast microscopy). בסכימה לדוגמה זו, צבע ירוק מייצג באער עם טרנספקציה מוצלחת, וצבע אפור מייצג באער המכיל תאים מתים בלבד.88 מתוך 96 בארות, או 92%, מכילות טפילים שעברו טרנספקציה בהצלחה לאחר 15 ימי סלקציה. לאחר רכישת מיומנות בשיטה, ייקח בערך שעה מספירת התאים ועד להזרקתם לצלחת לאחר אלקטרופורציה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להוסיף את התרופות הסלקטיביות שישה עד שמונה שעות לאחר הטרנספקציה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן התיוג של קהלים גדולים של חלבונים ב-Trypansoma brucei.

high-throughput-gene-tagging-in-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הטלומרים חיוניים יציבות הכרומוזום ואת מבנה הטלומרים G-הסככה חיוני תחזוקה telomerase בתיווך הטלומרים. אימצנו לאחרונה שתי שיטות לאיתור מבנה הטלומרים G-הסככה...

בחינת מבנה ה-G-הסככה הטלומרים ב Trypanosoma brucei</em

כאן אנו מדווחים שיטה לשימוש בסוג I וסוג...

מניפולציה גנטית ב<em&gt; Δku80</em&gt; זנים לאנליזה גנומית תפקודית של<em&gt; Toxoplasma gondii</em

דינמיקת גליקוזים בטריפנוזומים אפריקאים קשה לחקור על ידי טכניקות ביולוגיה מסורתיות של התא כגון מיקרוסקופ אלקטרונים ופלואורסצנטי.  כאמצעי להתבוננות בהתנהגות דינמית של אברונים, נעשה שימוש במערכת דיווח פלואורסצנטית-אברונים בשילוב עם זרימה ציטומטרית כדי לנטר דינמיקת גליקוזים בזמן אמת בטפילים חיים.

שימוש בחלבוני ניאון כדי לפקח Dynamics Glycosome בTrypanosome האפריקאי

בדיקה רגישה ביותר מבוססת ריבוזים, הניתנת ליישום לסינון תפוקה גבוהה של כימיקלים המכוונים לתהליך הייחודי של עריכת RNA בפתוגנים טריפנוזומטים, מתוארת במאמר זה. מעכבים יכולים לשמש ככלים לניתוח מונחה השערות של תהליך עריכת ה-RNA ובסופו של דבר כטיפולים.

RNA Catalyst ככתב להקרנת סמים נגד RNA עריכה בtrypanosomes

כתב יד זה מתאר את השימוש בזן ביולומינסנט של טריפנוזומים אפריקאים כדי לאפשר מעקב אחר זיהום בשלב מאוחר ומדגים כיצד ניתן להשתמש בהדמיה חיה in vivo כדי להמחיש זיהומים בתוך מערכת העצבים המרכזית בזמן אמת.

הדמיה פליטת אור כדי לזהות זיהום בשלב מאוחר של מחלת השינה

טריפנוזומים אפריקאים הגדלים במבחנה עוברים שונות אנטיגנית בשיעור נמוך, כך שאוכלוסיות מורכבות מטפילים המבטאים סוג גליקופרוטאין פני שטח דומיננטי (VSG) ואוכלוסייה קטנה של וריאנטים "מתחלפים".  פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה לאיתור וכימות אוכלוסיות אלה.

איתור של<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; מיתוג גליקופרוטאין Surface Variant ידי מגנטי Activated Cell מיון cytometry זרימה

שיטה זו של הפרדה trypanosome הדם תלויה שלהם תשלום משטח שלילי פחות מאשר בתרבית של תאי דם. דם נגוע להציב, שטופלו על עמודת מחליף אניון. שיטה זו, הכי מתאים אבחון של מחלת השינה, מספקת טפילים מטוהרים לחקירות חיסוניות, ביולוגיים, ביוכימיים, פרמצבטיקה וביולוגיה מולקולרית.

טיהור של Trypanosomes חוץ-תאית, כולל אפריקה, מן הדם על ידי אניון-מחליפי (Diethylaminoethyl-תאית עמודות)

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להחדיר נוקאאוט גן לתוך amastigote החילוץ של טריאנוסומה cruzi, באמצעות מערכת CRISPR/Cas9. פנוטיפ הצמיחה ניתן לעקוב גם על ידי ספירת התאים של התרבות האמסטימית axenic או על ידי התפשטות amastigote תאיים לאחר הפלישה התא מארח.

היכרות גנטית הסתרה ישירות לתוך השלב Amastigote של טריאנוסומה cruzi באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

אנו מתארים בדיקה קולורימטרית בתפוקה גבוהה המודדת את פעילות β-גלקטוזידאז בשלושה שלבי מחזור חיים של טריפנוזומה קרוזי, הגורם הסיבתי של מחלת צ'אגאס. ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לזהות תרכובות טריפנוצידיות בצורה קלה, מהירה וניתנת לשחזור.

במבחנה בדיקת סמים נגד כל שלבי מחזור החיים של טריפנוזומה קרוזי באמצעות טפילים המבטאים β-גלקטוזידאז

מחקר זה מראה פרוטוקול מפורט לביצוע מיקרוסקופ הרחבת אולטרה-מבנה בשלושה שלבי מחזור חיים במבחנה של טריפנוזומה קרוזי, הפתוגן האחראי למחלת צ'אגאס. אנו כוללים את הטכניקה האופטימלית עבור חלבונים ציטו-שלד ותיוג פאן-פרוטאום.

מיקרוסקופ הרחבה אולטרה-סטרוקטורלי בשלושה שלבי מחזור חיים חוץ גופי של טריפנוזומה קרוזי

אנו מתארים שיטה לחקור כיצד pH מגיב לרמזים סביבתיים בגליקוזיומים של צורת זרם הדם של טריפנוזומים אפריקאים. גישה זו כוללת חיישן חלבון תורשתי רגיש ל- pH בשילוב עם ציטומטריית זרימה למדידת דינמיקת pH, הן כבדיקת מסלול זמן והן בפורמט מסך בתפוקה גבוהה.

מדידת שינויי pH גליקוזומליים דינמיים בטריפנוזומה ברוסי חי

למד שיטת תיוג חלבונים בקנה מידה רחב ב-Trypanosoma brucei באמצעות PCR ואלקטרופורציה. פרוטוקול זה מאפשר חקר לוקליזציה ופונקציה של קבוצות גדולות של חלבונים בפרוטוזואה.

תפוקה גבוהה ג'ין תיוג ב

גלה סרטונים נוספים