תפוקה גבוהה ג'ין תיוג ב

המטרה הכללית של שיטה זו היא לתג תבליטים בחלבונים ב-Trypansoma brucei באופן בעל תפוקה גבוהה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הקינטופלסטידים בנוגע למיקום ולתפקוד הפוטנציאלי של קבוצות גדולות של חלבונים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לתג מספר רב של חלבונים במהירות ובקלות במקביל.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי לוקליזציה, ניתן לחקור אינטראקציות של קבוצות גדולות של חלבונים גם באמצעות תגים אחרים. לדוגמה, תג BirA עבור ניסוי מיפוי קרבה מסוג bio-ID. את הפרוצדורה ידגים Ross Madden, עוזר מחקר מהמעבדה שלנו.

לפני תחילת הפרוצדורה, הקפיאו מראש קירור PCR בעל 96 בארות במקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. הכינו את תערובת מאסטר A על ידי ערבוב של הרכיבים הבאים במבחנה של 10 מיליליטר: 100 מיקרוליטר של מים מזוקקים ודה-יוניים, 105 מיקרוליטר של DMSO בדרגת PCR, 105 מיקרוליטר של dNTPs בריכוז 10 מילימולר, ו-105 מיקרוליטר של תבנית pPOT.

שפכו את Master Mix A למכל ריאגנטים והעבירו מנה של 23 µL של Master Mix A לכל באר בלוח PCR בעל 96 בארות. באמצעות פיפט רב-ערוצי P20 בעל 12 ערוצים, הוסיפו 2 µL של תערובת פריימרים בריכוז 100 µM לכל באר מלאה. אטמו את הלוח באמצעות סרט איטום.

הנח אותו על קירור ה-PCR שקולל מראש והשאר אותו להקפאה למשך 20 דקות לפחות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. הקפאת ה-PCR Master Mix A היא קריטית כדי להבטיח תגובת hot start יעילה, גם כאשר משתמשים ב-hot start polymerase ספציפי. דבר זה מוביל להגברה בעלת תפוקה גבוהה וניתנת לשחזור.

בזמן שפלטת ה-PCR נמצאת במקפיא, הכינו את תערובת המאסטר B. ערבבו את הרכיבים הבאים במבחנה של 10 milliliter: 2,048 µL של מים מזוקקים ודה-יוניים, 525 µL של 10X buffer, ו-52.5 µL של polymerase, לנפח כולל של 2,626 µL לכל פלטה. הוציאו את פלטת ה-PCR ואת מקירר ה-PCR מהמקפיא של 80°C-.

כאשר הפלטה עדיין נמצאת על קירור ה-PCR, הוסיפו במהירות 25 µL של Master Mix B על גבי Master Mix A הקפוא בכל באר, לנפח תגובה כולל של 50 µL. שלב זה הוא קריטי מבחינת זמן ויש להשלימו לפני ש-Master Mix A יפשיר. אטמו את הפלטה באמצעות סרט איטום (film).

הגדירו את המעגל התרמי באופן הבא: 94 °C למשך 10 דקות, לאחר מכן 30 מחזורים של 94 °C למשך 15 שניות, 65 °C למשך 30 שניות ו-72 °C למשך שתי דקות, ואז שלב הארכה סופי של 72 °C למשך שבע דקות. לאחר שהבלוק הגיע ל-94 °C, הכניסו את פלטת ה-PCR למעגל התרמי והפעילו את תוכנית ההגברה.

התחילו את ההליך בהכנת ג'ל אגרוזה גדול בריכוז 1% בבופר הרצה Tris-acetate EDTA או TAE, עם ארבע שורות של בארות. טענו סולם DNA של 1 kb לבארה הראשונה והבארה ה-28 בכל שורה. השלב הבא הוא העברה של שני מיקרוליטרים של תוצר PCR באופן ישיר, ללא בופר טעינה של DNA, לכל נתיב בג'ל, בהתאם לדפוס המוצג כאן.

לדוגמה, את תוצרי ה-PCR משורות A ו-B של פלטת ה-PCR טוענים לתעלות בעלות המספרים האי-זוגיים והזוגיים של השורה הראשונה בג'ל, בהתאמה. כדי לצמצם את האפשרות לזיהום האמפליקונים, עבדו במהירות וטענו את תוצרי ה-PCR משורה A של פלטת ה-PCR לתעלות בעלות המספרים האי-זוגיים של השורה הראשונה בג'ל. לאחר מכן, טענו את תוצרי ה-PCR משורה B של פלטת ה-PCR לתעלות בעלות המספרים הזוגיים של השורה הראשונה בג'ל.

טענו את תוצרי ה-PCR משורות C ו-D של פלטת ה-PCR לפי אותה תבנית, כאשר שורה C תיטען למסלולים בעלי המספרים האי-זוגיים ושורה D למסלולים בעלי המספרים הזוגיים בשורה השנייה של הג'ל. המשיכו בתבנית טעינה זו עד שכל באר בפלטת ה-PCR תיטען לג'ל. הניחו את הג'ל בתוך מיכל ההרצה ומלאו את המיכל בבופר הרצה TAE עד שהג'ל יהיה שקוע.

הרץ במתח של 100 volts למשך 30 דקות. בצע ויזואליזציה באמצעות UV transilluminator. מוצג כאן ג'ל אגרוזה מייצג לאישור PCR של 96 בארות, שבו 95 מתוך 96 תגובות ה-PCR הצליחו.

ה-PCR שלא הצליח היה H11. הליך זה משתמש ב-Trypansoma brucei, צורה פרוציקלית, שורת תאים SMOXP9. גדלו את התאים לצפיפות המתאימה כפי שמתואר בטקסט הפרוטוקול ואספו את מספר התאים הנדרש על ידי סבוב בצנטריפוגה ב-800 times G למשך 10 דקות.

התחילו בהכנות לאלקטרופורציה בזמן שהתאים נמצאים בצנטריפוגה. חברו את ידית הפלטות (plate handler) למכשיר האלקטרופורטור. ביחידת האלקטרופורטור, הגדירו את המתח ל-1,500 volts, את אורך הפולס ל-100 microseconds, את מספר הפולסים ל-12, ואת מרווח הפולסים ל-500 milliseconds.

במטפל הפלטות (plate handler), הגדירו את מספר הפולסים לאחד. באמצעות פיפט רב-ערוצי 12-ערוצים P200, העבירו את תגובות ה-PCR מפלטת ה-PCR לפלטת אלקטרופורציה חד-פעמית בעלת 96 בארות. שטפו את התאים ב-10 milliliters של cytomix משופר וסבבו שוב בצנטריפוגה ב-800 times G למשך 10 דקות.

שחזר את התאים ב-23 milliliters של cytomix משופר לריכוז סופי של 5×10⁷ תאים ל-milliliter. העבר את תליית התאים למאגר ריאגנטים. טפטף 200 microliters של תמיסת התאים לכל באער של פלטת האלקטרופורציה וערבב עם תוצר ה-PCR באמצעות פיפטור.

השתמשו בנייר סופג כדי להסיר טיפות נוזל מחלקו העליון של הפלטה כדי למנוע קצרים חשמליים. הצמידו סרט איטום לחלקו העליון של פלטת האלקטרופורציה, תוך מיקום הסרט כך שחורי האלקטרודות בחלקם העליון והתחתון של כל עמודה יישארו פתוחים. הימנעו מכיסוי הנקודות הבולטות המשמשות להנחיית הסרט.

הכנס את פלטת האלקטרופורציה למטפל בפלטות (plate handler) וסגור את המכסה. לחץ על pulse"on ביחידת האלקטרופורטור. לאחר האלקטרופורציה, יש להעביר את התאים במהירות לארבע פלטות תרבית רקמה בעלות 24 בארות, המכילות 1 ml של מצע SDM-79 בכל בארה לצורך התאוששות.

השתמשו בפיפט רב-ערוצי בעל 12 ערוצים (P200) כאשר כל טיפ שני חסר, כך שששת הטיפים הנותרים יתאימו לשש השורות בלוח תרבית רקמות בעל 24 בארות. לאחר העברת התאים מהלוח בעל 96 הבארות ללוח בעל 24 הבארות, שטפו את הבארות בלוח בעל 96 הבארות באמצעות מצע מהבארות המתאימות בלוח בעל 24 הבארות. לאחר מכן, העבירו את נוזל השטיפה בחזרה לבארות בלוח בעל 24 הבארות.

העבירו את התאים שעברו אלקטרופורציה מלוח האלקטרופורציה בעל 96 בארות ללוחות תרבית רקמה בעלי 24 בארות, לפי התבנית שהוגדרה מראש ומוצגת כאן. לדוגמה, תאים מהבארות בעלות המספרים האי-זוגיים בשורה A של לוח ה-96 מועברים לשורה A של לוח A, בעוד שתאים מהבארות בעלות המספרים הזוגיים בשורה A של לוח ה-96 מועברים לשורה A של לוח C. לאחר כל העברה של תאים מלוח ה-96 ללוח ה-24, שטפו את הבארות בלוח ה-96 באמצעות מצע מהשורה המתאימה בלוח ה-24. לאחר מכן, העבירו את נוזל השטיפה בחזרה ללוח ה-24.

העברת התאים לפלטות בעלות 24 בארות עלולה להיות מבלבלת, אך עליך להיות מסוגל לעקוב אחר שורות התאים שהתקבלו ולהקשרן למזהה הגן (gene ID) הנכון. קריטי לבצע שלב זה במהירות כדי לשמור על בריאות התאים. לאחר שכל התאים שעברו אלקטרופורציה הועברו לארבע הפלטות בעלות 24 הבארות, הנח את הפלטות בקופסת פלסטיק נקייה עם מכסה האוטם אותה היטב. הכנס את הקופסה לאינקובטור בטמפרטורה של 28 °C.

בין שש לשמונה שעות מאוחר יותר, הוסף לכל באער מילליטר אחד של SDM-79 עם 10% FCS המכיל אנטיביוטיקה סלקטיבית. דגור בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך תשעה עד 10 ימים עד ששורות תאים טרנסגניות יהיו נראות. לאחר טרנספקציית 96 באערים לתיוג של 96 חלבונים שונים בקצה הטרמינוס, התאים מועברים לצלחות תרבית רקמות של 24 באערים לצורך התאוששות וסלקציה.

לאחר מכן כל באער מוערך כדי לקבוע אם הוא מכיל תאים בריאים ועמידים לתרופות. באער בריא מכיל בעיקר תאים פעילים מאוד הנראים בהירים במיקרוסקופיית ניגוד מופע (phase-contrast microscopy). בסכימה לדוגמה זו, צבע ירוק מייצג באער עם טרנספקציה מוצלחת, וצבע אפור מייצג באער המכיל תאים מתים בלבד.

88 מתוך 96 בארות, או 92%, מכילות טפילים שעברו טרנספקציה בהצלחה לאחר 15 ימי סלקציה. לאחר רכישת מיומנות בשיטה, ייקח בערך שעה מספירת התאים ועד להזרקתם לצלחת לאחר אלקטרופורציה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להוסיף את התרופות הסלקטיביות שישה עד שמונה שעות לאחר הטרנספקציה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן התיוג של קהלים גדולים של חלבונים ב-Trypansoma brucei.