Name: עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: חקור שיטת תרבות משותפת של מיקרוביום מעיי ותאי מעי אנושיים במערכת gut-on-a-chip מיקרופלואידית. שיטה זו מאפשרת מחקר מנגנוני מחלות ופיתוח תרופות חדשות בגסטרואנטרולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לסרי קוסורי (מכון וייס באוניברסיטת הרווארד) על אספקת זן האי-קולי המסומן GFP. עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות לפרויקטי מחקר מתקדמים של ההגנה תחת הסכם שיתוף פעולה מספר W911NF-12-2-0036, מינהל המזון והתרופות תחת חוזה #HHSF223201310079C, ומכון וייס להנדסה בהשראה ביולוגית באוניברסיטת הרווארד. ההשקפות והמסקנות הכלולות במסמך זה הן של המחברים ואין לפרש אותן כמייצגות את המדיניות הרשמית, מפורשת או משתמעת, של משרד המחקר הצבאי, מעבדת המחקר של הצבא, מינהל המזון והתרופות או ממשלת ארה"ב. ממשלת ארה"ב רשאית לשכפל ולהפיץ הדפסות חוזרות למטרות ממשלתיות למרות כל סימון זכויות יוצרים במסמך זה.

<ol><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444, 1027-1031 (2006).</li>
<li>Tremaroli, V., Backhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+between+the+gut+microbiota+and+host+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism.</a> Nature. 489, 242-249 (2012).</li>
<li>Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+Microbiota+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gut Microbiota in Health and Disease.</a> Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).</li>
<li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+microbiome+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The human microbiome project.</a> Nature. 449, 804-810 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).</li>
<li>Round, J. L., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+shapes+intestinal+immune+responses+during+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).</li>
<li>Garrett, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communicable+ulcerative+colitis+induced+by+T-bet+deficiency+in+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system.</a> Cell. 131, 33-45 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-on-a-Chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).</li>
<li>Huh, D., Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+human+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).</li>
<li>Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+microbiome+and+mechanical+deformation+to+intestinal+bacterial+overgrowth+and+inflammation+in+a+human+gut-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).</li>
<li>Miller, W. G., Lindow, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+GFP+cloning+cassette+designed+for+prokaryotic+transcriptional+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions.</a> Gene. 191, 149-153 (1997).</li>
<li>Odijk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+direct+current+trans-epithelial+electrical+resistance+in+organ-on-a-chip+microsystems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems.</a> Lab Chip. 15, 745-752 (2015).</li>
<li>Lentle, R. G., Janssen, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+characteristics+of+digesta+and+their+influence+on+flow+and+mixing+in+the+mammalian+intestine%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+B%22%5BJournal%5D)">Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review.</a> J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).</li>
<li>Granato, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface-associated+lipoteichoic+acid+acts+as+an+adhesion+factor+for+attachment+of+Lactobacillus+johnsonii+La1+to+human+enterocyte-like+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells.</a> Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).</li>
<li>Dewhirst, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+oral+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The human oral microbiome.</a> J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).</li>
<li>Grice, E. A., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The skin microbiome.</a> Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).</li>
<li>Hay, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+bacterial+colonisation+of+the+genital+tract+and+subsequent+preterm+delivery+and+late+miscarriage%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J%22%5BJournal%5D)">Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage.</a> Br Med J. 308, 295-298 (1994).</li>
</ol>

דונלד א. אינגבר הוא מייסד Emulate Inc., מחזיק במניות בחברה ויו"ר המועצה המדעית המייעצת שלה. למחברים האחרים אין גילויים כספיים.

הבנת יחסי גומלין בין מאכסן Microbiome היא קריטית לקידום רפואה; עם זאת, מודלי תרבית תאים מסורתיים מתבצעים צלחת פלסטיק או צלחת היטב סטטי אינם תומכים שיתוף התרבות היציבה של תאי מעי אדם עם חי חיידקים במעי במשך יותר מ 1-2 ימים, כי תא חיידקים בעיקר לגדול יותר התאים היונקים במבחנה. אוכלוסיית חיידקים overgrowing צורכת במהירות חמצן וחומרים מזינים, ובהמשך לייצר כמות מוגזמת של פסולת מטבולית (למשל, חומצות אורגניות), אשר ברצינות להתפשר פונקציות מחסום המעי ולגרום מוות של תאים ...

מעי האדם מטפח מערך מגוון מדהים של מינים של חיידקים (&lt;1,000 מינים) ומספר עצום של תאי מיקרוביאליים (10 פעמים יותר מאשר תאי מארחי האדם) וגנים (100 פעמים יותר מאשר הגנום האנושי) 1. Microbiomes אדם אלה ממלא תפקיד מרכזי בחילוף חומרים מזינים xenobiotics, ויסות מערכת חיסונית, ושמירת הומאוסטזיס 2 מעיים. באופן לא מפתיע, בהתחשב פונקציות מגוונות אלה, Microbiome הבטן commensal בהרחבה מודולציה בבריאות ובחולי 3. לכן, להבנת תפקידו של Microbiome במעי אינטראקציות בין מאכסן חיידק הם בעלי חשיבות רבה לקדם עיכול (GI) בריאות ולחקור רפויים חדש לטיפול בבעיות מעיים 4. עם זאת, קיימים מודלים המעי במבחנה (למשל, תרבויות סטטי) להגביל מאכסן Microbiome שיתוף תרבות לתקופה קצרה של זמן (&lt;1 יום) כי תאי חיידקים לגדול יותר ופשרה מחסום המעייםפונקציה 5. במודלים של בעלי חיים סרוגייט (למשל, נבט חינם 6 או מהונדסים גנטית עכברים 7) הם גם לא נפוץ ללמוד crosstalk Microbiome מארח-בטן משום קולוניזציה ותחזוקה יציבה של Microbiome מעי אנושי קשה. כדי להתגבר על אתגרים אלה, פיתחנו האדם biomimetic לאחרונה &quot;גוט-על-שבב&quot; מערכת microphysiological (איור 1 א, משמאל) לחקות את האינטראקציות Microbiome מארח-gut המתרחשות במעי האדם החיים 5,8. במעיים-על-שבב microdevice מכיל שני ערוצים microfluidic במקביל מופרד על ידי מטריקס גמיש, נקבובי, תאי (ECM) קרום מצופה צופה על ידי תאים אנושי מעי אפיתל קאקו-2, חיקוי ממשק רקמות לומן-נימי המעיים (איור 1A 9, מימין). אבק מונחה דפורמציות קצבית מחזורית לגרום דפורמציות מכאניות פיסיולוגיות המחקות שינויים בדרך כלל inducאד על ידי תנועה פריסטלטית (איור 1 א, ימין). מעניין, כאשר תאי קאקו-2 גדלים בתוך מעי-על-שבב עבור יותר מ -100 שעות, הם יוצרים באופן ספונטני תלת ממדי (3D) villi מעי עם צומת הדוקים, גבולות מברשת פסגה, תאי שגשוג מוגבלים מאורות הבזליים, ייצור ליחה, פעילות חילוף חומרים סמים מוגברת (למשל, ציטוכרום P450 3A4, CYP3A4), וגלוקוז משופרת reuptake 8. ב microenvironment &#39;נבט חינם&#39; זה, אפשר היה לשתף תרבות הגנרלגוברנמן רמנוסוס לקטובצילוס פרוביוטי או במערך הטיפולי של תערובת חיידקים פרוביוטיים עם תאי אפיתל המארח עד שבועיים 5,10. במחקר זה, אנו מתארים את הפרוטוקול המפורט לביצוע Microbiome מארח-gut שיתוף תרבות במעיים-על-שבב במכשיר במשך תקופה ארוכה. בנוסף, אנו דנים בנושאים קריטיים ואתגרים פוטנציאל להיחשב עבור יישום רחב של p תרבות שיתוף מאכסן Microbiome זהrotocol.

<table><tbody><tr><td>מדיום הנשר השונה (DMEM) של Dulbecco המכיל 25 מ"מ גלוקוז ו-25 מ"מ HEPES</td><td>Gibco</td><td>10564-011</td><td>לחמם אותו ב-37 מעלות; C באמבט מים.</td></tr><tr><td>מרק Difco Lactobacilli MRS</td><td>BD</td><td>288120</td><td>הפעל חיטוי ב-121 מעלות; C למשך 15 דקות.</td></tr><tr><td>פולי (דימתילסילוקסן)</td> <td>דאו קורנינג</td><td>3097358-1004</td><td>15: 1 (w/w), PDMS: חומר ריפוי</td></tr><tr><td>Caco-2BBE קו קרצינומה של המעי הגס האנושי מרכז</td><td>מחלות עיכול</td><td></td> הרווארד <td>אדנוקרצינומה של המעי הגס האנושית&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>מומת בחום 20% (v/v) ב-DMEM</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>1/100 דילול ב-DMEM</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>D1306</td><td>צביעת גרעינים</td></tr><tr><td>מצומד פלואידין-CF647 (25 יחידות/מ"ל)</td><td>Biotium</td><td>00041</td><td>צביעת</td></tr> <tr>F-actin<td>מערכת מתח Flexcell FX-5000</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>FX5K</td><td>תנועת מתיחה דמוית פריסטלטיקה (10% מתח תאים, תדר 0.15 הרץ)</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>הדמיה, DIC</td></tr><tr><td>סריקת מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica</td><td>DMI6000</td><td>הדמיה, פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>UVO מנקה</td><td>Jelight Company Inc</td><td>342</td><td>הפעלה על פני השטח של שבב המעי</td></tr><tr><td>קולגן מסוג I&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td>רכיב מטריצה חוץ-תאית לתרבית תאים לתוך השבב</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>354234</td><td>רכיב מטריצה חוץ-תאית לתרבית תאים לתוך השבב</td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק חד פעמי</td><td>BD</td><td>309628</td><td>הזרקת תאים ומדיה 25</td></tr><tr><td>גרם 5/8 מחט</td><td>BD</td><td></td><td>329651 הזרקת תאים ומדיה</td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>Braintree Scientific בע"מ</td><td>BS-8000</td><td>ציוד הזרקה לשבב</td></tr><tr><td>VSL#3</td><td>Sigma-Tau Pharmaceuticals</td><td>7-45749-01782-6</td><td>ניסוח של 8 חיידקי מעיים קומנסליים שונים מדיום</td></tr><tr><td>קלוסטרידיאלי מחוזק</td><td>BD</td><td>218081</td><td>מדיום תרבית חיידקים אנאירוביים</td></tr><tr><td>GasPak EZ מערכת מיכל אנאירובית עם מחוון</td><td>BD</td><td>260001</td><td>שקית לייצור גז אנאירובי&nbsp;</td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית מדע</td><td>157-4-100</td><td>קיבוע התאים לצביעה</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>חדירות התאים</td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>חומר חוסם לצביעה של התאים</td></tr><tr><td>מטפל בקורונה</td><td>מוצרי אלקטרו-טכניק</td><td>BD-20AC</td><td>מחולל פלזמה לייצור השבב</td></tr><tr><td>סטריפליפ&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>הסרת מדיום התרבות השלם</td></tr><tr><td>המוציטומטר חד פעמי</td><td>iNCYTO</td><td>DHC-N01</td><td>לספירת תאים ידנית</td></tr></tbody></table>

עמית תרבות microbiome חי עם microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבצע לטווח ארוך שיתוף התרבות של Microbiome במעיים רב המין האנושי עם villi המעי microengineered בתוך האדם בטן-על-שבב מכשיר microphysiological. אנחנו לשחזר את ממשק רקמות לומן-נימי המעי במכשיר microfluidic, שבו דפורמציות מכני פיזיולוגיים זרימת גזירה נוזל מוחלים כל הזמן לחקות תנועה פריסטלטית. ב microchannel לומן, האפיתל במעי האדם תאים קאקו-2 הם מתורבתים לגבש האפיתל סיסי &#39;נבט חינם&#39; ו להתחדש villi המעי הדק. תאי חיידקים טרום בתרבית הם מחוסנים לתוך צד לומן להקים מערכת אקולוגי מארח חיידק. אחרי תאי חיידקים לדבוק למשטח הפסגה של villi, זרימת נוזל דפורמציות מכאניים יתחדשו לייצר microenvironment יציב שבו מדיום תרבות הטריה מסופק כל זמן וחיידקים מאוגדים (כמו גם פסולי חיידקים) יוסרו באופן רציף. לאחר שיתוף התרבות המורחבת from ימים עד שבועות, microcolonies המרובה הם מצאו להיות ממוקמים באופן אקראי בין villi, ושניהם חיידקים ותאים אפיתל להישאר קיימא ופונקציונליים עבור שבוע אחד לפחות בתרבות. פרוטוקול שיתוף תרבות שלנו ניתן להתאים לספק פלטפורמה תכליתי עבור מערכות אקולוגיות מאכסן Microbiome אחרים שניתן למצוא באיברים אנושיים שונים, אשר עשוי להקל במחקר במבחנה של תפקיד Microbiome האדם מנצח בבריאות ובחולי.

כדי לחקות את המערכת האקולוגית מאכסן Microbiome אדם מעיים במבחנה, זה צורך לפתח פרוטוקול ניסוי להקים מחדש את שיתוף התרבות ארוך טווח היציבה של חיידקי מעיים ותאים אפיתל אדם מעיים בתנאים פיסיולוגיים כגון מכניקת זרימת נוזל דמוי הפריסטלטיקה. כאן, אנו מנצלים biomimetic בטן-על-שבב microdevice (איור 1A) לשתף התרבות תאים חיים חיידקים במגע ישיר עם החיים villi אדם לתקופות של שבוע או יותר במבחנה. תאי אפיתל...

אנו מתארים פרוטוקול במבחנה Microbiome במעיים שיתוף תרבות villi מעיים במשך תקופה ארוכה באמצעות אדם בטן-על-שבב מערכת microphysiological.

עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים את צמיחת הסיסים (villi) של תאי מעי אנושיים תחת תנועות דמויות פריסטלזה וזרימה במכשיר מיקרופלואידי מסוג gut-on-a-chip, וכן להראות כיצד לבצע תרבית משותפת (co-culture) של תאים אלו עם מיקרוביום מעי חי. לפיכך, שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הגסטרואנטרולוגיה, המיקרוביולוגיה הקלינית ומדעי הרוקחות לצורך זיהוי מנגנוני מחלה ותיקוף היעילות והרעילות של תרכובות תרופתיות חדשות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שחוקרים יכולים לבסס מערכת אקולוגית חיונית ופונקציונלית של מיקרוביום מעי אנושי חי in vitro באמצעות מערכת מיקרו-פיזיולוגית.ההשלכות של טכניקה זו עשויות להתרחב למחלות כגון קוליטיס כיבית או מחלת קרוהן, שכן תרבית משותפת (co-culture) יציבה של תאי המארח עם המיקרוביום יכולה לדמות את המורכבות של מחלות אלו. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי האינטראקציות המורכבות בין מיקרוביום המעי לבין מערכת החיסון במעי, ניתן להחיל אותה גם על מערכות איברים אחרות שבהן קיימות אינטראקציות בין מארח למיקרובים, כגון העור, דרכי המין או חלל הפה. לתחילת העבודה, הכינו את התקן המיקרופלואידי של "מעי-על-שבב" (gut-on-a-chip) כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף.המכשיר מורכב מפולימר סיליקון שקוף חדיר לגז המכיל שני מיקרו-תעלות מקבילות, המופרדות על ידי ממברנת PDMS נקבובית וגמישה. בכל צד של התעלות נמצאים תאי ואקום, שניתן להשתמש בהם להפעלת מאמץ מכני מחזורי. סטריליזו את המכשיר באמצעות מזרק של 1 mL להזרמת 70% ethanol דרך התעלות.לאחר מכן, ייבשו את המכשיר בתנור ייבוש בטמפרטורה של 60 °C למשך הלילה. למחרת, חשפו את מיקרו-מערכת המעי-על-שבב (gut-on-a-chip), יחד עם הצינורות המחוברים אליה, לקרינת UV ולאוזון בו-זמנית למשך 40 דקות. צננו את המכשיר תחת קרינת ה-UV של קבס ביולוגי (biosafety cabinet) למשך 15 דקות.בשלב הבא, טענו 100 µL של תמיסת קידוד למטריקס חוץ-תאי למזרק של 1 mL, והזרימו אותה לתוך המיקרו-תעלה העליונה של ההתקן. חזרו על תהליך זה כדי לצפות גם את המיקרו-תעלה התחתונה. הניחו את כל המערכת באינקובטור לח עם 5%CO2 בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת.במהלך הדגירה, יש לבצע ניתון גזים (de-gas) למצע גידול מלא שחומם מראש על ידי העברתו דרך מסנן של 0.45 מיקרון במערכת סינון של 50 מיליליטר למשך דקה אחת. הקש בעדינות על המצע המסונן למשך דקה אחת כדי להסיר בועות או גזים מומסים במצע. לאחר מכן, העבר את המצע המלא לאחר ניתון הגזים לשתי מזרקים חד-פעמיים של שלושה מיליליטר, והדגר את המזרקים למשך שעה אחת.בשלב הבא, חברו את המזרקים למיקרו-תעלות העליונה והתחתונה של השבב המדמה מעי (gut-on-a-chip), ושטפו את תמיסת הקידוד על ידי זרימה של מצע גידול מלא לתוך המיקרו-תעלות העליונה והתחתונה בפולסים עדינים. לאחר מכן, השתמשו במשאבת מזרקים כדי להזרים את מצע תרבית התאים המלא והניקוז-גזים לתוך המיקרו-תעלה העליונה של ההתקן, תוך דגירה של השבב למשך לילה ב-37 degrees Celsius ו-5%CO2. קצרו בקבוק T75 מלא (confluent) המכיל תאי אפיתל של מעי מסוג Caco-2, ראשית על ידי שטיפת התאים ב-10 milliliters של PBS נטול סידן ומגנזיום.לאחר מכן, שאבו את ה-PBS וחזרו על השטיפה פעמיים נוספות. בשלב הבא, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת Trypsin-EDTA בריכוז 0.05% והדגירו את הבקבוק למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר שהתאים ניתקו, הוסיפו 10 milliliters של מצע גידול תאים מלא שחומם מראש, ובצעו פיפטינג לתמיס התאים מעלה ומטה שלוש עד חמש פעמים לפני העברתו לשפופרת צנטריפוגה.סבבו את תגלי התאים בצנטריפוגה. לאחר מכן, הסירו את הנוזל העליון (supernatant), והשעיו שוב את התאים בריכוז של 150,000 תאים לסנטימטר רבוע במצע גידול מלא שחומם מראש. שאבו 500 µL מתגלי התאים למזרק חד-פעמי של 1 mL, המצויד במחט 25-gauge באורך 5/8-inch.לאחר מכן, העבירו 100 µl של תגסוס התאים למיקרו-ערוץ העליון דרך צינור היציאה. בשלב הבא, סגרו את כל הכניסות והיציאות המחוברות למיקרו-ערוצים העליון והתחתון באמצעות תפסים (binder clips). דגרו את כל המערכת למשך שעה אחת כדי לאפשר לתאי אפיתל המעי להיצמד לפני השטח של הממברנה נקבובית.לאחר מכן, הסר את התפסנים וחבר את צינור הערוץ העליון למזרק מלא בתווך תרבית שהוצב על משאבת מזרקים. החזר את זרימת תוך התרבית לערוץ המיקרו העליון בקצב של 30 microliters לשעה עד שהתאים יצרו שכבה אחת (monolayer) שלמה. ברגע שהתאים יצרו שכבה אחת, חבר את הערוץ התחתון למזרק השני והזרם את תוך התרבית הן ללומן העליון והן לערוצי המיקרו של הנימים התחתונים באותו קצב זרימה של 30 microliters לשעה.כדי ליצור תנועה דמוית פריסטלטיקה בשבב, הפעל תחילה את משאבת הוואקום. חבר את תאי הוואקום של המכשיר לבקר הוואקום באמצעות צינוריות עם מחבר פלדת אל-חלד. לאחר מכן, הגדר את הבקר כך שיספק תנועת מתיחה סינוסואידית מחזורית בגובה 10% ממאמץ התא הממוצע בתדר של 0.15 Hertz, ואז לחץ על start.המשיכו להזרים מצע תרבית לשני המיקרו-תעלות, העליונה והתחתונה, בנוכחות דפורמציות מכניות למשך 80 שעות לפחות כדי להשרות צמיחת סיסים (villus growth). הכינו תערובת של 50/50 של Autoclaved Lactobacilli MRS Broth ו-Reinforced Clostridial Medium. לאחר מכן, השביו תערובת חיידקים פרוביוטיים מיובשים בהקפאה ב-10 milliliters של התערובת.מדדו את הצפיפות האופטית של התערובת ב-600 ננומטר וכווננו את צפיפות התאים הסופית לכ-0.2 יחידות של צפיפות אופטית. העבירו מנות של שלושה מיליליטר מהסספנסיות של התאים המיקרוביאליים המכווננת למבחנות סטריליות חד-פעמיות של 10 מיליליטר. הניחו את המנות בתוך מכל אנאירובי והוסיפו למכל שתי חבילות של שקיות ליצירת גז אנאירובי.סגרו את מכסה המכל בצורה הדוקה והדגירו את מערך המכל ללא ניעור באינקובטור למשך הלילה. לאחר מכן, הכינו מצע גידול תאים נטול אנטיביוטיקה שעבר ניקוז גזים (de-gassed) והעמיסו אותו למזרקים חד-פעמיים בנפח של 3 mL. העבירו את התקן ה-gut-on-a-chip המכיל סימסי (villi) בהנדסה מיקרוסקופית אל תוך קבלינת הבטיחות הביולוגית.הסר את המזרקים המחוברים למיקרו-תעלות העליונה והתחתונה של ההתקן והחלף אותם במזרקים המכילים מצע גידול לתאים נטול אנטיביוטיקה שעבר ניקוז גזים. בסיום, החזר את ההתקן לאינקובטור CO2. לאחר מכן, הזרם את מצע הגידול נטול האנטיביוטיקה אל תוך ההתקן למשך 12 שעות לפני השבצת המיקרוביום.בשלב הבא, סבבו במצנטריפוגה את תערובת תאי החיידקים הפרוביוטיים שעברו תרבית מקדימה. שאבו את הנוזל העליון (supernatant), ולאחר מכן השביו את החיידקים ב-DMEM נטול אנטיביוטיקה. טענו כ-100 µL מת сусפנזיית תאים זו למזרק של 1 mL המחובר למחט בנפח 5/8-inch ובגודל 25-gauge.החדירו את החיידקים לצד הלומן של המיקרו-תעלה המכילה את סיסי המעי שהיו נקיים מחיידקים עד כה. אפשרו לתאי המיקרוביום להיצמד למשטח האפיקלי של סיסי המעי במשך שעה וחצי ללא זרימה, על ידי סגירת הצינורות. לאחר מכן, בצעו פרפוזיה של מצע גידול ללא אנטיביוטיקה שחומם מראש לשתי המיקרו-תעלות, העליונה והתחתונה, בקצב של 40 µL לשעה עם דפורמציות מחזוריות קצביות.פרוטוקול תרבית-משותפת זה מאפשר קולוניזציה יציבה של מינים מרובים של חיידקים פרוביוטיים במרווח הבין-סיסי (intervillous space). ניתן לשמר מיקרו-מושבות חיידקים חיוניות למשך עד שבועיים בתרבית-משותפת. מוצגת כאן תרבית-משותפת שונה המורכבת הן מ-E.coli מסומני GFP והן מסיסי מעי.ההגדלה בעוצמה גבוהה מראה בבירור את מיקומם של מיקרו-מושבות חיידקים בנקודת הזמן של 72 שעות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להזריק את מצע התרבית בעדינות ובאיטיות אל תוך התעלות המיקרופלואידיות כדי למנוע פגיעה בשכבת התאים האפיתליאליים בשלביה המוקדמים של התרבית. בהתבסס על שיטה זו, שיטת תרבית משותפת (co-culture) עם תאי מערכת החיסון האנושית יכולה לספק רמזים לגבי האופן שבו המיקרוביומה מקיימת תקשורת עם מערכת החיסון ומשפיעה על ההומאוסטזיס לבריאות מעיים אופטימלית.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה כיצד לשחזר את המיקרו-סביבה של מעי האדם וכיצד להדגים תרבית משותפת (co-culture) בין המיקרוביום לבין סיסי המעי של האדם in vitro. עבודה עם חיידקים פתוגניים ותאי אדם היא מסוכנת ביותר, לכן אל תשכחו לעבוד בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית.

co-culture-living-microbiome-with-microengineered-human-intestinal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בסרטון זה, אנו מתארים את המתודולוגיה להקמת מערכת תרבית איברי מעיים ex vivo כדי לחקור את יחסי הגומלין בין מקטעי רקמת מעיים של עכבר לבין חיידקי מעיים ספציפיים. המכשיר מורכב משני זוגות של יציאות קלט-פלט, הראשון מחבר את לומן רקמת המעי ומספק את המתלה החיידקי הספציפי לתוכו, והשני מספק ברציפות מדיה לבארות המכשיר כדי לשמור על כדאיות רקמת ex vivo.

מערכת תרבית איברי מעיים Ex Vivo לחקר אינטראקציות מיקרוביוטה מארחת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבית תאים ראשוניים, מודלים של רקמות וביופסיות ניקוב בשבב מיקרופלואידי מרובה איברים למשך עד 28 ימים. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עוריים אנושיים, אגרגטים בכבד וביופסיות עור שולבו בהצלחה במחזור מדיה משותף.

צ&#39;יפ Multi-האיבר - פלטפורמת Microfluidic לCoculture Multi-רקמה לטווח ארוך

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור culturing microbiota את הבטן של המעי הגס במבחנה, באמצעות סדרה של ריאקטורים שמדמות את התנאים הפיזיולוגיים של דרכי עיכול.

מתקדמים במבחנה Culturing טכנולוגיה ללמוד את Microbiota בטן האדם

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מודל עור תלת מימדי פשוט ובלתי מופרע באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות. גישת זרימה מקבילה מאפשרת תצהיר במקום של תא עורי לזרוע של תאי אפיתל על גבי, כל נשלט על ידי משאבות מזרק.

יצירת דגם תלת מימדי תלת מימדי של עור על שבב בפלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות

מאמר זה מציג שיטה ייחודית לניתוח אינטראקציות בין מארח למיקרוביום באמצעות מערכת תרבית איברי מעיים חדשנית לניסויים ex vivo.

מערכת תרבית איברי מעיים לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה

אורגנואידים במעיים שמקורם בביופסיה וטכנולוגיות של איברים על שבבים משולבים בפלטפורמה מיקרופיזיולוגית כדי לשחזר את פונקציונליות המעי הספציפית לאזור.

שילוב של אורגנואידים אנושיים וטכנולוגיית איברים על שבב כדי ליצור מודל של פונקציונליות ספציפית לאזורי מעיים

neuroHuMiX הוא מודל מעיים על שבב מתקדם לחקר האינטראקציות של תאים חיידקיים, אפיתליאליים ועצביים בתנאי תרבית משותפת פרוקסימלית ומייצגת. מודל זה מאפשר לפענח את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התקשורת בין מיקרוביום המעי למערכת העצבים.

מודל מעיים-על-שבב לחקר ציר המיקרוביום-מערכת העצבים של המעי

פרוטוקול זה מתאר מודל במבחנה של אנטרוקוליטיס נמקית (NEC), אשר יכול לשמש למחקרים מכניסטיים על פתוגנזה של מחלות. הוא מכיל שבב מיקרופלואידי שנזרע עם אנטרואידים במעי שמקורם במעי היילוד האנושי, תאי אנדותל ומיקרוביום המעי של יילוד עם NEC חמור.

מודל מיקרופלואידי של אנטרוקוליטיס נמקית המשלב אנטרואידים ממעיים של ילודים אנושיים ומיקרוביום דיסביוטי

שילוב של אורגנואידים במעי הכלבי ומערכת מיקרופלואידית של מעיים על שבב מציע מודלים תרגומיים רלוונטיים למחלות מעיים אנושיות. הפרוטוקולים שהוצגו מאפשרים מורפוגנזה תלת-ממדית ומידול דינמי במבחנה של המעי, ומסייעים בפיתוח טיפולים יעילים למחלות מעיים בכלבים ובבני אדם עם One Health.

מורפוגנזה תלת ממדית במעי על שבב של כלבים באמצעות אורגנואידים במעי שמקורם במחלות מעי דלקתיות

מאמר זה מתאר פרוטוקול ליצירת מכשיר תרבית נרתיק על שבב (שבב נרתיק) מיקרופלואידי המאפשר לחקור אינטראקציות של מארח אנושי עם מיקרוביום נרתיקי חי בתנאים מיקרואירופיליים. שבב זה יכול לשמש ככלי לחקר מחלות נרתיקיות, כמו גם לפתח ולבדוק אמצעי נגד טיפוליים פוטנציאליים.

מידול מיקרו-סביבות נרתיקיות בריאות ודיסביוטיות בנרתיק אנושי על שבב

הפרוטוקול המפורט שלנו מתאר את היצירה והשימוש במודל מעי על שבב מתקדם, המדמה רירית מעיים אנושית עם מבנים תלת-ממדיים וסוגי תאים שונים, ומאפשר ניתוח מעמיק של תגובות חיסוניות ותפקודים תאיים בתגובה להתיישבות מיקרוביאלית.

מודל מעי-על-שבב חיסוני לניתוח תגובות חיסוניות של רירית המעי

חקור שיטת תרבות משותפת של מיקרוביום מעיי ותאי מעי אנושיים במערכת gut-on-a-chip מיקרופלואידית. שיטה זו מאפשרת מחקר מנגנוני מחלות ופיתוח תרופות חדשות בגסטרואנטרולוגיה.

עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic

גלה סרטונים נוספים