Name: השתלות תחרותיות להערכת כושר תאי גזע Hematopoietic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: למדו כיצד לבצע השתלות תחרותיות של מח עצם בעכברים להערכת כושר תאי גזע המטופויאטיים. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני התחדשות עצמית ללא מיון תאים, עם יתרונות בביולוגיית תאי גזע ואימונולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים RoxAnn Hétu-ארבור לסיוע עם עיצוב דמות והדגמה של הליכים. מחקר במעבדה נתמך על ידי פרסים מעבר מקרן קול, דיסקברי להעניק אין. 419226-2012 מן למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) וקרן קנדה עבור חדשנות (קרן מנהיגים CFI להעניק אין. 31,377). KMH הוא ג&#39;וניור Chercheur-Boursier עבור Fonds דה משוכלל ונדיר קוויבק - Santé (FRQS).

כל הנהלים מתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת אתיקת חיה המוסדית אחרי המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בבעלי החיים. הערה: כדי לשמור על תנאים סטריליים דיור / ספציפיים חינם לפתוגן, לנהל את כל הנהלים הקשורים טיפול ישיר של עכברים חיים בתוך ארון בטיחות ביולוגי או ברדס זרימה למינרית. נקו או לעקר כלובים, התקני ריסון, חומרים דיור, צ&#39;או ומים הניתנים לבעלי החיים כראוי. השתמש רק מחטים סטריליות, חד פעמיות עבור הזריקות לדגימת דם. טכניקת אספטי היא קריטית במהלך תקופת ההכנה של השתל. 1. הכנת עכברים הנמען <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות עכברי נמען עם חריצי אוזן (או שיטה אחרת שאושרה על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים המקומית 8) כדי לאפשר מעקב פרט של כינון מחדש מח העצם ודם היקפי לאורך זמן. לשקול העכברים עבור מעקב לאחר ההשתלה. לָנוּעכברי נמען דואר כי הם בין 7 ל 12 שבועות (פחות מ -25 גרם). הערה: בדוגמא בתנאי, CD45.1 + CD45.2 + עכברי נמען גדלו בבית על ידי חציית עכברי C57Bl / 6 עם עכברי B6.SJL congenic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקרין עכברי נמען עם שתי מנות של 450 rad להרוס פעילות hematopoietic. נתן המנה הראשונה היום לפני השתלה ואת hr 1-2 השני לפני ההשתלה. הערה: רנטגן או קרני גמא יכול גם לשמש תלוי בזמינות של הסביבה מתאימה. </li></ol> 2. הכנת תאים במח העצם התורם ומתחרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים תורם (מבחן ובקרה; CD45.2 +) ושל המתחרה (CD45.1 +; B6.SJL) עכברים בחנק CO 2 ואחריו נקע בצוואר רחם או בשיטות אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים המקומית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח עכברים על הגב, רגליים פתוחות לרווחה, צלחת פטרי ריקות או על גזת סטרילי (כדי לשמור על משטח העבודה נקי) inside ארון בטיחות ביולוגית. להרטיב את העור ופרווה עם 70% אתנול / 30% H 2 O (V / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הרגל עם להב כירורגי או במספריים חדים. לחתוך את העור לאורך הרגל ולמשוך את העור באמצעות מלקחיים משוננים. חותכים את השריר על עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקוע הירך על ידי משיכת עצם הרגל ושימוש להבי מספריים נגד עצמות האגן ככוח הדלפק. ניתוק השוקה ועצם ירך מן פיקת הברך ולהסיר חתיכות הנותרים של שרירים וגידים. מניחים את העצמות 2-3 מ&quot;ל בופר פוספט סטרילית (PBS) בצלחת בתרבית רקמה 6 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים במח העצם על ידי שטיפה העצמות עם 5 מ&quot;ל סטרילי PBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את העצם בעדינות עם מלקחיים להכניס מחט 25 G מצורף מזרק 1 מ&quot;ל מלאים עד קצה אחד של העצם. לחץ על הבוכנה לאסוף את התאים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. חזור לפי הצורך עד מרכז העצם הוא לבן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את התאים על ידי חוזרות עובר דרך המחטלקבל השעיה תא בודד. הימנע בועות כוח עודף. הערה: שימוש במחט מעט גדול (22 G) כדי לשפר את כדאיות התא בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים דרך מסננת ניילון 70 מיקרומטר כדי להבטיח השעית תא אחידה להסיר פסולת גושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת aliquot עבור ספירת תאים באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה השעית התא הנותרת ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 °. כוונו צפיפות התאים כנדרש PBS סטרילי (10 8 תאים / מ&quot;ל). שמור את התאים על קרח. </li></ol> 3. הקמת תורם תא ושווי HSC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את שווה ערך של 3 x 10 6 תאים (30 μl) לתוך 5 מ&quot;ל עגול צינור קלקר בתחתית עבור cytometry זרימה מכתים. הוסף נפח שווה של נוגדנים ללא תווית נגד CD16 / CD32 לחסום מכתים הלא ספציפית (מדולל במאגר מכתים (PBS השלימו עם אלבומין 0.1% שור (BSA) ו 1 mM EDTA) ריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל). דגירה 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 90 μl תערובת אמן נוגדן fluorochrome- מצומדות ערוכים חיץ מכתים: קוקטייל Lineage biotinylated (B220, CD3e, CD11b, Gr1, Ter119), Sca1, CD117, CD135, CD150. דגירה על קרח למשך 30 דקות, מוגן מפני אור. הערה: דילולים מתאימים צריכים להיקבע לכל מנה של נוגדנים. ראה טבלה של חומרים עבור דילולים השתמשו במחקר זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל חיץ מכתים את התאים, מערבולת ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להסיר נוגדן מאוגד. למזוג supernatant ו resuspend גלולה ידי מצליף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl streptavidin fluorochrome- מצומדות מדולל במאגר מכתים (ראה לוח חומרים). דגירה על קרח למשך 20 דקות, מוגן מפני אור. לשטוף כמו בשלב 3.3 להסיר streptavidin מאוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכש את דגימות תאים באמצעות cytometer זרימה עם 9 שישה גלאים לפחות. מהי תדירות של לין - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 <sup&gt; + תאים (משוער HSCs) בכל מדגם באמצעות התבנית ניתוח שמוצג באיור 2 וכפי שדווח בעבר 10,11. הערה: תדירות HSCs פונקציונלי בתוך האוכלוסייה שניתן לאמוד אותה בין 1/3 ו 1/5 2,12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים ושווי HSC מוערך עבור כל הדגימות 11, באמצעות דגימה אחת (בדרך כלל, המתחרה, B6.SJL CD45.1 + בדוגמה זו) כמו הבסיס כמפורט להלן ו באיור 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את המספרים של תאים נדרש תוך שימוש בנוסחאות הבאות: #transplanted HSCs / הנמען = 5 x 10 x 5 תאים תדירות HSC מוערך (כפי שנקבע עבור מדגם הבסיס, מספר זה הוא בדרך כלל בין 75 ל 125 עבור wildtype C57Bl / 6 עכברים) 10-12. הערה: באיור 2, למדגם, התוצאה היא 139 HSCs. תאים כוללים מושתלים # (עבור דוגמאות אחרות; למשל לדוגמא B באיור 2) = # טרנסתדירות HSCs / HSC נטוע. הערה: באיור 2, עבור מדגם B, התוצאה היא 197,826 (או כ 2 x 10 5) תאי מח העצם הכולל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את המספרים הכוללים של תאים נדרשו למקבל שתל עבור כל דגימה באמצעות התוצאות שהתקבלו לעיל. הערה: מספר זה אמור להיות 5 x 10 5 למדגם המחקר (המתחרה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל את מספר המתקבלים צעד 3.7 במספר עכברים הנמען ולהוסיף מספיק תאים עבור לפחות שני עכברים נוספים כדי לפצות על נפח מת בתוך המזרק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים מתחרה (למשל, CD45.1 +) ותאי הבדיקה (CD45.2 +) ב 1: 1 יחס שווה HSC כפי שחושב בשלב 3.6 ולהתאים את עוצמת הקול הסופי עבור 200 μl לכל זריקה באמצעות PBS סטרילית. הערה: קבוצה של חמישה עכברים הנמען נפח הציע ובכך יהיה לפחות 1.4 מ&quot;ל, המכיל תאים במח העצם 3.5 x 10 6 מתחרה (אוHSCs 973 מוערך למדגם באיור 2), ומספר שווה של תאים הבדיקה (באיור 2, המקבילה עבור B לדוגמא יהיה 197,826 x 7 = 1,384,782 תאים במח העצם). </li></ol> 4. השתלת מח עצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את עכברי הנמען המוקרנים בשלב 1.2 עם מנורת חום אדומה על מנת להבטיח התרחבות של כלי דם ועל מנת להפוך את הזנב לרוחב ורידים יותר לעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מזרק טוברקולין 1 מ&quot;ל מצויד במחט 27 G (או קטן יותר). לשאוב כ 750 μl של השעית התא המוכנה (עבור 3 עכברי נמען). ודא שאין בועות אוויר בתוך המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את העכבר לתוך מכשיר הרחקה. בדוק את הזנב ולחפש ורידי הזנב לרוחב כי צריך להיות בבירור משני צידי הזנב. נגב את הזריקה עם אתנול. הכנס את המחט שפוע מעלה, במקביל העור ולחץ בעדינות את הבוכנה. הזרקה צריכה להיות קלה. אם כוח הוא מחדשquired, המחט לא בתוך הווריד. הערה: יש עכברים מבוגרים עור עבה יותר, מה שעשוי להפוך את מציאת הווריד קשה יותר. אם המחט אינה בווריד, הכנס שוב את הפרוקסימלי מחט על הזריקה הראשונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחט ולחץ על הזריקה עם גזה סטרילי במשך כמה שניות כדי לעצור את הדימום. מעבירים את העכבר לכלוב נקי. הערה: השתמש באותו מזרק ומחט במשך שלוש זריקות, שלאחריו המחט עשויה להיות משעממת מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור המעקב לאחר ההשתלה, להזריק 1 מ&quot;ל סטרילי מתחת לעור PBS רעננותם העכברים בחמשת הימים הראשונים. להוסיף אנטיביוטיקה במי שתייה למניעת זיהומים (אם נדרש; אופציונאלי). לשקול עכברים כל יומיים שלושה במשך שלושת השבועות הראשונים להרדים עכברים שאיבדו יותר מ 15-20% ממשקל הגוף מראש השתלת שלהם (או כפי שנקבע על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים מקומיים). </li></ol> 5. ניתוח של דם היקפי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף טיפת הדם (אpprox. 50-100 μl) לתוך צינורות EDTA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף דם מהעורק mandibular, השתמש ניתוח או מחט 22 G כדי לחדור את עור הפנים בסמוך למקום ללא שיער הממוקם מתחת לעצם הלסת במקום צינור איסוף לקבל את טיפת הדם 13. איסוף דם ב 4, 8, 12 ו -16 שבועות לאחר ההשתלה לעקוב כינון מחדש רבת שושלת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל מוכן טרי RT חיץ אדום דם תא תמוגה (9 חלקים 0.16 M NH 4 Cl + 1 חלק 0.17 M Tris-HCl pH 7.65) עד טיפת הדם שנאסף בשלב 5.1.1. מערבבים והעברת מדגם ל -5 מ&quot;ל צינור קלקר מסביב לתחתית מתאים cytometry הזרימה. תנו להחזיק מעמד 4 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 כרכים של PBS קר כקרח. מערבבים על ידי סיבוב מקצה לקצה ולהעביר מיד על הקרח. צנטריפוגה 10 דקות ב 200 XG ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant ו resuspend גלולה ידי מצליף. Supernatant צריך להיות ברור ואדום. הוסף 2 מ&quot;ל מכתים חיץ בקצרה מערבולת. צנטריפוגה 5 דקות ב 200 XGAt 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant ו resuspend גלולה ידי מצליף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עם זרימת cytometry מכתים באמצעות פרוטוקול הכלליים המפורטים צעדים 3.1 עד 3.3 ואת הנוגדנים הבאים מיקס מאסטר: CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, Gr1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכש את דגימות תאים באמצעות cytometer זרימה עם 9 שישה גלאים לפחות. מהי התדירות של תאים תורמים נגזר לכל שושלת (לימפוציטים CD19 + B, לימפוציטים CD3e + T, גרנולוציטים בהיר Gr1) בכל מדגם באמצעות תבנית הניתוח מסופקת באיור 3 ו כפי שפורסם 10,11. </li></ol> 6. ניתוח של כינון מח עצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים במח העצם כמפורט בסעיף 2. הכתם התאים לניתוח cytometry זרימה באמצעות פרוטוקול הכלליים המפורטים צעדים 3.1 עד 3.3 ואת הנוגדנים הבאים מיקס מאסטר: קוקטייל Lineage, Sca1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. זיהוי ליןeage נוגדנים קוקטייל באמצעות streptavidin fluorochrome- מצומדות כמתואר בשלב 3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכש דגימות תאים באמצעות cytometer זרימה עם 9 שמונה גלאים לפחות. אם רק שש זמינים, להוסיף CD135 לאותו ערוץ כמו לוח שושלת כפי CD135 + תאים ייכללו. מהי התדירות של לין תורם נגזר - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 + HSCs בכל מדגם באמצעות תבנית הניתוח מסופקת באיור 4 וכפי שפורסם 10. </li></ol>

<ol><li>Li, H. W., Sykes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+haematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation.</a> Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purification+of+fetal+liver+hematopoietic+stem+cells+using+SLAM+family+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors.</a> Blood. 108 (2), 737-744 (2006).</li>
<li>Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells.</a> Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).</li>
<li>Rossi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Less+Is+More%3A+Unveiling+the+Functional+Core+of+Hematopoietic+Stem+Cells+through+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).</li>
<li>Till, J. E., McCulloch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+measurement+of+the+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells.</a> Radiat Res. 14, 213-222 (1961).</li>
<li>Shen, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+Ly-5+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning of Ly-5 cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+GM+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Identification of GM mice.</a> Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).</li>
<li>Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+determination+of+rare+populations+by+flow+cytometry%3A+A+hematopoietic+stem+cell+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective.</a> Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).</li>
<li>Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled-6+Regulates+Hematopoietic+Stem%2FProgenitor+Cell+Survival+and+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal.</a> J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).</li>
<li>Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt4+enhances+murine+hematopoietic+progenitor+cell+expansion+through+a+planar+cell+polarity-like+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway.</a> PLoS One. 6 (4), e19279(2011).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+simple%2C+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li>
<li>Santaguida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JunB+protects+against+myeloid+malignancies+by+limiting+hematopoietic+stem+cell+proliferation+and+differentiation+without+affecting+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal.</a> Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).</li>
<li>Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transplantation+via+antibody-based+clearance+of+hematopoietic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches.</a> Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).</li>
<li>Zhang, C. C., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hematopoietic+stem+cells+change+their+surface+phenotype+during+ex+vivo+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion.</a> Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).</li>
<li>Benveniste, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate-Term+Hematopoietic+Stem+Cells+with+Extended+but+Time-Limited+Reconstitution+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).</li>
<li>Fazekasde St Groth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evaluation+of+limiting+dilution+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">The evaluation of limiting dilution assays.</a> J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).</li>
<li>Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signaling+protein+Wnt4+enhances+thymopoiesis+and+expands+multipotent+hematopoietic+progenitors+through+beta-catenin-independent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling.</a> Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).</li>
<li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).</li>
<li>Benz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+Stem+Cell+Subtypes+Expand+Differentially+during+Development+and+Display+Distinct+Lymphopoietic+Programs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).</li>
<li>Eppert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+gene+expression+programs+influence+clinical+outcome+in+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia.</a> Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).</li>
<li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonirradiated+NOD%2CB6.SCID+Il2rgamma-%2F-+Kit%28W41%2FW41%29+%28NBSGW%29+mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הפרוטוקול המתואר כאן נועד להעריך את הכושר היחסי של HSCs התורם (מבחן) נגד ידוע המתחרה HSCs. המצב של תחרות מגביר את הרגישות היחסית של assay (סיכוי גבוהה יותר לזהות ירידות מתונות כושר תאי גזע) ומספק שליטה טכנית פנימית ליעילות של הקרנה והזרקה. עם זאת, זה לא אמור לשמש מדד מוחלט של כושר HSC; ירידת כינון מחדש תחרותי לא אומרת אוטומטית כי HSCs לא מתפקד היטב בהעדר התחרות. למרות זאת ניתן לטעון כי על רקע תחרותי היא נקודת הזינוק הטובה יותר, כמו התאים המתחרים יצילו פונקצית HSC פגומה וכל עכברי ה...

Hematopoiesis הוא תהליך התחדשות המבטיח את replenishing של תאי דם אבדו בגלל פציעה, קרינת מוות של תאים. תהליך זה מובטח על ידי תאי גזע hematopoietic (HSC) השוכנים בעיקר במח העצם הבוגר. בנוסף, תאי גזע hematopoietic יכול לשמש למטרות טיפוליות במחלות אוטואימוניות, מחלות ממאירות המטולוגית ו חסרים חיסוניים 1. יש אפוא צורך להבין טוב יותר את המנגנונים המווסתים פונקציה HSC, ובכלל זה, הרחבת שגשוג שלהם ואת יכולתם להגיע נקלטים במח העצם הנמען לאחר ההשתלה. למרות מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו מספר סמנים פני התא, כולל בני משפחה SLAM CD150 ו CD48, להעשיר HSCs מבוגר פרוספקטיבית HSCs העובר בכ -50% טוהר 2-4, המדד תקן הזהב עבור HSCs פונקציונלי נשאר in vivo repopulating assay כדי לקבוע את יכולתם להקים מחדש ג דםייצור ell ב מארח מוקרן 5. את assay repopulating in vivo המשובטים בתחילה פותח על ידי טיל מקול&#39;ץ 6 ומאז שוכלל והורחב. כהגדרתם במקור, HSCs להבטיח ייצור תאי דם חיים, דרך התחדשות עצמית והבחנה. העברת HSCs לתוך נמען מוקרן ובכך מאפשרת לנו להעריך: יכולתי להבחין באמצעות הניתוח של שושלות תאי דם השונות (לימפוציטים מסוג T, לימפוציטים מסוג B, גרנולוציטים, מונוציטים) ויכולים עבור התחדשות עצמית באמצעות השתלת סדרתי. את assay בדרך כלל יהיה כרוך ההשוואה של פונקציונליות ו / או כמות של שתי אוכלוסיות של HSCs, למשל, תאים המגיעים שני עכברים של גנוטיפים או תאים שונים אשר טופלו או מטופלים עם גורמים שונים שיכולים להשפיע על תחזוקה או הרחבה של HSCs בתרבות. chimerism התורם, או התרומה של התורם מועבר HSCs tייצור תאי דם o אז יכול להיקבע על ידי ניתוח תזרים cytometry בדם ההיקפי ומח עצם באמצעות סמנים פני תא או שיטות אחרות אשר להבחין בין תאי תורם מן הנמען, או מארח. הסמנים הנפוצים ביותר הם ללא ספק שני אללים של הגן Ptprc או לויקוציטים CD45 אנטיגן 7 שבחרנו עבור הדוגמות להלן. את assay והאכלוס המשובט יכול להיות תחרותי או לא תחרותי. באווירה הלא תחרותית, HSCs מלא הבדיקה מועבר לעכברי נמען נפרדים ואת התוצאה עבור כל סוג תא תהיה עצמאית של אחרים. על רקע תחרותי, הפונקציה של שני HSCs הבדיקה והבקרה נמדדה כנגד אוכלוסייה של המתחרה HSCs. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בהגדרה התחרותית אבל יכול גם להיות מותאם למצבים שאינם תחרותיים. יש שני גישות היתרונות והמגבלות שלהם, ואנו להשוות אותם בפירוטדִיוּן. כמו כן, אנו מתארים גישות שונות על מנת להבטיח הון במספר HSCs המושתל, להסביר כיצד להתאים את assay עבור כימות של HSCs על ידי הגבלת assay דילול (LDA), ולספק דוגמאות הן של השתלות מוצלחות ולא מוצלחות על הפרשנות של תוצאות.

<table><tbody><tr><td>צינורות מיקרוטיינר עם K2EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>20 גרם מחט</td><td>BD מזרק</td><td></td><td>לדגימת דם מווריד הלסת</td></tr><tr><td>התחתונה LabQuake Shaker רוטיסרי</td><td>Thermo&nbsp; Scientific</td><td>C415110</td><td></td></tr><tr><td>מטוהר נגד עכבר CD16/CD32 (שיבוט 2.4G2, בלוק Fc)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>2.50 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>Pe-Cy7-מצומד נגד עכבר CD3e (שיבוט 145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>25-0031</td><td>0.25 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>מצומד PE נגד עכבר CD19 (שיבוט 1D3)</td> <td>eBioscience</td><td>12-0193</td><td>0.25 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>APC-eFluor780 (שווה ערך ל-APC-Cy7) מצומד נגד עכבר GR1 (שיבוט RB6-8C5)</td> <td>eBioscience</td><td>47-5931</td><td>0.25 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>FITC-מצומד נגד עכבר CD45.1 (שיבוט A20)</td> <td>eBioscience</td><td>11-0453</td><td>2.50 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>eFluor450-מצומד נגד עכבר CD45.2 (שיבוט 104)</td><td>eBioscience</td><td>48-0454</td><td>1.00 &mu; גר'/מ"ל</td></tr><tr><td>אנטי-אדם/עכבר ביוטיניל CD45R (B220) (שיבוט RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td>1.25 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>אנטי-עכבר ביוטיניל CD3e (שיבוט 145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>13-0031</td><td>1.25 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>אנטי עכבר ביוטיניל CD11b (שיבוט M1/70)</td> <td>eBioscience</td><td>13-0112</td><td>1.25 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>אנטי-עכבר ביוטיניל GR1 (שיבוט RB6-8C5)</td> <td>eBioscience</td><td>13-5931</td><td>1.25 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>אנטי עכבר ביוטיניל TER119 (שיבוט TER119)</td> <td>eBioscience</td><td>13-5921</td><td>0.625 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>V500 סטרפטווידין</td><td>BD Biosciences</td><td>56149</td><td>0.5 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>מצומד PE נגד עכבר CD117 (שיבוט 2B8)</td><td>BD Biosciences</td><td>553355</td><td>0.25 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>PE-Cy7-מצומד נגד עכבר Ly6A/E (Sca1) (שיבוט D7)</td><td>BD Biosciences</td><td>558162</td><td>0.25 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>PerCP-eFluor710-מצומד נגד עכבר CD135 (שיבוט A2F10)</td> <td>eBioscience</td><td>46-1351</td><td>0.5 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647-מצומד נגד עכבר CD150 (שיבוט TC15-12F12.2)</td><td>Biolegend</td><td>115918</td><td>0.625 &mu; גרם/מ"ל
BD Biosciences ו-eBioscience אינם נושאים את אותו</td></tr><tr><td>שיבוט מזרק טוברקולין 1 מ"ל עם</td><td>מזרק BD</td> מחט 27 גרם <td>309623</td><td></td></tr><tr><td>מזרק טוברקולין 1 מ"ל עם</td><td>מזרק BD</td> מחט 25 גרם <td>309626</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; מסננת תאים m</td><td>בז BD</td><td>352350</td><td></td></tr></tbody></table>

השתלות תחרותיות להערכת כושר תאי גזע hematopoietic

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

הגדרת תקן הזהב של תא גזע המטופויאטי (HSC) היא תא שכאשר הוא מועבר לנמען מוקרן תהיה לו היכולת לבסס מחדש את ייצור תאי הדם למשך תוחלת החיים של המקבל. פרוטוקול זה מסביר כיצד להגדיר בדיקה פונקציונלית כדי להשוות את יכולות ה-HSC של שתי אוכלוסיות שונות של תאים, כגון מח עצם מעכברים משני גנוטיפים שונים, וכיצד לנתח את העכברים הנמענים על ידי ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול משתמש במקבילות HSC ולא במיון תאים לצורך סטנדרטיזציה ודן ביתרונות ובחסרונות של שתי הגישות. אנו דנים עוד בווריאציות שונות לפרוטוקול הבסיסי, כולל השתלות סדרתיות, מבחני דילול מגבילים, מבחני ביות והשתלות לא תחרותיות, כולל היתרונות והשימושים המועדפים של גישות מגוונות אלה. מבחנים אלו מרכזיים לחקר תפקוד HSC ויכולים לשמש לא רק לחקירת היבטים מהותיים בסיסיים של HSC בביולוגיה אלא גם לפיתוח בדיקות פרה-קליניות להשתלת מח עצם והרחבת HSC בתרבית.

תיאור כללי של הגדרת ההשתלה התחרותית, לרבות השתלות משניות (דנו בהמשך) ניתן למצוא באיור 1. ניתוח נציג HSCs במח עצם מראש השתלה ניתן למצוא באיור 2. מידע מפורט יותר על הדרת כפילויות ו ניתן למצוא תאים מתים במקום אחר 9. איורים 3 ו -4 לספק דוגמאות של זרימת cytometry תבניות ניתוח...

פרוטוקול זה מספק הנחיות שלב אחר שלב להגדרת ניסויים תחרותיים בהשתלת מח עצם של עכבר כדי לחקור את תפקוד תאי הגזע/אב המטופויאטיים ללא טיהור מוקדם של תאי גזע על ידי מיון תאים.

השתלות תחרותיות להערכת כושר תאי גזע Hematopoietic

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לקבוע את הכושר (fitness) של תאי גזע המטופואטיים ממח עצם in vivo באמצעות בדיקת השתלה תחרותית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי הביולוגיה של תאי גזע והשתתלת תאים המטופואטיים בנוגע להשפעת מניפולציות שונות על התחדשות עצמית של תאי גזע לאחר השתלה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם הצורך במספר מוגבל של בעלי חיים והעובדה שהיא אינה דורשת מיון תאים.אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תפקוד תאי גזע, היא עשויה להועיל גם בתחומים אחרים כגון אימונולוגיה, באמצעות שימוש בכימרות מחית עצם מעורבבות. הפיתוח הראשוני של טכניקה זו בשנות ה-60 סלל את הדרך לחוקרים בתחום ביולוגיית תאי הגזע לחקור את הזהות והתפקוד של תאי גזע המטופואטיים בבני אדם ובעכברים. את ההליך ידגימו רוקסאן הטו-ארבור (Roxanne Hetu-Arbour), סטודנטית לתואר שני במעבדה, ואדוארד אווסו קוורטנג (Edward Owusu Kwarteng), סטודנט לדוקטורט.התחל בהנחת העכבר בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית על פלטפורמה כירורגית והרט את העור והפרווה ב-70% ethanol. לאחר מכן, אחוז ברגל אחורית וגזור את העור לאורכה של הרגל. המשך בקליפת העור והסר את השריר העודף.לאחר מכן, כאשר להבי המספריים נשענים על עצמות האגן ככוח נגדי, משוך את עצם הרגל כדי להוציא את ה-femur מהמפרק. נתק את ה-tibia ואת ה-femur מהפיקה, לאחר מכן הסר את כף הרגל, והסר את שא

competitive-transplants-to-evaluate-hematopoietic-stem-cell-fitness

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כתב יד זה מספק תיאור של המתודולוגיה המשמשת להקמת מודלים של עכברי התמרה-השתלה. ניתן תיאור מפורט של טעויות טכניות שיש להימנע מהן בעת ביצוע השתלות מח עצם. יש להשיג הבנה ברורה של החשיבות של טיטר ויראלי גבוה, טרנספקציה/התמרה והקרנה.

התמר-השתלה במודל עכבר של מחלה מיילופרוליפרטיבית

כימות של תאי התורם-derived נדרש לעקוב אחר engraftment לאחר השתלת תא גזע בחולים עם פתולוגיות של המוגלובין. שילוב של מיון תא מבוססי cytometry זרימה המושבה היווצרות assay, לאחר מכן ניתוח של טנדם קצר חזרה ניתן להשתמש כדי להעריך את התפשטות ובידול של אבות בתוך התא erythroid.

זיהוי של התורם שיורית Erythroid ובתאים לאחר השתלת תא גזע Hematopoietic עבור חולים עם פתולוגיות של המוגלובין

אנו מתארים את השימוש השתלת תא גזע hematopoietic (HSCT) כדי להעריך את פוטנציאל ממאיר של תאים מהונדסים גנטית hematopoietic. HSCT שימושית לצורך הערכת שונים תאים ממאירים hematopoietic ויוו , כמו גם יצירת קבוצה גדולה של עכברים עם תסמונות myelodysplastic (MDS) או לוקמיה להעריך טיפולים חדשניים.

השימוש השתלת תא גזע Hematopoietic להעריך את מקורם של התסמונת המיאלודיספלסטית

המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לבודד במוסר הפרימטים CD34+ תאים ממח העצם כאשר הבחינה, ג'ין-לשנות את התאים האלה עם וקטורים lentiviral, וכדי להתכונן מוצר אינפוזיה לתוך המארח עצמיים. האורך פרוטוקול הכולל הוא כ- 48 שעות.

התאמת גנים של גזע Hematopoietic פרימוס Nonhuman, ובתאים והכנה

תיאר הם פרוטוקולים עבור עריכת הגנום יעיל מאוד של גזע המטפאות מורקיים ומחולל קדמון (HSPC) על ידי מערכת CRISPR/Cas9 כדי לפתח במהירות מערכות מודל העכבר עם המטפאות ספציפיים שינויים גנים.

לנטינגיו CRISPR/Cas9 בתיווך הגנום עריכה לחקר התאים המטפאות במודלים למחלות

כאן אנו מתארים שיטה אמינה למדוד מסה מיטוכונדריאלי פוטנציאל קרום בתאי גזע vivo המטפאות לשעבר תאים T.

מדידת מיסת מיטוכונדריאלי ופוטנציאל ממברנה בתאי גזע ותאי T-תאים על ידי זרימה Cy,

אנו מתארים שלוש שיטות של השתלת מח עצם (BMT): BMT עם הקרנת גוף כוללת, BMT עם הקרנה מוגנת, ושיטת BMT ללא מיזוג מראש (BMT מאמץ) לחקר המטופוזיס שיבוטים במודלים של עכבר.

הליכים השתלת מח עצם בעכברים ללמוד Hematopoiesis שיבוט

פרוטוקול זה מאפשר שמירה על תאי גזע המטטופיאטיים אנושיים רגיעה במבחנה על ידי חיקוי microenvironment מח העצם באמצעות חומצות שומן בשפע, כולסטרול, ריכוזים נמוכים יותר של ציטוקינים, והיפוקסיה.

שיטת תרבות לשמירה על תאי גזע ההמטוטופיאטיים האנושיים

פרוטוקול זה מתאר הזרקה תוך-פמורלית של כמה תאי גזע המטופויטיים או לוקמיים, כולל תאים ערוכים גנטית, במודלים של קסנוגרפט מורין, אשר לא רק יאפשרו השתלה מהירה ובטוחה של תאים אלא גם ניתוחים סדרתיים של מח העצם.

הזרקות תוך עצם הירך הפשוטות באמצעות עכברים חיים מאפשרות ניתוח רציף של מח עצם

זריקות תוך פמורליות מאפשרות קליטה של מספר קטן של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים (HSPCs), על ידי הצבת התאים ישירות בחלל מח העצם. כאן אנו מתארים פרוטוקול ניסיוני של הזרקה תוך-פמורלית של HSPCs אנושיים לעכברים מדוכאי חיסון.

הזרקה תוך-פמורלית של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים אנושיים לעכברים מדוכאי חיסון 

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב טכנולוגיית CRISPR/Cas9 עם בדיקת Cell Counting Kit-8 (CCK-8) כדי לזהות גנים מועמדים החיוניים ליכולת ההתפשטות החריגה של תאי גזע ואב המטופויאטיים.

הערכה של גנים חריגים הקשורים לגדילה של תאי גזע ואב המטופויאטיים על ידי שילוב של טכנולוגיית CRISPR/Cas9 עם ספירת תאים

למדו כיצד לבצע השתלות תחרותיות של מח עצם בעכברים להערכת כושר תאי גזע המטופויאטיים. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני התחדשות עצמית ללא מיון תאים, עם יתרונות בביולוגיית תאי גזע ואימונולוגיה.

השתלות תחרותיות להערכת כושר תאי גזע Hematopoietic

גלה סרטונים נוספים