התנהגויות חוש הריח assayed ידי מעקב ממוחשב של
20 באוגוסט 2016
אנו מתארים כאן הגדרה התנהגותית ושיטת ניתוח נתונים לבדיקת תגובות הריח של עד 100 זבובי חומץ (Drosophila melanogaster). ניתן להשתמש במערכת זו עם גירוי ריח יחיד או מרובה, וניתנת להתאמה להפעלה אופטוגנטית או להשתקה של תת-קבוצות עצביות.
המטרה הכללית של מערך זה היא לבחון התנהגויות ריח של זבובים באולפקטומטר בעל ארבעה רבעים באמצעות סקריפט תוכנה מסופק למעקב אוטומטי אחר זבובים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לאופן שבו מערכות עצביות של חוש הריח מזהות את העולם החיצוני, וכיצד המוח מפענח ומכוון החלטות התנהגותיות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא ורסטילית ועמידה, ומאפשרת בדיקות חוזרות של תגובות ריח על ידי אוכלוסייה של זבובים בזירה ניסויית גדולה.
עבור פרוטוקול זה, הכינו חמישה תאי ריח המורכבים ממכל פלסטיק חיצוני, מכל זכוכית פנימי ותוסף מכסה מ-PTFE שהוכן בהתאמה אישית. התוסף הוא מכסה מכל מקורי שחלקו המרכזי הוסר, ואליו מחוברים שני שסתומים חד-כיווניים. השתמשו בארבעה מתאי הריח כביקורת ממס, ובמכל אחד עבור ריח לבדיקה.
וודאו שכל תא נקי, ולאחר מכן מלאו מכל ריח ב-1 mL של ממס או של תמיסת ריח מהולה. לאחר מכן, בדקו את מיקום המכל בתא הפלסטיק, ווודאו שלא נשפך נוזל. הדקו את המכסה באמצעות הפקק המבורג וטבעת O-ring על תוספת ה-PTFE כדי למנוע דליפות.
גדלו את הזבובים על מצע קורנמיל סטנדרטי. בבקבוק סטנדרטי, הניחו 30 זכרים ו-30 נקבות, ואפשרו הטלת ביצים למשך חמישה ימים בטמפרטורת החדר. מבקבוקים אלו, אספו זבובים שבקעו לאחרונה.
עבור כל קוהורט ניסויי, אספו 25 זבובים זכרים ו-25 זבובים נקבות תחת הרדמה קצרה של פחמן דו-חמצני, והניחו לקוהורט להזדקן על מצע מזון סטנדרטי לזבובים למשך יומיים עד ארבעה ימים. 40 עד 42 שעות לפני הניסוי, העבירו את הקוהורט לבקבוקון המכיל כ-10 milliliters של ג'ל agarose בריכוז 1% לשמירה על לחות, ללא מזון. הרעבה מסייעת להגביר את התנועה הכוללת, ויותר מ-90% מהזבובים אמורים לשרוד את תהליך ההרעבה.
אם יותר מ-10% מהזבובים מתים, דבר שעלול לקרות בגנוטיפ חלש, נסו להרביעים את כל הזבובים בניסוי בהרעבה למשך יום אחד. לפחות חמש דקות מראש, הפעילו את בקר הטמפרטורה והגדירו אותו ל-25 degrees Celsius. לאחר מכן, חברו את תאי הריח לזירה באמצעות צינור פלסטיק.
בדוק את קצב זרימת האוויר בכל רבע של הזירה באמצעות מד זרימה אלקטרוני. ודא שגם זרם אוויר הבקרה וגם זרם אוויר הריח פועלים ב-100 milliliters per minute. זבובים רגישים מאוד לזרימת אוויר, וקריטי שזרימת האוויר עבור כל רבע תאומת לפני כל ניסוי.
כעת, נקו את הזירה ואת לוחות הזכוכית באמצעות 70% ethanol. נגבו את כל החלקים פעמיים עד שלוש, והמתינו לייבוש מלא באוויר לפני ההמשך. לאחר מכן, הדקו את לוחות הזכוכית לזירה.
לאחר מכן, העבירו את הזבובים לזירה ללא הרדמה. בעזרת כוח המשיכה, אפשרו להם להיכנס דרך החור באחת מלוחות הזכוכית, ולאחר מכן כסו את החור ברשת עגולה. כעת, הניחו את הזירה עם הזבובים בתוך התא אטום האור.
לאחר מכן, חברו את ארבעה זרמי האוויר של הביקורת לכל אחת מפינות הזירה. סגרו את דלת התא והניחו לזבובים להסתגל לסביבה החדשה במשך 10 עד 15 דקות. לאחר תקופת ההסתגלות, בצעו ניסוי ביקורת של חמש עד 10 דקות שבו הזבובים נחשפים לארבעה זרמי אוויר של ביקורת.
כעת חיוני לנתח את הנתונים באופן מיידי. אם הזבובים אינם מפוזרים באופן שווה בזירה, יש לאפס את הזירה. קריטי לבחון את התנהגותם של זבובים של קבוצת ביקורת החשופים לאוויר נקי בלבד.
פעולה זו תאמת במהירות שכל תנאי הרקע תקינים. דליפת אור, חוסר איזון בטמפרטורה, זירת ניסוי נטויה או זיהום ריח עלולים לגרום לבעיות. במידת הצורך, השליכו את הזבובים ונקו את הזירה שוב.
אם קיים חשד לזיהום בחומרי ריח, החליפו את כל הצינורות. המשיכו לחזור על בדיקת הביקורת עם קבוצות חדשות עד שהבעלי החיים לא יפגינו העדפה לאף אחד מארבעת הרביעים. לאחר מכן, חברו את תא חומר הריח לבדיקה למערך באמצעות שסתום תלת-כיווני, או חברו מחדש את הצינורות והריצו ניסוי בדיקה למשך 5 עד 10 דקות.
עבור הקלטות ניסיוניות ארוכות יותר, עצור והפעל מחדש במהירות את תוכנת המעקב בכל 20 דקות, אחרת קבצי הנתונים יהיו גדולים מדי. בין הבדיקות, השליך את הזבובים, נקה את הזירה ואת לוחות הזכוכית באמצעות 70% ethanol, והחלף את צינורות החיבור. המשך בזרימת האוויר היבש כדי לשטוף את המערכת באופן רציף.
לצורך יעילות, מומלץ להחזיק שתי זירות כך שניתן יהיה לבצע ניקוי בזמן שהניסויים רצים. אם מספר ניסויים נכשלו באותו יום, יש לנקוט במשנה זהירות כדי להבטיח שלא נותר ריח במערכת מהרצה קודמת. בדרך כלל אין זו בעיה בריכוזים נמוכים של חומר ריח או עם CO2, אך עבור גירויים בריכוז גבוה, ייתכן שיהיה צורך במרווח של עד 24 שעות בין הרצות הניסויים.
עבור ניתוח הנתונים, השתמשו בשגרת Matlab המותאמת שסופקה כדי להמיר את הנתונים לפורמט Matlab. טענו את קובץ הנתונים הגולמיים שנוצר בזמן אמת על ידי תוכנת המעקב, וצרו מסכה מרחבית העוקבת אחר קווי המתאר של הזירה. החילו את המסכה על הנתונים הגולמיים כדי להסיר את כל נקודות הנתונים הנמצאות מחוץ לזירה, שכן הן מייצגות רעש.
לאחר מכן, הסר את כל נקודות הנתונים שנעו במהירות של פחות מ-0.163 centimeters per second למשך יותר משלוש שניות. נתונים אלו הם ככל הנראה רעש, או זבובים שאינם נעים. כעת, הדמייז את נקודות הנתונים שנותרו על ידי שרטוט כולן לאורך תקופות ההקלטה.
ניתן להציג את הנתונים גם כמסלולים בודדים. ניתן להעריך במהירות את גבולות הריח על בסיס נתוני ההתנהגות של הזבוב. לאחר מכן, חשבו את מדד המשיכה וערוך בדיקות סטטיסטיות כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.
25 זבובים זכרים ו-25 זבובים נקבות נבחנו במערך ההתנהגותי. בתגובה לאוויר יבש, הזבובים חקרו את כל הזירה ללא העדפה לאף רבע. הקו מראה את מסלול המעקב של זבוב אחד.
כאשר חומץ תפוחים הוכנס לזרם האוויר ברביע העליון-שמאלי, מרבית הזבובים נמשכו לרביע ריח זה. כאשר חומר ריח דוחה, 10% ethyl propionate, הוכנס לרביע העליון-שמאלי, רבע זה נמנע. מדד המשיכה של רבע זה היה 0.68.
מדד משיכה הוא המדד הנפוץ ביותר למדידת תגובה ריחית. ערך שמעל או מתחת לאפס מעיד על משיכה או דחייה. הסקריפט פיצה על שינויים קלים במיקום הזירה בין החזרות.
נקודות נתונים שייתכן והיו רעש או זבובים שלא נעו הוסרו. למרות שניתן להריץ את הבדיקה למשך זמן כלשהו, מעניין לבחון שינויים בתנועות של הקוהורט בטווחים של 10 שניות כדי להעריך הרגלה לריח ותופעות אחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להריץ ולנתח ביעילות התנהגויות 후ולקטוריות במערך של ארבעה שדות.
לאחר השליטה בשיטה, ניתן להשלים כל ניסוי חוש ריח בערך בשעה, ואנו מבצעים באופן שגרתי ארבעה עד שישה ניסויים במהלך יום אחד.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג מערך התנהגותי ושיטה לניתוח נתונים להערכת תגובות ריח בזבובים של פירות (Drosophila melanogaster). המערכת תוכננה לשימוש עם גירויים ריחניים בודדים או מרובים, וניתן להתאימה למניפולציה אופטוגנטית של תתי-אוכלוסיות של נוירונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה התנהגותית
- מערכות חושם
רקע
- המחקר מתמקד באופן שבו מערכות עצביות ריחניות מזהות גירויים חיצוניים.
- הבנת פענוח המידע החושי על ידי המוח היא קריטית לקבלת החלטות התנהגותיות.
- מערך האולפקטומטר מאפשר בדיקה מבוקרת של תגובות ריח.
- שיטה זו יכולה להכיל אוכלוסייה גדולה של זבובים לצורך בדיקות חוזרות.
מטרת המחקר
- לבדיקת התנהגויות 후שם של Drosophila melanogaster.
- לחקירת המנגנונים של זיהוי ריח ותגובות התנהגותיות.
- לספק מסגרת ניסויית רב-גונית ואמינה למחקרים עתידיים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- שימוש באולפקטומטר בעל ארבעה רבעים לבדיקות התנהגותיות.
- תוכנה אוטומטית למעקב אחר זבובים לצורך איסוף נתונים.
- הכנת תאי ריח בתצורות ספציפיות לבדיקה.
- שילוב של ביקורות ממס לצד חומרי הריח הנבדקים לצורך השוואה.
תוצאות עיקריות
- המערך מאפשר הערכה של תגובות ריח באוכלוסיות גדולות של זבובים.
- מוצגת ורסטיליות בבדיקה עם גירויי ריח שונים.
- איסוף נתונים חסון באמצעות מעקב אוטומטי משפר את המהימנות הניסויית.
- פוטנציאל ליישומים אופטוגנטיים למניפולציה של פעילות נוירונלית במהלך הבדיקות.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה מקיפה לחקר התנהגות ריחית ב-Drosophila.
- היא פותחת נתיבים לבחינת הבסיס העצבי של עיבוד ריח.
- ניתן להתאים את המערך לצרכים ניסויים שונים במחקר בתחום מדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקה זו מאפשרת הערכה כמותית בתפוקה גבוהה של התנהגויות המונעות על ידי חוש הריח ב-Drosophila, ובכך תומכת בתיקוף מטרות בנורו-פארמקולוגיה ובמדעי העצבים החושיים. על ידי אספקת תוצרי התנהגות הניתנים לשחזור ומקושרים לתפקוד מעגלים עצביים, היא מקלה על הפחתת סיכונים מכניסטיים של היפותזות טיפוליות המערבות עיבוד ריח או מסלולים כימו-חושיים. יכולת ההסתגלות של המערכת למספר גירויים ומודלים גנטיים מגבירה את התועלת שלה בתהליכי גילוי מוקדמים לזיהוי מובילים (leads) ובביטחון חיזוי במעורבות המטרה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מעגלים עצביים ריחניים כדי לתקף מטרות המעורבות במסלולי זיהוי חושי ותגובה התנהגותית.
- ערך תפעולי: תומך בסריקה התנהגותית ברמת אוכלוסייה באמצעות מעקב אוטומטי, מה שמפחית שונות ומגביר את התפוקה לצורך הפחתת סיכונים במטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר מדדי משיכה/דחייה כמותיים המשמשים כקריאות פנוטיפיות עבור קמפיינים של סריקת תרכובות או סריקה גנטית.
- ערך תפעולי: בקרת זרימת אוויר סטנדרטית ותכנון זירה מבטיחים הדירות בין הרצות, מה שמאפשר תיקוף מהימן של הבדיקה עבור יישומים המשכיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר רציפות ממניפולציה של גן או מטרה לפלט התנהגותי מדיד, ובכך תומך בהלימה של סמנים ביולוגיים תרגומיים בפנוטיפים תחושתיים.
- ערך תפעולי: תואם למודלים גנטיים (למשל, קווים טרנסגניים), ומאפשר הערכה של השפעות knockdown או ביטוי יתר של מטרה על התנהגות מונחית ריח.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי קישור הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות לתוצרי התנהגות מדידים, ובכך תומכת במעבר מזיהוי מטרה לוולידציה פנוטיפית.
- ביולוגיה של תגליות: מאפשר בדיקת השערות לגבי תפקוד מעגלים ריחוניים על ידי מדידת תגובות התנהגותיות בזמן אמת לגירויים מבוקרים.
- סריקה: מספק תנאים סטנדרטיים ומוכנים לבדיקה להערכת קוהורטות גדולות של זבובים תחת אתגרים ריחוניים מוגדרים.
- אנליטיקה: מספק נתוני התנהגות מרחביים וחישובים של מדד משיכה המאפשרים השוואה כמותית בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מניפולציה עצבית להתנהגות ניתנת לצפייה, ובכך תומך בתוקף פרה-קליני של מטרות במסלולי עיבוד חושי.
- שימוש חוזר ארגוני: התכנון המודולרי של האולפקטומטר מאפשר שימוש חוזר בפרויקטים, גירויים וגנוטיפים מרובים, ובכך מקדם יעילות ברמת הפלטפורמה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי במערכות יחסי מטרה-התנהגות על ידי הפחתת רעשים באמצעות מעקב אוטומטי וסינון התנהגותי.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות תיקוף קפדני של זרימת האוויר, פרוטוקולי ניקוי של הזירה ובדיקות ניסויי ביקורת.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go בתיקוף מטרות על ידי אספקת פנוטיפים התנהגותיים ברורים וכמותיים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על נתוני הפחתת סיכון התנהגותיים ממבחני ריח.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila, תכנון מערכי בדיקה התנהגותיים, וניתוח נתונים בסיסי ב-MATLAB או בתוכנה מקבילה.
- תלוי בציוד לוויסות זרימת אוויר, במערכות להזרקת חומרי ריח, ובחומרת מעקב וידאו עם בקרות סביבתיות.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הרעבה, ניקוי הזירה וניסויי ביקורת כדי לשלול הטיות מיקומיות או זיהומים.
- חייב להביא בחשבון שיעורי הישרדות ספציפיים לגנוטיפ במהלך הרעבה ולהתאים את הפרוטוקולים בהתאם כדי לשמר את חיוניות הקוהורט.
- מוגבל בשל הצורך בשטיפות תכופות של המערכת ובסכנה לזיהום צולב עם חומרי ריח בריכוז גבוה, מה שדורש זמני השבתה ממושכים בין הרצות.
