מלכודת בתיווך Fusion של יחיד Proteoliposomes עם Bilayers Tethered הנתמך בתוך תא זרימת Microfluidic מנוטר על ידי Polarized TIRF מיקרוסקופי

המטרה הכוללת של בדיקה זו היא לצפות באירועי היתוך ממברנה בודדים המונעים על ידי חלבוני SNARE עצביים ואקסוציטוטיים כדי להבין מנגנונים בסיסיים של נוירוטרנסמיטר ושחרור הורמונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום היתוך הממברנה, כגון כיצד מתרחש שחרור מטען דרך נקבובית היתוך דינמית, וגורל הנקבוביות לאחר האיחוי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לצפות בשלבים מובהקים של עגינת שלפוחית, היתוך לפתיחה וקינטיקה של שחרור מטען עבור אירועים בודדים בסביבות מוגדרות ביוכימית.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אקסוציטוזיס, ניתן ליישם אותה גם על תגובות אחרות של היתוך ממברנה, כגון היתוך של נגיפי מעטפת עם ממברנות תאי מטרה במהלך זיהום. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שצריך לשלוט בשלבים רבים ושונים ממיקרו-ייצור ועד לטיהור והדמיה של חלבונים. כדי להתחיל, הכינו תבנית מאסטר מסיליקון באמצעות טכניקות פוטוליתוגרפיה סטנדרטיות והתבנית המוצגת כאן.

לאחר מכן, הוסיפו 100 מיליליטר בסיס PDMS ו -10 מיליליטר של חומר הריפוי לכוס פלסטיק חד פעמית, וערבבו היטב את התערובת. לאחר מכן, הניחי את הגביעונית במייבש ואקום. מרחו ואקום, אך צפו בו מקרוב כדי למנוע מהתערובת לעלות על גדותיה.

לאחר הסרת הגז, שפכו טיפה גדולה מתערובת ה-PDMS נטולת הגז לתוך צלחת פטרי מזכוכית, ולחצו את התבנית על ה-PDMS כשצד התבנית פונה כלפי מעלה כדי למנוע לכידת בועות מתחת לפרוסת. כעת, שפכו PDMS נטול גז על התבנית עד שהיא מכוסה בחמישה עד שמונה מילימטרים של הפולימר. אם מתרחשת בועת אוויר, הסר אותה בעדינות בעזרת קצה פיפטה.

הניחו את התבנית המכוסה ב-PDMS על משטח ישר של תנור, ואפו אותה במשך שלוש שעות בחום של 60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמש בלהב אזמל חדש כדי לחתוך בלוק PDMS המכיל את מבני התעלה המעוצבים. שימו לב שהבלוק החתוך צריך להתאים לתלוש כיסוי.

לאחר מכן, הנח את הצד של חריצי התעלה כלפי מעלה, והשתמש באגרוף חורים כדי לקדוח דרך הבלוק בתנועה רציפה אחת. הקפד להסיר את החלק המנוקב מכל אחד משמונת מיקומי החורים. בסיום, הדביקו את חריצי הבלוק כלפי מטה על חתיכת נייר אלומיניום נקייה.

כעת, חתוך צינורות כך שיהיה לו שיפוע קל בקצה אחד, והשתמש בזוג פינצטה כדי לדחוף את הצינור כשליש מהדרך לתוך החורים המנוקבים. חותכים את הצינורות כך שיוכלו להגיע למאגר החיץ ולמשאבת המזרק. כדי לחבר את הצינור למזרקים במשאבת המזרק, חותכים חתיכה קצרה מצינור סיליקון גדול יותר, ובצד אחד, הכנס את הצינור הדק יותר.

ניתן לשמור את הבלוק המוכן לשימוש של PDMS למשך מספר חודשים. ראשית, הנח את בלוק ה-PDMS תחת ואקום גבוה למשך 20 דקות לפחות כדי להסיר גזים מומסים ולהפחית את הסיכון לבועות אוויר בתעלות המיקרופלואידיות במהלך ניסוי ההיתוך. לאחר מכן, ודא שאזור שלב המיקרוסקופ מוגדר לטמפרטורה הרצויה.

בזמן שהטמפרטורה מתאזנת, הכינו את השלפוחיות החד-כיווניות הקטנות המסומנות בפלואורסצנט NBD-PE המכילות חלבוני t-SNARE, או בקרות נטולות חלבון, על ידי דילול 30 מיקרוליטר של השלפוחיות ב-60 מיקרוליטר של חיץ. לאחר מכן, משוך את התמיסה למזרק של שלושה מיליליטר. לחץ החוצה את רוב האוויר מעל הדגימה תוך החזקת המזרק אנכית.

לאחר מכן, אטמו את הקצה באמצעות סרט פרפין, וצרו ואקום על ידי משיכת הבוכנה כלפי מטה. תוך כדי משיכת ואקום, הקש על קנה המזרק כדי להאיץ את הסרת הגז של התמיסה. חזור על תהליך זה מספר פעמים עד שלא יתרחשו בועות אוויר נוספות בעת הפעלת הוואקום.

לאחר מכן, השתמש במחט היפודרמית בקוטר מעט גדול יותר מהצינור המיקרופלואידי כדי לנקב חור במכסה של צינור מיקרו-צנטריפוגה. מלאו את השלפוחיות החד-צדדיות הקטנות שפורקו לתוך צינור המיקרו-צנטריפוגה, הנח אותו לתוך המחזיק במיקרוסקופ stage, ואפשר לתמיסה להתייצב לטמפרטורה שנקבעה. הנח פתק כיסוי נקי לתוך מנקה פלזמה, והעביר פלזמת אוויר על החלקה למשך כחמש דקות.

לאחר מכן, הסר את החלקת הכיסוי והנח אותה, כשהצד המטופל כלפי מעלה, על גבי כמה טישו נטול מוך המשמשים ככרית. לאחר מכן, הנח את בלוק ה-PDMS, הצד המעוצב כלפי מטה, על גבי החלקת הכיסוי. השתמש בזוג פינצטה כדי ללחוץ בעדינות כלפי מטה על הבלוק, אך אל תלחץ כל כך חזק עד כדי לשבור את הזכוכית.

הנח את תא הזרימה המורכב על שלב המיקרוסקופ. לאחר מכן, חבר את הצינורות למאגרי השלפוחית החד-צדדיים הקטנים ולמשאבת המזרק. התחל לשאוב את השלפוחיות החד-צדדיות הקטנות במהירות של שלושה מיקרוליטר לדקה עד שהתמיסה ממלאת את התעלות לחלוטין.

כאשר התמיסות בכל הערוצים מתחילות לנוע במעלה הצינור בצד היציאה, הפחיתו את הזרימה ל-0.5 מיקרוליטר לדקה, ודגרו למשך 30 עד 45 דקות. הזמן בין טיפול בפלזמה להחלקת מכסה הזכוכית להזרמת רכבי השטח לתעלה לא יעלה על 10 דקות, מכיוון שהשפעת הטיפול בפלזמה היא חולפת. בדוק את הערוצים לאיתור נזילות באמצעות הדמיה פלואורסצנטית עם מטרת הגדלה נמוכה, ולאחר מכן, שטוף את כל התעלות עם מאגר נטול גז כדי לשטוף שלפוחיות לא קשורות.

לאחר מכן, עבור למטרת טבילת השמן בהגדלה גבוהה עבור מיקרוסקופ TIRF, ואבטח את תא הזרימה על ידי הדבקתו על שלב המיקרוסקופ. לסגור את דיאפרגמת השדה לקוטר של כ-40 מיקרומטר, ולהתאים את עוצמת אור העירור של 488 ננומטר באמצעות התוכנה על מנת להלבין את הקרינה באזור החשוף באופן משמעותי, אך לא לחלוטין. עוצמת הקרינה באמצע האזור החשוף צריכה להיות נמוכה יותר מאשר בקצוות, מכיוון שמולקולות NBD-PE השלמות נכנסות ומתפזרות מרחק מסוים לפני ההלבנה.

עם זאת, אם רכבי השטח הנצמדים למשטח לא מצליחים להתפוצץ, כל הפלואורופורים באזור החשוף צריכים להלבין. כדי לאמת את תוצאות מדידות מצב המחקר, עצור את התאורה והפעל אותה מחדש כעבור מספר דקות כדי לראות אם הקרינה התאוששה. הסר את מאגר הבנייה מחדש, והשתמש בו כדי לדלל את תמיסת מלאי השלפוחית החד-כילמית, כך שהתמיסה המתקבלת מייצרת 10 עד 100 אירועי היתוך בשדה הראייה במהלך 60 שניות.

יותר מדי אירועי היתוך מגבירים את הקרינה ברקע ומקשים על זיהוי וניתוח האירועים. לעומת זאת, קצב היתוך נמוך מדי יכול לגרום לסטטיסטיקה גרועה. הזרם את ה-v-SNARE שחזר שלפוחיות חד-צדדיות קטנות לתוך התעלה בקצב זרימה של שני מיקרוליטר לדקה, ועבור להגדרות פליטת העירור המתאימות כדי לפקח על ערבוב השומנים.

לאחר מכן, התאם את זווית ה-TIRF והקיטוב כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לעורר ולנטר באופן רציף את הקרינה של השלפוחיות באמצעות לייזר 561 ננומטר. כאשר השלפוחיות מגיעות לתעלת הזרימה ועוגנות ומתמזגות עם השכבה הדו-שכבתית הנתמכת, אות הקרינה ברקע מתחיל להצטבר.

התאם את עוצמת לייזר העירור באמצעות התוכנה כדי להלבין באופן רציף את הקרינה ברקע, כך שניתן יהיה לצפות בקלות באירועי עגינה והיתוך חדשים. רכוש מספר סרטים במיקומים שונים בערוץ נתון. בדוק את הקרינה של NBD-PE כדי לוודא שלשכבה הדו-שכבתית הנתמכת אין פגמים במיקומים אלה.

התאוששות הקרינה לאחר הלבנת פוטו מוצגת כאן עבור שכבה דו-שכבתית נתמכת משוחזרת של t-SNARE שהייתה יחסית נטולת פגמים ונוזלית. האזור מצולם בחשיפה לאור נמוך כדי לעקוב אחר התאוששות הקרינה על ידי דיפוזיה של ליפידים המסומנים ב-NBD. קל יותר לצפות באירועי עגינה ואיחוי תוך ניטור הקרינה מתוויות השומנים בלבד.

ברצף התמונות המוצג כאן, מסגרת נרשמה כל 18 אלפיות השנייה. עם ההיתוך, תוויות השומנים עוברות לשכבה הדו-שכבתית הנתמכת ומתפזרות הרחק מאתר האיחוי. במקרים מסוימים, רצוי לעקוב אחר ערבוב שומנים ושחרור מטען מסיס בו זמנית.

אירוע מייצג המתאר ערבוב שומנים בו זמנית ושחרור מטען מסיס מוצג כאן. בריכוזים הגבוהים המשמשים לאנקפסולציה, הקרינה של התוכן המסיס המתוארת באדום מרווה את עצמה בתחילה. עלייה חדה בפלואורסצנטיות השומנים, המתוארת בכחול, מעידה על ערבוב שומנים עקב אירוע איחוי כמו בניטור בצבע יחיד של תוויות שומנים שהוצגו קודם לכן.

פתיחת הנקבוביות משחררת צבע בעל תוכן מסיס ומקלה על הכיבוי העצמי הראשוני של הצבע בלומן השלפוחית. זה מוביל לעלייה באות המטען המסיס, המשורטט באדום. מעניין שהפלואורסצנטיות של המטען הגיעה לרמה יציבה.

זה מצביע על כך שהנקבוביות נאטמו מחדש לאחר שחרור כל תוויות השומנים וחלק מהמטען המסיס. בסוף, אות התוכן המסיס, המתואר באדום, יורד מהר מאוד. סביר להניח שהסיבה לכך היא איחוי מלא מהיר או התפוצצות ליפוזום.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין תא זרימה מיקרופלואידית ליצירת שכבה דו-שכבתית נתמכת המורכבת מחדש עם חלבוני t-SNARE, ולנטר ולנתח אירועי היתוך שלפוחית בודדת באמצעות מיקרוסקופ TIRF. תודה על הצפייה, ובהצלחה בניסויים שלך.