Name: פרוטוקול בידוד לחוג עכבר של וויליס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: למדו פרוטוקול לבידוד לחוג עכבר של וויליס במודל עכברי לחקר מחלות מוח כגון אלצהיימר. שיטה זו מאפשרת בידוד מהיר של כלי דם גדולים מבלי לשנות את מבנהם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פריז VI אוניברסיטת ומענק חדשנות פייר פאבר.

כל הנהלים בוצעו בהתאם לתקני הקהילה האירופית לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה, באישור ועדת האתיקה המקומית לניסויים בבעלי חיים (Ile de France-פריז-הוועדה, הרשאה 4270). 1. הרדמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות מנה קטלנית של pentobarbital (עד 1 מ&quot;ג / 10 g משקל הגוף) intraperitoneally (מחט G27 עם מזרק 1 מ&quot;ל) לתוך עכברים בוגרים לפני הניתוח. </li></ol> זלוף כלי 2. הערה: אין צורך להחיל משחת וטרינר לעיניים במהלך זלוף כלי. הליך זה הוא מהיר (5-10 דקות) ומסתיים במותו של החיה. אשר את חוסר התגובה עם קמצוץ הבוהן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים איריס, עושים חתך, באורך של 4 ס&quot;מ, לתוך הקיר הצפק הבטן, ממש מתחת לצלעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן (בגודל כמה מילימטרים) ב הסרעפת ואז continuדואר החתך של הסרעפת לאורך כל אורכו של בית החזה כדי לחשוף את חלל פלאורלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את החזה משם מהדק את הקצה של עצם החזה עם hemostat; למקם את hemostat על הצוואר. בזהירות לחתוך את רקמת שומן חיבור עצם החזה אל הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את המחט זלוף 15-מד דרך החדר השמאלי לתוך הקודקוד של הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, להשתמש במספריים לחתוך אחד האונה של הכבד ליצירת פורקן. הערה: יציאה חלופית ניתן ליצור באמצעות מספרי איריס ליצור חתך אל העלייה הימנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse החיה עם 25 עד 50 מ&quot;ל של בופר פוספט (PBS) עם משאבה ההפעלה בשיעור של 2.5 מ&quot;ל / דקה. הכבד צריך להלבין כשהדם מוחלף PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כחמש דקות, אחרי שהנוזל מהכבד ברור לחלוטין, להפסיק זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם immunostaining או מכתים קבוע מתוכנן, perfuse החיה עם 50 מ&quot;ל של paraformaldehyde(PFA; 4% ב PBS) במשך 15 דקות. הערה: שימו לב, אדי PFA רעילים. זלוף של החיה עם PFA צריך להתבצע במנדף מאוורר. </li></ol> 3. בידוד של המוח ואת המעגל ויליס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הראש עם זוג מספריים כירורגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך קו אמצע עם מספרי איריס, לאורך העור מהצוואר אל האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את העור כדי לחשוף את הגולגולת ולהסיר כל שרירי שיורים ורקמות שומן עם איריס מספרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקצה החד של איריס מספריים לתוך מגנום foramen בצד אחד ובזהירות להחליק אותם על פני השטח הפנימי של הגולגולת אל meatus השמיעה החיצונית (הידוע גם בשם תעלת האוזן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את החתך מתואר 3.1.4 בצד הנגדי ולעשות קו אמצע לחתוך לאורך המשטח הפנימי של העצם בין הקודקודית תחילת תפר sagittal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשתול הקשתיתמספרי העצם הפרונטלית, ישר בין העיניים, ב תפר sagittal ולאחר מכן לפתוח אותם לפצל את הגולגולת לשתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את המוח, תופס את נורות חוש הריח באמצעות מספרי איריס לנתק את הקשרים העצבים על פני שטח הגחון שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח ולמקם אותו בצלחת פטרי 60 מ&quot;מ המכיל PBS קר כקרח לבידוד פרה. לחלוטין לטבול את המוח PBS. אם המוח היה קבוע עם PFA 4% (עבור חתך עתידי immunostaining או מכתים רגיל), לשמור אותו באמבט של 4% PFA ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של המעגל ויליס הערה: מיקרוסקופ לנתח נדרש בידוד פרה. המוח צריך להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליך כולו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים את המוח במהופך (כלומר, על פני השטח הגבי שלה) כדי להמחיש את הפרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מלקחיים קטנים לתפוס את עורקי המוחין הקדמיים (ACA) בבסיס של אונות הרחה ( <strאונג&gt; a, איור 1) ולהפעיל לחץ כדי לנתק אותם מרצף הכלי. השתמש באותו ההליך לחתוך את עורקי המוח האמצעיים (MCA) ב ב (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הקצוות החדים של מלקחיים כדי להרים ולהסיר את העורקים הגדולים להרכיב את הפרה מהקורטקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את תחילת עורקי תקשורת האחורית (PCA) לנתק אותם מהמוח, על ידי אחיזת עורקי המוח האמצעיים (MCA) עם המלקחיים. תרים את העורקים הקדמיים (ACA ו MCA) ולמשוך אותם בעדינויות על אופטיים התצלובת בכיוון קדמי-הגבה. כדי למנוע הפרעה של פרה, להפסיק את ההליך להתמודד עם העורקים האחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 3.2.2 ו 3.2.3 עבור העורקים במוח הקטנים המעולים אחוריים (SCA) / (PCA) (ג, איור 1) ו עבור עורק הבסיס (BA) (ד, איור 1), מושכים אותם dorsal- כיוון קדמי. תפסיק בסוף של i ההליך המתוארn 3.2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפרה כולה על ידי משיכת בעדינות עם מלקחיים. מניח את הפרה בצלחת 60 מ&quot;מ פטרי מלא PBS קר כקרח להסיר את כל רקמת מוח מצורפת הנותרים עם שני מלקחיים, מחזיק פרה במקום עם סיכות קטנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הפרה שנקטפו ב -80 ° C לעיבוד שלאחר מכן לטיהור RNA (תשואות מיצוי RNA כמויות גדולות של RNA - כ 500 ng) או מיצוי חלבון. הערה: ניתן לשמור את פרת vivo לשעבר למשך 24 שעות, על ידי התאמת מערכת אמבטית האיבר שפותחה עבור עורק הרחת עכבר מבודד 7. </li></ol></li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig1.jpg" /> איור 1: תרשים סכמטי של צפה גחון של מוח עכבר הדגשה פרה פרה נוצר משני עורקי התרדמה הפנימיים (MCA), אשר נגזרים משני עורקי המוחין הקדמיים (ACA);. basilarעורק (BA) סניפים לתוך האחורי (PCA) מעולה (SCA) עורקים מוחיים, ושני עורקים בחוליות (VA).

<ol><li>Beckmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+cerebrovascular+abnormalities+and+blood+flow+disturbances+in+APP23+mice+modeling+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).</li>
<li>Sadasivan, C., Fiorella, D. J., Woo, H. H., Lieber, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+factors+effecting+cerebral+aneurysm+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Physical factors effecting cerebral aneurysm pathophysiology.</a> Ann Biomed Eng. 41 (7), 1347-1365 (2013).</li>
<li>Ritz, K., Denswil, N., Stam, O., van Lieshout, J., Daemen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cause+and+mechanisms+of+intracranial+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cause and mechanisms of intracranial atherosclerosis.</a> Circulation. 130 (16), 1407-1414 (2014).</li>
<li>Tulamo, R., Frösen, J., Hernesniemi, J., Niemelä, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+changes+in+the+aneurysm+wall%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurointerv+Surg%22%5BJournal%5D)">Inflammatory changes in the aneurysm wall: a review.</a> J Neurointerv Surg. 2 (2), 120-130 (2009).</li>
<li>Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+amyloid+angiopathy%3A+emerging+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Stroke%22%5BJournal%5D)">Cerebral amyloid angiopathy: emerging concepts.</a> J Stroke. 17 (1), 17-30 (2015).</li>
<li>Oy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+atherosclerotic+stroke%3A+specific+focus+on+the+metabolic+syndrome+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Atheroscler+Rep%22%5BJournal%5D)">Intracranial atherosclerotic stroke: specific focus on the metabolic syndrome and inflammation.</a> Curr Atheroscler Rep. 8 (4), 330-336 (2006).</li>
<li>Lee, H. J., Dietrich, H. H., Han, B. H., Zipfel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+ex+vivo+model+for+the+study+of+cerebrovascular+function+utilizing+isolated+mouse+olfactory+artery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Korean+Neurosurg+Soc%22%5BJournal%5D)">Development of an ex vivo model for the study of cerebrovascular function utilizing isolated mouse olfactory artery.</a> J Korean Neurosurg Soc. 57 (1), 1-5 (2015).</li>
<li>Hosaka, K., Downes, D. P., Nowicki, K. W., Hoh, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+murine+intracranial+aneurysm+model%3A+aneurysm+formation+and+rupture+by+elastase+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurointerv+Surg%22%5BJournal%5D)">Modified murine intracranial aneurysm model: aneurysm formation and rupture by elastase and hypertension.</a> J Neurointerv Surg. 6 (6), 474-479 (2013).</li>
<li>Gauthier, S. A., Sahoo, S., Jung, S. S., Levy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cerebrovascular+cells+as+a+cell+culture+model+for+cerebral+amyloid+angiopathy%3A+isolation+of+smooth+muscle+and+endothelial+cells+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Murine cerebrovascular cells as a cell culture model for cerebral amyloid angiopathy: isolation of smooth muscle and endothelial cells from mouse brain.</a> Methods Mol Biol. 849, 261-274 (2012).</li>
<li>Choi, S., Kim, J., Kim, K., Suh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+culture+of+vascular+endothelial+cells+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice.</a> Korean J Physiol Pharmacol. 19 (1), 35-42 (2015).</li>
<li>Peters, D. G., Kassam, A. B., Yonas, H., O'Hare, E. H., Ferrell, R. E., Brufsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transcript+analysis+in+small+quantitiesof+mRNA+by+SAGE-Lite%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transcript analysis in small quantitiesof mRNA by SAGE-Lite.</a> Nucleic Acids Res. 27 (24), (1999).</li>
<li>Badhwar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stanimirovic%2C+Hamel%2C+%26+Haqqani+The+proteome+of+mouse+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Stanimirovic, Hamel, & Haqqani The proteome of mouse cerebral arteries.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (6), 1033-1046 (2014).</li>
<li>Castro, L., Brito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+neurones+have+a+specific+ability+to+respond+to+phasic+dopamine+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Striatal neurones have a specific ability to respond to phasic dopamine release.</a> J Physiol. 591 (13), 3197-3214 (2013).</li>
<li>Hübscher, D., Nikolaev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgenic+mice+expressing+FRET+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of transgenic mice expressing FRET biosensors.</a> Methods Mol Biol. 1294, 117-129 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אנו מתארים כאן פרוטוקול לשחזור עבור הבידוד של המעגל ויליס. הפרעות כלי הדם במוח ביותר הנפוצות הכוללות פרה הם vasculopathies CAA קשור, טרשת עורקים תוך גולגולתי מפרצה תוך-גולגולתי, שכולן משפיע על דפנות כלי דם העורקיים. גורמי הסיכון ידועים, אבל בפתוגנזה המולקולרי של הפרעות המוחין האלו נשאר ממעטים להבין וסמנים ביולוגיים ספציפיים לניבוי להתרחשותם חסרים. יש עניין רב בשיטות לבידוד הפרה מעכברים מהונדסים לקשר תצפיות מקרוסקופית עם שינויים מולקולריים. לדוגמה, על ידי גרימת מפרצת עקבית במודל של...

מעגל עורקי המוח (cerebri arteriosus סירקולוס), הידוע גם בשם מעגל ויליס (פרה), הלולאה של מצולע Willisor וויליס) תואר לראשונה על ידי תומס וויליס 1664. זוהי השקת דם הממוקמת ברחבי האופטי chiasma וההיפותלמוס שיכולה להיחשב כמרכז באספקת הדם למוח ומבנים שמסביב. דם נכנס המבנה הזה דרך התרדמה הפנימית ועורק בחוליות והוא זורם אל מחוץ למעגל באמצעות באמצע הפנים ועורקי מוחות אחוריים. כל אחד העורקים האלה על ימין ועל שמאל סניפים משני צדי המעגל. יעביר basilar, פוסט, ו קדמי תקשורת עורקת לסגור את המעגל (איור 1 ואיור 2). הסיכון של זרימת דם לקויה בכל עורקי היצוא ממוזער על ידי המיזוג של דם הנכנסים למעגל מן התרדמה ועורק מוחות, דבר המבטיח כי דם מספק מסופק בגֶשֶׁם. מבנה זה משמש גם הנתיב העיקרי עבור זרימת הדם בטחונות במחלות occlusive חמורה של עורק התרדמה הפנימי. ישנם מספר סוגים של הפרעות כלי דם במוח יש מוצאם של פרה. הנפוצים ביותר הם angiopathy עמילואיד מוחין (CAA) vasculopathies -associated, טרשת עורקים תוך גולגולתי מפרצת תוך-גולגולתי. 1, 2, 3 הפרעות אלה עשויים להוביל hypoperfusion בשל התרחבות, וכן תוך-מוחי ו / או תת-עכבישי דימומים בסופו של דבר לתרגם שבץ איסכמי או המורגי או , במקרה הטוב, התקף איסכמי חולף. התקדמות בבדיקות אבחנתיות, כולל הדמייה, ואולי בשילוב עם אנגיוגרפיה, הפכה אותו ניתן לאבחן מחלות כלי דם במוח גדולות האלה קליניות, ללא הצורך בביופסית מוח. אף על פי כן, טיפולים יעילים וספציפיים (תרופתיים או endovascular) חסרים כיום ולכן יש צורך להגדיר חדשמטרות מולקולריות. זיהוי מטרות תרופה חדשנית למניעת מחלות אלה בבני אדם ידרוש במודלים של בעלי חיים ודרכי לבודד את כלי הדם Cerebro כולל פרה. מודלים כאלה צריכים לספק ראיות ורמזים על השינויים הספציפיים, כוללים שינויים דלקתיים, המתרחשים קירות הכלי הגדול במודלים של בעלי חיים של מפרצת עורקים תוך גולגולתי, CAA או טרשת עורקים תוך גולגולתי. 4, 5, 6 הקמנו שיטה לבידוד העכבר פרה כדי להקל מחקרים של דלקת בכלי במחלת האלצהיימר (AD) ומחלות הקשורות, כגון CAA. שיטה זו לבידוד פרה עכבר פותחתה עבור ההערכה של ביטוי גני כלי דם במוח דלקתי במהלך התקדמות מחלה. יחד עם זיהוי של בתצהיר עמילואיד בטא בתוך דפנות העורקים leptomeningeal ו pial, שיטה זו יכולה להקל להרתיעשלי הקשר האפשרי בין ביטוי גנים דלקתיים בקיר Cerebro-כלי הדם וצבירת Aβ-פפטיד. רשת כלי הדם של המוח, כולל leptomeningeal ו pial במרחב תת-עכבישי, הוא הרחבה של העורקים הגדולים ויוצרים מעגל ויליס. השיטה המתוארת כאן יכולה לשמש כדי לבודד את הפרה של כל שושלת עכבר יכולה לשמש לכל סוגי הקרנה (למשל, ביטוי גנים, ייצור חלבונים ושינויי חלבון posttranslational) על הכלי הגדול של כלי הדם-Cerebro עכבר.

<table><tbody><tr><td>דולבקו s פוספט חוצץ מלח</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>מספריים איריס עדין מוקשה&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>מספריים - ישר / חד / חד&nbsp; &nbsp; 16.5 ס"מ</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>דומונט #7b מלקחיים&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ זום סטריאוסקופי</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>CellBIND משטח 60 מ"מ צלחת תרבות</td><td>קורנינג</td><td>#3295</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית - MINIPULS 3</td><td>Gilson</td><td>M312</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodique</td><td>Ceva Sant&eacute; אנימל</td><td>FR/V/2770465 3/1992</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול בידוד לחוג עכבר של וויליס

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

מעגל עורקי המוח (cerebri arteriosus סירקולוס) או המעגל ויליס (פרה) הוא השקת דם המקיפה את ראיית chiasma וההיפותלמוס המספק דם למוח והמבנים שמסביב. זה היה מעורב בכמה הפרעות כלי דם במוח, כולל angiopathy עמילואיד מוחין (CAA) vasculopathies -associated, טרשת עורקים תוך גולגולתי מפרצת תוך-גולגולתי. מחקרים של המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות אלו לזיהוי מטרות תרופה חדשניות למניעה שלהם דורשים במודלים של בעלי חיים. חלק מן המודלים האלה עשויים להיות מהונדס, ואילו אחרים יהיו כרוכים בידוד של כלי הדם-Cerebro, כולל שיטת CoW.The המתוארת כאן מתאים בידוד פרה בכל שושלת עכבר ויש לו פוטנציאל רב הקרנה (ביטוי של גנים, ייצור חלבונים, שינויי חלבון posttranslational, ניתוח secretome, וכו &#39;) מחקרים על הכלי הגדול של העכבר cerebro-כלי דם. זה יכול לשמש גם עבור מחקרי vivo לשעבר, על ידי התאמת מערכת אמבטית האיבר שפותחה עבור עורקי הרחת עכבר מבודדים.

<html> העכבר PBS-perfused נהרג והפרה מבודדת כמפורט בסעיף 3.2 של הפרוטוקול. כאשר לנתיחה מבוצעת כהלכה, פרה צריך לצאת בחתיכה אחת צריך להיות שקוף מעט בשל היעדר הדם שיורית בכלי הדם. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig2.jpg" /> איור 2: פרה העכבר לאחר בידוד. (א) סקירה של הפרה בצלחת 10 ס&quot;מ פטרי...

אנו מתארים כאן פרוטוקול הניתן לשחזור לבידוד מעגל העכבר של וויליס.

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

המטרה הכללית של הליך הניתוח זה היא לבודד את מעגל ויליס (circle of Willis) של העכבר כדי להקל על חקר כלי הדם הגדולים של מערכת כלי הדם המוחית בעכבר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במחקר של ביטוי גנים בכלי הדם המוחים במחלות שונות המשפיעות על כלי דם מוחיים, כגון מחלת אלצהיימר ואנגיופתיה עמילואידית מוחית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד את כלי הדם הגדולים במהירות ובקלות מבלי לשנות את מבנה כלי הדם.התחילו בביצוע חתך באורך ארבעה סנטימטרים בדופן הבטן ובפריטונאום של עכבר המורדם במינון קטלני, ממש מתחת לכלוב הצלעות, באמצעות מספרי איריס. לאחר מכן, בצעו חתך של מספר מילימטרים בסרעפת, והמשיכו בחתך לאורך כל כלוב הצלעות כדי לחשוף את חלל הפלאורה. הרימו את גרם השטרנום וסגרו את הקצה באמצעות המוסטט, כאשר ההמוסטט נשען על הצוואר.לאחר מכן, גזרו בזהירות את הרקמה השומנית המחברת את עצם החזה ללב. כעת, העבירו מחט perfusion בכילוי 15 דרך החדר השמאלי אל קודקוד הלב, והשתמשו במספריים כדי לחתוך את אחת מאוני הלבד כדי ליצור מוצא לנוזל הפרפוזיה. בצעו פרפוזיה לבעל החיים עם 25 עד 50 milliliters של PBS בקצב שאיבה של 2.5 milliliters לדקה למשך כעשר דקות.הכבד אמור להבהיר ככל שהדם מוחלף ב-PBS. כאשר הנוזל מהכבד שקוף לחלוטין, יש להפסיק את הפרפוזיה. כדי לבודד את המוח, השתמש במספרי איריס כדי לבצע חתך בקו האמצע לאורך העור מהצוואר ועד לאף.גזרו את העור באמצעות מספרי Iris כדי לחשוף את הגולגולת ולהסיר שאריות של רקמת שריר ורקמת שומן. לאחר מכן, הכניסו את קצות מספרי ה-Iris לצד אחד של ה-foramen magnum והחליקו בזהירות את הקצוות לאורך פני השטח הפנימיים של הגולגולת עד ל-external auditory meatus. בצעו חתך דומה בצד השני של ה-foramen magnum, ולאחריו חתך בקו האמצע לאורך פני השטח הפנימיים של ה-interparietal bone עד לתחילת ה-sagittal suture.החדירו את מספרי האיריס סגורים לעצם המצח בין העיניים בתפר הסגיטלי, ופתחו את הלהבים כדי לפלוט את הגולגולת לשניים. בעזרת פינצטה, תפסו את הפקעות הריח והשתמשו במספרי האיריס כדי לחתוך את קשרי העצבים במשטח הגבוני של המוח. לאחר מכן, טבלו את המוח בצלחת פטרי בנייד של 60 מילימטר עם PBS קר מאוד.כדי לבודד את מעגל ויליס (circle of Willis), העבירו את הצלחת על גבי קרח תחת מיקרוסקופ דיסקציה והפכו את המוח על פניו הגביים (dorsal surface) כדי להנמיך את מעגל ויליס. השתמשו בפינצטה קטנה כדי לתפוס את העורקים המוחים הקדמיים בבסיס האונות הריחיות, והפעילו לחץ כדי להפריד את העורקים מרצף כלי הדם. חתכו את העורקים המוחים האמצעיים באופן דומה.לאחר מכן, השתמשו בקצוות החדים של הפינצטה כדי לתפוס את העורקים המוחים האמצעיים (middle cerebral arteries) ולהרים את תחילת העורקים התקשריים האחוריים (posterior communicating arteries), תוך ניתוק של שני סטים של עורקים מהמוח. לאחר מכן, הרימו את העורקים הקדמיים, תוך משיכה עדינה שלהם מעל הצלב האופטי (optic chiasm) לכיוון גבי-קדמי. הסירו את העורקים התת-מוחיים העליונים והאחוריים באותו אופן, ולאחריהם הזיזו את העורק הבזילרי (basilar artery).לבסוף, השתמשו בפינצטה כדי להעביר בעדינות את כל מעגל ויליס (circle of Willis) לתוך צלחת פטרי של 60 מילימטר המכילה PBS קר בקרח, וקבעו את כלי הדם במקומם באמצעות סיכות קטנות, תוך שימוש בשתי פינצטות כדי להסיר בזהירות את שאריות רקמת המוח. מעגל ויליס צריך להוציא כחתיכה אחת, והוא צריך להיות שקוף מעט בשל היעדר דם שירי במערכת כלי הדם. מעגל ויליס נקי אמור לבטא באופן ספציפי סממנים של תאי שריר חלק כליים, כגון Smooth Muscle Actin, Smooth Muscle-Myosin Heavy Chain ו-Smoothelin.לעומת זאת, סממנים נוירונליים, כגון myelin oligodendrocyte glycoprotein או microtubule-associated protein 2, צריכים להיות בקושי ניתנים לגילוי במעגל ויליס (circle of Willis). יתרה מכך, הביטוי של הסמן האנדותליילי, E-Selectin, ברקמה עצבית שאינה חלק ממעגל ויליס, דומה מאוד לזה שהתקבל בדגימות של מעגל ויליס, מה שעשוי לשקף את קיומה של רשת נימים מוחית. לאחר השליטה בשיטה, ניתן להשלימה תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי כלי הדם המBחיים של העכבר הם דקים מאוד ונשברים בקלות. לכן, יש לבצע את הניתוח בזהירות רבה ובמתינות, כדי להבטיח שהמבנה כולו יוצא כיחידה אחת. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים בתחום מחלות עצביות דלקתיות לבחון הפרעות בכלי דם מוחיים במודל עכברים של מחלת אלצהיימר ומחלות קשורות, כגון cerebral amyloid angiopathy.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד לבודד את מעגל ויליס (circle of Willis) מעכבר.

protocol-for-isolating-the-mouse-circle-of-willis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים את הליך בידוד תאי מערכת החיסון מקלעת כורואידים של עכברים. הליך זה משמש במחקר נוירואימונולוגיה כדי להבין כיצד תאי מערכת החיסון במקלעת הכורואידים משפיעים על בריאות המוח ומחלות נוירולוגיות שונות.

בידוד תאי מערכת החיסון מקלעת כורואידים של עכבר

אנחנו מציגים את שיטה כירורגית כדי לגרום לאיסכמיה / reperfusion הניסיוני (I / R) פציעה כדי לדמות אוטם שריר הלב (MI) בעכברי מודל, המאפשר ליותר בהירות במיצוב של קשירה בעורק השמאלי הקדמי יורד (LAD) כדי להגדיל את שחזור ניסויים MI בעכברים.

דגם של שריר הלב איסכמיה reperfusion הפגיעה Murine באמצעות קשירת של העורק השמאלי קדמי יורד

דלקת ממלאת תפקיד מרכזי בפתוגנזה של שבץ איסכמי. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהוא פועל כחרב פיפיות המחמירה פגיעה מוחית מוקדמת, אך גם תורמת לתיקון מאוחר יותר. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי חיסון מהמוח האיסכמי ואת הפנוטיפ הציטומטרי הזרימה שלהם לאחר מכן.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את טכניקות בידוד וההתרבות של תאי שריר חלק בכלי דם בעכברים עיקריים (VSMCs) מהמחזור כלילית. לאחר VSMCs בודד, הם יכולים לשמש עבור טכניקות תרבות סטנדרטיות רבות.

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

נוהל להכנת ההכנות הפנים של העורק הראשי עורקים אבי העורקים מתואר. הכנות כאלה, כאשר מוכתמים immunofluorescently עם נוגדנים ספציפיים, מאפשרים לנו ללמוד לוקליזציה של חלבונים זיהוי של סוגי תאים בתוך הקיר כולו כלי הדם על ידי מיקרוסקופיה confocal.

הכנת פנים של כלי דם עכבר

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של העכבר הראשי בריא ופונקציונליים hepatocytes פרוטוקול. הוראות לגילוי סינתזה של חלבון nascent הכבד על ידי המצע תיוג לא רדיואקטיבי נמסרו כדי לעזור להבין את המנגנונים שבבסיס סינתזת החלבון בהקשר של הומאוסטזיס אנרגיה-מטבוליזם בכבד.

בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes לניתוח סינתזת חלבון Nascent בשיטה תיוג L שאינו רדיואקטיבי-azidohomoalanine

מוצג כאן פרוטוקול לבידוד והגברה של חיידקים אנאירוביים אירוביים ופקולטטיביים של עכבר אנאירובי באמצעות ספוגית עיניים ייחודית וצעד העשרה מבוסס תרבות עם זיהוי עוקב על ידי שיטות מבוססות מיקרוביולוגיות וספקטרומטריית מסה MALDI-TOF.

בידוד וזיהוי הלחמית בעכברים

תקן הזהב בקרדיולוגיה לניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים הוא קרדיומיוציטים. מאמר זה מתאר התאמות לטכניקה שאינה לנגנדורף לבידוד קרדיומיוציטים של עכברים.

שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

כאן אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול לבידוד תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד עכבר (LSEC). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן בכבד, טיהור תאים לא-פרנצ'ימליים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ובחירת חרוזים מגנטיים CD146. אנו גם מנצלים את הפנוטיפ ומאפיינים את ה-LSECs המבודדים הללו באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל מורין מנימי לימפה עוריים. תאי האנדותל הלימפטיים המבודדים יכולים לשמש לניסויים במבחנה במורד הזרם ולניתוח ביטוי חלבונים.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

למדו פרוטוקול לבידוד לחוג עכבר של וויליס במודל עכברי לחקר מחלות מוח כגון אלצהיימר. שיטה זו מאפשרת בידוד מהיר של כלי דם גדולים מבלי לשנות את מבנהם.

פרוטוקול בידוד לחוג עכבר של וויליס

גלה סרטונים נוספים