פרוטוקול בידוד לחוג עכבר של וויליס

המטרה הכוללת של הליך דיסקציה זה היא לבודד את מעגל העכברים של וויליס כדי להקל על חקר כלי הדם הגדולים של כלי הדם המוחיים של העכבר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר ביטוי גנים במוח במחלות שונות המשפיעות על כלי המוח כגון מחלת אלצהיימר ואנגיופתיה אמלואידית מוחית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד את הכלים הגדולים במהירות ובקלות מבלי לשנות את מבנה הכלי.

התחל בשימוש במספריים לקשתית כדי לבצע חתך באורך ארבעה סנטימטרים בדופן הבטן והצפק של עכבר מורדם קטלני ממש מתחת לכלוב הצלעות. לאחר מכן, בצע חתך באורך של כמה מילימטרים בסרעפת, והמשיך את החתך לכל אורך כלוב הצלעות כדי לחשוף את חלל הצדר. הרם את עצם החזה והדק את הקצה בעזרת המוסטט, והניח את המוסטט על הצוואר.

לאחר מכן חתוך בזהירות את רקמת השומן המחברת את עצם החזה ללב. כעת העבירו מחט שפע בגודל 15 דרך החדר השמאלי לקודקוד הלב, והשתמשו במספריים כדי לחתוך את אחת מאונות הכבד כדי ליצור מוצא לפרפוזה. החדרת החיה עם 25 עד 50 מיליליטר PBS בקצב משאבה של 2.5 מיליליטר לדקה למשך כעשר דקות.

הכבד אמור להלבין כאשר הדם מוחלף ב-PBS. כאשר הנוזל מהכבד צלול לחלוטין, הפסק את הזלוף. כדי לבודד את המוח, השתמש במספריים לקשתית כדי לבצע חתך בקו האמצע לאורך העור מהצוואר ועד האף.

חתוך את העור בעזרת מספרי הקשתית כדי לחשוף את הגולגולת ולהסיר שאריות שריר ורקמת שומן. לאחר מכן, הנח את קצות המספריים של הקשתית בצד אחד של הפורמן מגנום והחלק בזהירות את הקצוות לאורך המשטח הפנימי של הגולגולת אל הבשר השמיעתי החיצוני. בצע חתך דומה בצד השני של מגנום הנקב, ואחריו חתך קו אמצע לאורך המשטח הפנימי של העצם הבין-קודקודית עד לתחילת התפר הסגיטלי.

שתלו את מספרי הקשתית הסגורים בעצם הקדמית בין העיניים בתפר הסגיטלי, ופתחו את הלהבים כדי לפצל את הגולגולת לשניים. בעזרת מלקחיים, תפסו את נורות הריח והשתמשו במספריים של הקשתית כדי לנתק את הקשרים העצביים על פני הגחון של המוח. לאחר מכן טבלו את המוח בצלחת פטרי בגודל 60 מילימטר של PBS קר כקרח.

כדי לבודד את העיגול של וויליס, העבירו את הצלחת לשקית קרח תחת מיקרוסקופ מנתח וסובבו את המוח על פני השטח הגביים שלו כדי לדמיין את העיגול של וויליס. השתמש במלקחיים הקטנים כדי לתפוס את עורקי המוח הקדמיים בבסיס אונות הריח, ולהפעיל לחץ כדי לנתק את העורקים מרצף כלי הדם. חותכים את עורקי המוח האמצעיים באותו אופן.

לאחר מכן השתמש בקצוות החדים של המלקחיים כדי לתפוס את עורקי המוח האמצעיים ולהרים את תחילת עורקי התקשורת האחוריים, תוך ניתוק שתי קבוצות העורקים מהמוח. לאחר מכן, הרם את העורקים הקדמיים, ומשוך אותם בעדינות מעל הכיאזמה האופטית בכיוון הגב הקדמי. הסר את עורקי המוח העליון והאחורי באותו אופן, ואחריו תזוזה של העורק הבסיסי.

לבסוף, השתמשו במלקחיים כדי להעביר בעדינות את כל המעגל של וויליס לצלחת פטרי בגודל 60 מילימטר המכילה PBS קר כקרח, וקבעו את כלי הדם במקומם בעזרת סיכות קטנות, באמצעות שני מלקחיים כדי להסיר בזהירות את כל רקמת המוח שנותרה. עיגול וויליס צריך לצאת בחתיכה אחת, וצריך להיות שקוף מעט בגלל היעדר שאריות דם בכלי הדם. המעגל הנקי של וויליס צריך לבטא באופן ספציפי סמני תאי שריר חלק בכלי הדם, כגון אקטין שריר חלק, שרשרת כבדה של שריר חלק-מיוזין וחלק.

סמנים עצביים, כגון גליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים, או חלבון 2 הקשור למיקרו-צינוריות, לעומת זאת, אמורים להיות ניתנים לזיהוי רק בקושי במעגל וויליס. יתר על כן, הביטוי של סמן האנדותל, E-Selectin, ברקמה עצבית שאינה מעגל של וויליס, דומה מאוד לזה המתקבל עבור דגימות מעגל וויליס, מה שמשקף אולי את קיומה של רשת נימית מוחית. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שכלי המוח של העכבר עדינים מאוד ונשברים בקלות. לפיכך, יש לבצע את הדיסקציה בזהירות רבה, מבלי למהר, כדי להבטיח שהמבנה כולו נקצר בחתיכה אחת. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום מחלות עצביות דלקתיות לחקור הפרעות כלי דם במוח במודל עכברי של אלצהיימר ומחלות קשורות כגון אנגיופתיה עמילואידית מוחית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד את מעגל וויליס מעכבר.