פרוטוקול בידוד לחוג עכבר של וויליס
22 באוקטובר 2016
אנו מתארים כאן פרוטוקול הניתן לשחזור לבידוד מעגל העכבר של וויליס.
המטרה הכוללת של הליך דיסקציה זה היא לבודד את מעגל העכברים של וויליס כדי להקל על חקר כלי הדם הגדולים של כלי הדם המוחיים של העכבר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר ביטוי גנים במוח במחלות שונות המשפיעות על כלי המוח כגון מחלת אלצהיימר ואנגיופתיה אמלואידית מוחית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד את הכלים הגדולים במהירות ובקלות מבלי לשנות את מבנה הכלי.
התחל בשימוש במספריים לקשתית כדי לבצע חתך באורך ארבעה סנטימטרים בדופן הבטן והצפק של עכבר מורדם קטלני ממש מתחת לכלוב הצלעות. לאחר מכן, בצע חתך באורך של כמה מילימטרים בסרעפת, והמשיך את החתך לכל אורך כלוב הצלעות כדי לחשוף את חלל הצדר. הרם את עצם החזה והדק את הקצה בעזרת המוסטט, והניח את המוסטט על הצוואר.
לאחר מכן חתוך בזהירות את רקמת השומן המחברת את עצם החזה ללב. כעת העבירו מחט שפע בגודל 15 דרך החדר השמאלי לקודקוד הלב, והשתמשו במספריים כדי לחתוך את אחת מאונות הכבד כדי ליצור מוצא לפרפוזה. החדרת החיה עם 25 עד 50 מיליליטר PBS בקצב משאבה של 2.5 מיליליטר לדקה למשך כעשר דקות.
הכבד אמור להלבין כאשר הדם מוחלף ב-PBS. כאשר הנוזל מהכבד צלול לחלוטין, הפסק את הזלוף. כדי לבודד את המוח, השתמש במספריים לקשתית כדי לבצע חתך בקו האמצע לאורך העור מהצוואר ועד האף.
חתוך את העור בעזרת מספרי הקשתית כדי לחשוף את הגולגולת ולהסיר שאריות שריר ורקמת שומן. לאחר מכן, הנח את קצות המספריים של הקשתית בצד אחד של הפורמן מגנום והחלק בזהירות את הקצוות לאורך המשטח הפנימי של הגולגולת אל הבשר השמיעתי החיצוני. בצע חתך דומה בצד השני של מגנום הנקב, ואחריו חתך קו אמצע לאורך המשטח הפנימי של העצם הבין-קודקודית עד לתחילת התפר הסגיטלי.
שתלו את מספרי הקשתית הסגורים בעצם הקדמית בין העיניים בתפר הסגיטלי, ופתחו את הלהבים כדי לפצל את הגולגולת לשניים. בעזרת מלקחיים, תפסו את נורות הריח והשתמשו במספריים של הקשתית כדי לנתק את הקשרים העצביים על פני הגחון של המוח. לאחר מכן טבלו את המוח בצלחת פטרי בגודל 60 מילימטר של PBS קר כקרח.
כדי לבודד את העיגול של וויליס, העבירו את הצלחת לשקית קרח תחת מיקרוסקופ מנתח וסובבו את המוח על פני השטח הגביים שלו כדי לדמיין את העיגול של וויליס. השתמש במלקחיים הקטנים כדי לתפוס את עורקי המוח הקדמיים בבסיס אונות הריח, ולהפעיל לחץ כדי לנתק את העורקים מרצף כלי הדם. חותכים את עורקי המוח האמצעיים באותו אופן.
לאחר מכן השתמש בקצוות החדים של המלקחיים כדי לתפוס את עורקי המוח האמצעיים ולהרים את תחילת עורקי התקשורת האחוריים, תוך ניתוק שתי קבוצות העורקים מהמוח. לאחר מכן, הרם את העורקים הקדמיים, ומשוך אותם בעדינות מעל הכיאזמה האופטית בכיוון הגב הקדמי. הסר את עורקי המוח העליון והאחורי באותו אופן, ואחריו תזוזה של העורק הבסיסי.
לבסוף, השתמשו במלקחיים כדי להעביר בעדינות את כל המעגל של וויליס לצלחת פטרי בגודל 60 מילימטר המכילה PBS קר כקרח, וקבעו את כלי הדם במקומם בעזרת סיכות קטנות, באמצעות שני מלקחיים כדי להסיר בזהירות את כל רקמת המוח שנותרה. עיגול וויליס צריך לצאת בחתיכה אחת, וצריך להיות שקוף מעט בגלל היעדר שאריות דם בכלי הדם. המעגל הנקי של וויליס צריך לבטא באופן ספציפי סמני תאי שריר חלק בכלי הדם, כגון אקטין שריר חלק, שרשרת כבדה של שריר חלק-מיוזין וחלק.
סמנים עצביים, כגון גליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים, או חלבון 2 הקשור למיקרו-צינוריות, לעומת זאת, אמורים להיות ניתנים לזיהוי רק בקושי במעגל וויליס. יתר על כן, הביטוי של סמן האנדותל, E-Selectin, ברקמה עצבית שאינה מעגל של וויליס, דומה מאוד לזה המתקבל עבור דגימות מעגל וויליס, מה שמשקף אולי את קיומה של רשת נימית מוחית. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שכלי המוח של העכבר עדינים מאוד ונשברים בקלות. לפיכך, יש לבצע את הדיסקציה בזהירות רבה, מבלי למהר, כדי להבטיח שהמבנה כולו נקצר בחתיכה אחת. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום מחלות עצביות דלקתיות לחקור הפרעות כלי דם במוח במודל עכברי של אלצהיימר ומחלות קשורות כגון אנגיופתיה עמילואידית מוחית.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד את מעגל וויליס מעכבר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול הדיר שניתן לשחזור לבידוד של מעגל ויליס (circle of Willis) בעכבר, אשר חיוני לחקר כלי הדם המוחיים. השיטה מאפשרת בידוד מהיר וקל של כלי דם גדולים מבלי לשנות את מבנהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מחקר תרוומי מוחי
- מודלים של עכברים
רקע
- מעגל ויליס הוא מבנה קריטי במערכת כלי הדם המוחיים של העכבר.
- הבנת הביטוי הגנטי בכלי הדם המוחיים חיונית לחקר מחלות כמו אלצהיימר.
- בידוד של כלי דם גדולים יכול לספק תובנות לגבי בריאות כלי הדם המוחיים.
- טכניקה זו משפרת את היכולת לבחון את השפעותיהן של מחלות שונות על כלי דם מוחיים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לבידוד של מעגל ויליס בעכברים.
- הקלה על מחקר של ביטוי גנים בכלי דם מוחיים.
- שיפור ההבנה של מחלות המשפיעות על כלי דם מוחיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיסקציה של דופן הבטן ושל הפריטונאום באמצעות מספרי איריס.
- חתך בסרעפת לחשיפת החלל הפלאורלי.
- מהדקי sternum לצורך גישה למעגל ויליס.
- שמירה על מבנה כלי הדם במהלך הבידוד.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מאפשר בידוד יעיל של מעגל ויליס (circle of Willis).
- ניתן לחקור כלי דם גדולים ללא שינוי מבני.
- ניתן ליישם שיטה זו במגוון מחקרי כלי דם מוחיים.
- השיטה מקלה על מחקר של ביטוי גנים הקשור למחלות כלי דם מוחיים.
מסקנות
- הפרוטוקול המתואר הוא יעיל וניתן לשחזור.
- הוא מספק כלי בעל ערך לחוקרים הלומדים בריאות צרבורית (cerebrovascular health).
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בשיטה זו כדי לחקור מנגנוני מחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד של מעגל ויליס (circle of Willis) בעכבר מאפשר מחקר ישיר של ביטוי גנים קרברו-וסקולרי במודלים של מחלות, ובכך תומך בתיקוף של מטרות לטיפול בהפרעות נוירודגנרטיביות וכלי דם. שיטת הדיסקציה הזו מספקת מקור הניתן לשחזור של כלי דם גדולים עבור סריקה מולקולרית, מה שמקל על גילוי מוקדם של סמנים ביולוגיים ותובנות מכניסטיות. באמצעות שימור המבנה הווסקולרי, היא מגבירה את הביטחון החזוי בהפחתת סיכונים של מטרות פרה-קליניות עבור מחלת אלצהיימר ואנגיופתיה עמילואידית מוחית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של סממנים של שריר חלק כלי דם ותאי אנדותל ברקמה צרברו-וסקולרית הרלוונטית למחלה.
- ערך תפעולי: מספק מערכת ביולוגית עקבית להערכת מעורבות המטרה (target engagement) ו modulates של מסלולים.
- ערך ניבוי: תומך בבדיקת היפותזות של שינויים בביטוי גנים הקשורים למודלים של מחלת אלצהיימר ואנגיופתיה עמיליטואידית מוחית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מאפשר ניתוח כמותי של ביטוי חלבונים, מודיפיקציות לאחר תרגום ופרופילי סקרטום מכלי דם מבודדים.
- ערך תפעולי: מייצרת הכנות רקמה סטנדרטיות המתאימות לבדיקות מולטיפלקס ולסריקת סמנים ביולוגיים.
- מוכנות הבדיקה: מאפשרת הכנה ניתנת להרחבה (scalable) של דגימות תסמיכיות מוחיות עבור זרימות עבודה של סריקה בעלת תוכן גבוה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב זיהוי המטרות הווסקולריות בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני במודלים של מחלות בעכברים.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מבהיר את התרומה של כלי הדם במוח לניוון עצבי, ובכך מפחית את העמימות בבחירת המטרה.
- רלוונטיות למחלה: מדמה באופן ישיר פתולוגיות צרברו-ווסקולריות אנושיות, כולל עמילואידוזיס של כלי דם מוחיים (cerebral amyloid angiopathy) ואתרוסקלרוזיס.
שילוב זרימת עבודה ותהליכי עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי על ידי אספקת רקמה צרברו-וסקולרית מבודדת לצורך תיקוף מטרות, פיתוח בדיקות וסריקה מכניסטית לפני זיהוי מובילים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בחקירה מונחית-השערות של ביטוי גנים בכלי הדם המוחיים במודלים של מחלות.
- סריקה: מספקת דגימות כלי דם הניתנות לשחזור עבור פרופיל ביטוי של סמנים ביולוגיים ומטרות.
- אנליזה: מאפשרת קריאות כמותיות כגון Western blot, אימנופלואורסצנציה ו-ELISA עבור מטרות ספציפיות לכלי דם.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ממצאים מולקולריים בכלי דם מבודדים לתהליכים פתופיזיולוגיים במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: קובעת פרוטוקול נתיחה בר-שימוש עבור תיקוף מטרות בכלי דם מוחיים לאורך פרויקטים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי מתן אפשרות לניתוח ישיר של רקמה צרברו-וסקולרית הרלוונטית למחלה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות וסטנדרטיזציה בבידוד כלי דם בין מעבדות ומחקרים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) על ידי הפחתת אי-ודאות ביולוגית בבחירת מטרה צרברו-וסקולרית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מטרות מותאם-סיכון, בהתבסס על ביטוי וסקולרי ורלוונטיות של המסלול.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בנתיחת עכברים ובאנטומיה של כלי הדם המוחיים תחת מיקרוסקופ.
- תלוי בציוד פרפוזיה, מספרי איריס (Iris), פינצטות ו-PBS קר לשימור כלי הדם.
- מחייב סטנדרטיזציה של תזמון וטכניקת הנתיחה כדי להבטיח את השלמות המבנית.
- חובה להתחשב בשונות ביולוגית בגודל כלי הדם ובענפיהם בין זני עכברים ובגילאים שונים.
- מוגבל לאנליזה מולקולרית בנקודת הסיום; אינו מתאים לבדיקות דימיון תפקודיות בזמן אמת או לצילומי חיים.
