רקמות קרינה הופעלו מיון תאים (FACS) וניתוח ביטוי גנים של נוירונים Fos להביע מ טרי קפוא מוח החולדה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתק נוירונים המבטאים Fos מרקמת מוח של חולדה בוגרת טרייה או קפואה לצורך מיון תאים מופעל פלואורסצנטי לאחר מכן, או FACS. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבודד תאים עצביים מעניינים לזיהוי ההתאמה הנוירולוגית הייחודית של נוירונים מופעלים התנהגותיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת שימוש ברקמות קפואות, מה שמקל על בידוד תאים מאזורי מוח מרובים בימים שונים.

כדי לעבד את רקמת המוח הטרייה הזו, הכניסו שני סכיני גילוח או יותר לתוך החריצים של מטריצת חיתוך מוח קרה כקרח כדי לחתוך פרוסות קורונליות של מילימטר עד שניים המכילות את אזורי המוח המעניינים, והניחו את החלקים על צלחת זכוכית צוננת בזמן החיתוך. ראשית, נתחו את אזור העניין במוח, השליכו את האזורים האחרים והסירו את החומר הלבן. כדי להקפיא את הרקמה, העבירו את הדגימות למיקרו-צינור, וטבלו את הצינור באיזופנטן שלילי של 40 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות לאחסון ב-80 מעלות צלזיוס שליליות עד לעיבוד נוסף.

כדי לטחון את הרקמה, אפשר לדגימות להפשיר על צלחת זכוכית קרה לא יותר מדקה אחת לפני כיסוי הדגימות בטיפה אחת עד שתיים של תמיסת Buffer A. לאחר מכן, אוחזים בסכין גילוח אנכי לחלוטין לצלחת, טוחנים את הרקמה 100 פעמים בכל כיוון אורתוגונלי. כדי לטחון היטב את הרקמה, חשוב לשמור על הרקמה רטובה עם Buffer A ולעקוב אחר זמני הטחינה והכיוון שצוינו.

זה קריטי להסיר את רוב החומר הלבן במהלך דיסקציה של הרקמה ולשמור על הרקמה מכוסה במאגר A כדי לשפר את יעילות הטחינה ולשמור על בריאות התאים. לאחר עיבוד יסודי של הרקמה, השתמשו בסכין הגילוח כדי להעביר את החלקים לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל מיליליטר אחד של Buffer A קר, והפכו את הצינור שלוש עד חמש פעמים כדי להטביע את כל הרקמה הטחונה בתמיסה. כדי לפרק את שברי הרקמה לתרחיף תא בודד, גלולה את הדגימות על ידי צנטריפוגה.

השליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסיפו לאט מיליליטר אחד של תמיסת אנזים קרה ומופשרת טרייה במורד הדופן הפנימית של המיקרו-צינור. והשתמש בפיפטה בקוטר קצה גדול כדי לשאוב מיד ולהוציא את כל הכדור ארבע פעמים כדי לפזר את חתיכות הרקמה הטחונה.

לאחר מכן, הפוך במהירות את המיקרו-צינור כדי למנוע מהכדורים להידבק לתחתית הצינור, ודגר את הדגימה בערבוב מקצה לקצה למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף העיכול, צנטריפוגה שוב את הצינור, והוסף 0.6 מיליליטר של מאגר קר A לתאים. בעזרת אותו קצה פיפטה, שאפו מיד והוציאו את הכדורים חמש פעמים.

לאחר מכן, בחר פיפטת זכוכית בגודל 1.3 מילימטר, והשתמש בה כדי לשבש בעדינות את הדגימות 10 פעמים. הניחו את הדגימה על קרח למשך שתי דקות כדי לאפשר לפסולת ולתאים הלא מנותקים להתיישב לתחתית הצינור. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 15 מיליליטר.

לאחר מכן, הוסף 600 מיקרוליטר של תמיסת Buffer A לגלולה הנותרת, והשתמש בפיפטה בקוטר 0.8 מילימטר כדי לשבש את הדגימה 10 פעמים נוספות. לאחר שאפשרו לרקמות להתייצב כפי שהודגם זה עתה, אספו את הסופרנטנט עם תרחיף התא הראשון, והוסיפו עוד 600 מיקרוליטר של חיץ לגלולה. לאחר מכן, השתמש בפיפטה של 0.4 מילימטר כדי לשלש את הדגימה, והנח את הצינור על קרח למשך שתי דקות כדי לאפשר לרקמות להתייצב.

ביצוע שלבי הטריטורציה המכניים בפרוטוקול חשוב למיון מוצלח. לאחר מכן, אסוף את הסופרנטנט עם התאים המנותקים. לאחר מכן, הוסף 600 מיקרוליטר של מאגר A לדגימה, וחזור על טריטורציה של פיפטה של 0.4 מילימטר שלוש פעמים נוספות.

הניחו את הצינורות על קרח למשך שתי דקות כדי לאפשר לתאים להתייצב. ואז, אסוף את הסופרנטנט בשפופרת שנייה של 15 מיליליטר. חזור על תהליך הטריטורציה שלוש פעמים נוספות, באמצעות פיפטת הזכוכית הקטנה ביותר, מגדיל משמעותית את תפוקת התאים למיון שלאחר מכן.

לאחר איסוף כל הסופרנטנטים, הוסיפו 800 מיקרוליטר של 20 מעלות צלזיוס 100% אתנול לארבעה מירוקים על קרח. לאחר מכן, העבירו 800 מיקרוליטר של תאים מהצינור הראשון של הסופרנטנט שנאסף לכל אחד משני הצינורות הראשונים של אתנול ו-800 מיקרוליטר של תאים מהצינור השני של הסופרנטנט לכל אחד משני הצינורות האחרונים של אתנול. הפוך את הצינורות כדי לערבב את הדגימות.

לאחר מכן, הניחו את הדגימות על קרח למשך 15 דקות, עם ערבוב על ידי היפוך כל חמש דקות. בתום הדגירה יש לצנטריפוגה את התאים. לאחר מכן, תוך נגיעה רק בדופן המיקרו-צינורית, השתמשו במיקרופיפטה כדי להסיר לאט את כל 50 המיקרוליטרים האחרונים של כל סופרנטנט.

סנן כל אחד משני מתלי התאים בנפרד באמצעות שני זוגות שונים של מסנני תאים. לאחר מכן התאים מוכנים לתיוג עם נוגדנים כנגד סמני התאים המעניינים ומיון לפי ציטומטריית זרימה. ניתוח דגימות רקמת מוח טריות וקפואות מגלה נוכחות של אוכלוסיות הומוגניות קטנות של תאים עצביים בעלי גודל וגרגיריות דומים.

ניתן לגדר את האוכלוסיות ההומוגניות הקטנות כדי לא לכלול כל אגרגט תאים, וניתן לזהות את הנוירונים על ידי חיובי NeuN ו-DAPI שלהם. בדגימות רקמה טריות וקפואות, רמות ה-mRNA של NeuN גבוהות משמעותית גם באוכלוסיות החיוביות ל-NeuN מאשר באוכלוסיות השליליות ל-NeuN. לעומת זאת, רמות ה-mRNA של סמני תאי גליה ואולידוגודנדרוציטים גבוהות יותר באוכלוסייה השלילית ל-NeuN מאשר באוכלוסייה החיובית ל-NeuN.

מגמה דומה של רמות mRNA גבוהות יותר של סמני תאי מיקרוגיאלי נצפתה באוכלוסייה שלילית ל-NeuN, אם כי זה לא היה מובהק סטטיסטית. יתר על כן, רמות ה-Fos mRNA גבוהות יותר בתאי העצב החיוביים ל-Fos מאשר בתאי העצב השליליים ל-Fos, עם עלייה של פי שלושה של Fos mRNA בתאי העצב החיוביים ל-Fos מרקמה טרייה, ועלייה של פי 11 של Fos mRNA בתאי עצב חיוביים ל-Fos מרקמה קפואה, מה שמאשר את תקפות השיטה לזיהוי גנים ספציפיים מעניינים מתאים ממוינים בזרימה בתנאי רקמה טרייה וקפואה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע את השלבים הקריטיים למניעת ליזיס תאים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיון תאים מופעל פלואורסצנטי כדי לבודד את תת-קבוצות התאים המעניינות להמשך ניתוח מולקולרי במורד הזרם. שימוש ברקמה קפואה מאפשר למיין את הדגימות בימים נפרדים, קריטיים לניסויים הכוללים הליכי קציר והכנה ארוכים ומסובכים של רקמות. ניתן להשתמש בטכניקה זו גם להכנת דגימות מוח אנושיות קפואות לאחר המוות המאוחסנות במשך מספר חודשים או שנים למיון לפי ציטומטריית זרימה.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתנהגות של נוירונים המבטאים Fos או תאים פראיים אחרים בעלי תווית חיסונית מעניינים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לנתק תאים מרקמת מוח טרייה או קפואה של חולדות לצורך מיון תאים מופעל פלואורסצנטי של נוירונים או סוגי תאים מעניינים.