Name: הנדסה גנטית של שמרים לא קונבנציונליים עבור Biofuel מתחדשת והפקה ביוכימיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: למדו שיטה יעילה למחיקת גנים מכוונת בשמרים Yarrowia lipolytica באמצעות מחיקת KU70 ושילוב הומולוגי. הפרוטוקול מאפשר הנדסה גנטית מתקדמת לייצור ביודלק וביוכימיקלים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו בתודה להכיר תמיכת המימון מהסוכנות להגנת הסביבה הלאומית של סינגפור (ETRP 1,201,102), תכנית המחקר התחרותית של הקרן הלאומית למחקר של סינגפור (NRF-CRP5-2009-03), הסוכנות למדע, טכנולוגיה ומחקר של סינגפור ( 1324004108), גלובל מו&quot;פ פרויקט תכנית, משרד כלכלת ידע, הרפובליקה של קוריאה (N0000677), סוכנות הפחתת איום הביטחון (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) ואת הביולוגיה הסינטתית היוזמת של האוניברסיטה הלאומית של סינגפור ( DPRT / 943/09/14).

דור 1. של י &#39; זנים מחיקים KU70 lipolytica <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנייה של הקלטת שיבוש הערה: ראה טבלה 1 עבור כל פריימרים המשמשים תגובת שרשרת פולימראז הרחבות (PCR). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריימרים עיצוב 20 עד PCR להגביר את קלטת ביטוי LEU2 (ראו טבלה 1) מתוך י &#39; וקטור ביטוי lipolytica ולהציג אתרי LoxP לתוך 5 &#39;ו 3&#39; מסתיים של הקלטת LEU2 עם פריימר קדימה ארוך (# 1; טבלה 1) פריימר הפוכה ארוך (# 2; טבלה 1), בהתאמה. כדי להציג את אתר מגבלה נוסף על הצעדים הבאים של תהליך השיבוט, להוסיף את אתר מגבלה בם HI ב פריימר # 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע PCR באמצעות DNA פולימרז באיכות גבוהה כמפורט בטבלה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את קלטת PCR המוצר LoxP-האמרגן-LEU2-terminator-LoxP באמצעות purificatio PCRערכת n על פי הוראות היצרן. להוסיף 3&#39;-A המסוכך על מוצר PCR מטוהר פי הוראות היצרן 21. השתמש T4 DNA האנזים ולקשור המוצר PCR זנב a ל וקטור שיבוט ת&quot;א להניב הפלסמיד T-LEU2 לפי טבלה 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר את רצף הזרם 5 &#39;1 kb של הגן KU70 באמצעות פריימרים # 3 / # 4 מן י lipolytica Po1g הדנ&quot;א הגנומי 22 לפי טבלה 2. לטהר את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת טיהור PCR פי הוראות היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Double לעכל הוא מוצר PCR מטוהר פלסמיד T-LEU2 עם Sac השנייה בם HI אנזימים לפי טבלת 4. לטהר את תערובת העיכול באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות יצרן. השתמש האנזים T4 DNA ולקשור מטוהרים מתעכל המוצר PCR אל Sac II / Bam HI האתרים של T-LEU2 להניבפלסמיד T-LEU2-5E לפי טבלה 3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר את רצף במורד 3 &#39;1 kb של הגן KU70 באמצעות פריימרים # 5 / # 6 מן י lipolytica Po1g הדנ&quot;א הגנומי 22 לפי טבלה 2. לטהר את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת טיהור PCR פי הוראות היצרן. Double לעכל הוא מוצר PCR מטוהר פלסמיד T-LEU2-5E עם לא אני חס&quot;ם אני אנזימים לפי טבלת 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את תערובת העיכול באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות יצרן. לאחר מכן, ולקשור את מטוהרים מתעכל המוצר PCR אל לא אני / חס&quot;ם אני האתרים של T-LEU2-5E להניב הפלסמיד T-KO באמצעות האנזים T4 DNA על פי טבלה 3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את הפלסמיד T-KO עם Sac השנייה חס&quot;ם אני אנזימים לפי טבלה 4 כדי לייצר את הקלטת הפרעה (איור 1 </strong&gt;). לטהר את שברי DNA מתעכל באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תא מוסמכת וטרנספורמציה של י &#39; זן lipolytica Po1g <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תא מוסמכת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה של י &#39; lipolytica Po1g זן מהצלחת תמצית-peptone דקסטרוז שמרים טריים (YPD) ב 10 מ&quot;ל של מדיום YPD (1% תמצית שמרים, 2% peptone, 2% דקסטרוז ו -50 מ&quot;מ pH חיץ ציטראט 4.0) בבקבוק 100 מ&quot;ל. דגירה באינקובטור רועד 30 מעלות צלזיוס ב 225 סל&quot;ד במשך 20 שעות עד הרוויה (OD של 600 על 15, נמדד באמצעות ספקטרופוטומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 5000 XG בטמפרטורת חדר. שוטפים את התאים עם 20 מ&quot;ל טריס-EDTA (TE) חיץ (10 מ&quot;מ טריס, 1 mM EDTA, pH 7.5), ו גלולה התאים כמתואר בשלב 1.2.1.2. Resuspend התאים 1 מ&quot;ל של 0.1 מ &#39;אצטט ליתיום (pH 6.0, מותאם עם חומצה אצטית), דגירה במשך 10 דקות ב בטמפה בחדרrature. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot התאים המוסמכים (100 μl) לתוך צינורות 1.5 מיליליטר סטרילי. והמשך לביצוע הפעולות טרנספורמציה מתחת מיד, או להוסיף גליצרול לריכוז סופי של 25% (v / v) ולאחסן ב -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרנספורמציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבבת 10 μl של ה- DNA זרע סלמון המפוגל (10 מ&quot;ג / מיליליטר) ו 1-5 מיקרוגרם של הקלטת השיבוש מטוהרת יחד עם 100 μl של תאים מוסמכים, לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 700 μl של פוליאתילן גליקול 40% (PEG) -4000 (מומס pH אצטט 0.1 M ליתיום 6.0), מערבבים היטב דגירה באינקובטור רועד 30 מעלות צלזיוס ב 225 סל&quot;ד במשך 60 דקות. הערה: חשוב להשתמש PEG עם משקל מולקולרי ממוצע של 4000, במקום-3350 PEG (משמש בדרך כלל את הטרנספורמציה של שמרים קונבנציונאלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים לזעזע את תערובת הטרנספורמציה על ידי הנחת הצינור באמבט מים C ° 39 במשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל בינוני YPD ולהתאושש במשך שעה 2 ב 30 מעלות צלזיוס, 225 סל&quot;ד. צנטריפוגה ב 9,000 XG עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר את supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של חיץ TE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Repellet את התאים על ידי צנטריפוגה ב 9000 XG במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant. Resuspend גלולה ב 100 μl של חיץ TE צלחת לצלחות סלקטיבית (למשל, צלחות לאוצין מחסר), לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק 4 עד 10 מושבות אחת לחסן בנפרד לתוך 2 מ&quot;ל של מדיום YPD. דגירת לילה חממה רועדת 30 מעלות צלזיוס ב 225 סל&quot;ד. זיהוי מושבות חיוביות על ידי ניתוח PCR של הדנ&quot;א הגנומי מן transformants 22 לפי לוח 5 באמצעות שתי קבוצות של פריימרים 55 # / # 56 ו- # 56 / # 57, בהתאמה. הערה: לא אני לינארית וקטור pYLEX1 הופך י lipolytica Po1g תאים מוסמכים כדי לקבוע את יעילות השינוי על ידי ספירת המספרשל הקמת יחידות המושבה (CFU) לכל פלסמיד מיקרוגרם DNA בשימוש 23. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. מרקר הצלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנייה של פלסמיד ביטוי Cre <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניית pYLEX1-CRE ו pYLEX1-השרוולים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריימרים עיצוב 20 עד PCR להגביר את מסגרות קריאה פתוחה של cre ואת שרוולי. הוסף נוקלאוטיד אדנין נוסף במעלה הזרם של קודונים התחלה של פריימרים קדימה 82 # ו # 84, והכנס אתרי הגבלה Kpn לי במורד הזרם של קודונים עצירה פריימרים הפוכה # 83 ו # 85. PCR להגביר את מסגרות קריאה פתוחה של cre ו שרוולים מ pSH69 (HQ412578 מספר הצטרפות) 24 לפי טבלה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר הן cre ושברי שרוולים באמצעות ערכת טיהור PCR פי הוראות היצרן. תקציר הן שברי cre ואת שרוולי מטוהרים עם Kpn שאני האנזים לפי Tablדואר 4. להכפיל לעכל את הפלסמיד pYLEX1 עם PML אני Kpn שאני אנזימים לפי טבלה 4. לטהר את התערובת העיכול באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אנזים T4 DNA על פי טבלה 3 ולקשור את שברי המטוהרים מתעכלים cre ואת השרוולים לאתרי PML I / Kpn א &#39;של י&#39; וקטור ביטוי lipolytica, מניב pYLEX1-CRE ו pYLEX1-שרוולים, בהתאמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניית pSL16-CRE-השרוולים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר את הקלטת גן-terminator האמרגן של cre מ pYLEX1-CRE באמצעות פריימרים 86 # / # 87 איגוף באתרי הגבלה סאל I / Pst לי לפי טבלה 2. לטהר את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת טיהור PCR פי הוראות היצרן . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Double לעכל הן המוצר PCR מטוהרים pSL16-CEN1-1 (227) פלסמיד 25 עם סאל אניPst שאני אנזימים לפי טבלה 4. לטהר את התערובת העיכול באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות היצרן. לאחר מכן, ולקשור את מוצר ה- PCR המטוהר מעוכל אל pSL16-CEN1-1 (227) באתרים המתאימים ליצור pSL16-CRE באמצעות אנזים T4 DNA על פי טבלה 3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר את הקלטת הגן-terminator האמרגן של שרוולים מ pYLEX1-שרוולים באמצעות פריימרים # 88 / # 89 איגוף באתרי ההגבלה Xho I / BGL השנייה לפי טבלה 2. לטהר את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת טיהור PCR פי הוראות היצרן . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Double לעכל הוא מוצר PCR מטוהר פלסמיד pSL16-CRE עם Xho I ו- II BGL אנזימים לפי טבלת 4. לטהר את תערובת העיכול באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות יצרן. לאחר מכן, ולקשור את המוצר המטוהר מתעכל PCR לתוך pSL16-CRE בבית המקבילאתרים ליצור pSL16-CRE-שרוולים באמצעות אנזים T4 DNA על פי טבלה 3. הערה: פלסמיד הביטוי Cre וכתוצאה מכך, pSL16-CRE-השרוולים, מטפח סמן לבחירת hygromycin B ו- הוא וקטור centromeric ו episomally המשכפל (איור 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמת את כל המבנים על ידי עיכול עם אנזימי הגבלה המתאים (למשל, סאל I / Pst לי, שיחתוך את הכנס מפני וקטור) לפי טבלה 4. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלת סמן recombinase בתיווך Cre <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transform pSL16-CRE-שרוולים לתאי מוסמכות של הזן בנוקאאוט KU70 בעקבות פרוטוקול השינוי בסעיף 1.2 לעיל. פלייט טרנספורמציה תאים על YPD בתוספת hygromycin B (YPDH) צלחות (המכיל 400 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ב hygromycin), לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע המושבה PCR לפי טבלה 5 פריימרים באמצעות # 84 / # 85 לזהות חיוביתמושבות המכילות pSL16-CRE-שרוולי פלסמיד לאחר שינוי. הערה: קדימה פריימר 84 # ואת ממוקמי פריימר ההפוך 85 # שבתחומי אזור הקידוד של גני שרוולים (טבלה 1). רק שיבוטים חיוביים ליצור מוצר PCR ספציפי תגובת PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שיבוט חיובי לחסן לתוך 2 מיליליטר של מדיום YPDH, דגירה באינקובטור רועד 30 מעלות צלזיוס ב 225 סל&quot;ד לילה לרוויה. מדוד את התא OD 600 עם ספקטרופוטומטר. קציר התאים ב OD של 600 ~ 15. צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולשטוף פעם עם 2 מ&quot;ל של מים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-לחסן תאים לתוך 2 מ&quot;ל של מדיום YPD עם OD הראשונית 600 של 0.1 ולאפשר לתאים לגדול חממה רועד 30 מעלות צלזיוס ב 225 סל&quot;ד לילה. Streak התרבות התא לילה לצלחות YPD לבודד מושבות אחת 23. מושבות צלחת Replica על YPD, YPDH, וצלחות לאוצין מחסר 23 </sעד&gt;. הערה: מושבות שאבדו הן סמן LEU2 ו פלסמיד pSL16-CRE-השרוולים יכול לגדול רק על צלחות YPD (איור 3). </li></ol></li></ol> מחיקת 3. dehydrogenase אלכוהול אלכוהול מונואמין גנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חיפוש על י &#39; מסד נתוני הגנום lipolytica באמצעות כלי חיפוש יישור המקומיים הבסיסיים (יפציץ) לזהות מועמדי הגן למחיקה 26. קלט את רצף החלבון של ס dehydrogenase אלכוהול cerevisiae לי לתוך כלי חיפוש תפציץ (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&amp;db=yli&amp;seqid=aa). הערה: כלי החיפוש יפציץ מחזיר את רצפי חלבונים הדומים ביותר י מסד נתוני הגנום lipolytica. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות את הקלטות המחיקות על ידי PCR עם פריימרים מספר 7 56 # (טבלה 1), ולבצע עיכול אנזים הגבלה ותגובות קשירה באמצעות אותן השיטות כמתוארות בסעיף 1.1 לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prepהם תאים מוסמכים של הזן בנוקאאוט KU70, לבצע טרנספורמציות ולבצע PCR לזהות מושבות חיוביות עם פריימרים # 55, # 58 כדי # 81 (טבלה 1) על ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר בסעיף 1.2 לעיל. הערה: כדוגמא, את הליך מחיקת גן YALI0E17787g מתואר איורי 4 ו -5. ההשפעות של 1 קילו ו 2 קילו ארוך באזור ההומולוגי על שיעור הומולוגי מדווחות. </li></ol>

<ol><li>Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJim%C3%A9nez-Bremont%2C+JF+%22Development+and+dimorphism+of+the+yeast+Yarrowia+lipolytica.+Dimorphic+fungi%3A+Their+importance+as+models+for+differentiation+and+fungal+pathogenesis%22">Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis</a>. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).</li>
<li>Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoelho%2C+M+%22Yarrowia+lipolytica%3A+an+industrial+workhorse.+Current+research%2C+technology+and+education+topics+in+applied+microbiology+and+microbial+biotechnology%22">Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology</a>. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).</li>
<li>Martinez-Vazquez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+transcription+factor+Znc1p%2C+which+regulates+the+yeast-to-hypha+transition+in+the+dimorphic+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica.</a> Plos One. 8 (6), e66790(2013).</li>
<li>Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+morphogenetic+genes+by+insertional+mutagenesis+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica.</a> J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).</li>
<li>Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimorphic+yeast+Yarrowia+lipolytica+possesses+an+atypical+phosphofructokinase%3A+characterization+of+the+enzyme+and+its+encoding+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene.</a> Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).</li>
<li>Domìnguez, Á, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-conventional+yeasts+as+hosts+for+heterologous+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production.</a> Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).</li>
<li>Zinjarde, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food-related+applications+of+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Food-related applications of Yarrowia lipolytica.</a> Food Chem. 152, 1-10 (2014).</li>
<li>Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acid+production+by+the+yeast+Yarrowia+lipolytica%3A+a+review+of+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Micro%2B%22%5BJournal%5D)">Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects.</a> Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).</li>
<li>Groguenin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+the+%CE%B2-oxidation+pathway+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica+to+increase+the+production+of+aroma+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Catal.+B-Enzym%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds.</a> J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+production+from+oleaginous+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Renew.+Energ%22%5BJournal%5D)">Biodiesel production from oleaginous microorganisms.</a> Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).</li>
<li>Papanikolaou, S., Aggelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+production+by+Yarrowia+lipolytica+growing+on+industrial+glycerol+in+a+single-stage+continuous+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture.</a> Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).</li>
<li>Tai, M., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+push+and+pull+of+lipid+biosynthesis+in+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+for+biofuel+production%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production.</a> Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).</li>
<li>Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotechnological+applications+of+Yarrowia+lipolytica%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future.</a> Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).</li>
<li>Liu, L., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Draft+genome+sequence+of+the+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+PO1f%2C+a+commonly+used+metabolic+engineering+host%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announc%22%5BJournal%5D)">Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host.</a> Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).</li>
<li>Dujon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+evolution+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome evolution in yeasts.</a> Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).</li>
<li>Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+transformation+of+the+dimorphic+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbial.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica.</a> Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).</li>
<li>Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+by+electroporation+of+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica.</a> J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).</li>
<li>Matsuoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+regions+essential+for+the+function+of+chromosomal+replicator+sequences+from+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica.</a> Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).</li>
<li>Kretzschmar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+homologous+integration+frequency+in+Yarrowia+lipolytica+strains+defective+in+non-homologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining.</a> Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Kobs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+blunt-end+DNA+fragments+into+the+pGEM-T+Vector+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Promega+Notes%22%5BJournal%5D)">Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems.</a> Promega Notes. 62, 15-18 (1997).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast">http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast</a> (2016).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+laboratory+techniques%3A+plating+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).</li>
<li>Hegemann, J. H., Heick, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delete+and+repeat%3A+a+comprehensive+toolkit+for+sequential+gene+knockout+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).</li>
<li>Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+centromeric+DNA+from+yeast+Yarrowia+lipolytica+and+identification+of+protein-binding+site+required+for+plasmid+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission.</a> J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).</li>
<li>McGinnis, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%3A+at+the+core+of+a+powerful+and+diverse+set+of+sequence+analysis+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools.</a> Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).</li>
<li>Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+hybrid+promoters+and+integrative+expression%2Fsecretion+vectors+for+quasi-constitutive+expression+of+heterologous+proteins+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).</li>
<li>Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yarrowia+lipolytica%2C+a+yeast+model+for+the+genetic+studies+of+hydroxy+fatty+acids+biotransformation+into+lactones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Catal.+B-Enzym%22%5BJournal%5D)">Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones.</a> J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

המטרה שלנו עבור מחקר זה היא לאפשר לדור מהיר ויעיל של נוקאאוט גנטי ממוקד י lipolytica Po1g זן. מספר שיקולים צורך לטפל כדי להשיג זאת. ראשית, יעילות שינוי גבוה נדרשת. לפיכך, פרוטוקול טרנספורמציה כימית יעיל ונוח עבור י lipolytica Po1g זן תואר במחקר זה. השימוש-4000 PEG מהווה גורם קריטי עבור טרנספורמציה המוצלחת של זן זה. אין transformants התקבלו לטרנספורמציה פלסמיד בעת שימוש PEG-3350 (עבור הטרנספורמציה של cerevisiae ס) במקום PEG-4000. בנוסף, הכנת תאים...

בניגוד שמר אפייה, Yarrowia lipolytica, גידול שמרים בלתי שיגרתי, יכול לגדול בצורה של שמרים או תפטיר בתגובה לשינויי 1,2 תנאים סביבתיים. לפיכך, שמרים דימורפית זה יכול לשמש כמודל טוב ללימוד של בידול פטרייתי, morphogenesis ו 3,4,5 הטקסונומיה. זה נחשב בדרך כלל כמין שמרים בטוח (GRAS), שנמצא בשימוש נרחב כדי לייצר מגוון רחב של תוספי מזון כגון חומצות אורגניות, polyalcohols, תרכובות הארומה, מתחלבים פעילי שטח 6,7,8,9. זהו aerobe מחייבים וכן שמרים oleaginous ידועים מסוגל צבירת שומנים באופן טבעי לסכומים גבוהים, כלומר, עד 70% של תא יבש משקל 10. זה גם יכול לנצל קשת רחבה של מקורות פחמן לצמיחה, כולל סוגים שונים של שאריות לבזבז משאבים כיסודות הזנה 11,12,13. כל תכונות ייחודיות אלה הופכים י lipolytica מאוד אטרקטיבי עבוריישומים ביוטכנולוגיים שונים. למרות רצף הגנום כולו של י &#39; lipolytica כבר פורסם 14,15, מניפולציה גנטית של השמרים הלא השיגרתי הזה היא יותר מורכבת מאשר מיני שמרים אחרים. ראשית, טרנספורמציה של מינים שמרים זה הוא הרבה פחות יעיל בשל העדר של 16,17 מערכת טרנספורמציה גנטית יציב ויעיל. שנית, אינטגרציה הגנומי מייגעת של קלטות ביטוי ליניארי משמשת בדרך כלל את הביטוי של גנים של עניין כמו אין מערכת פלסמיד episomal הטבעי כבר נמצאה שמרים זה 18. שלישית, דור-outs הדפיקה הגנטי ולהפיל-ins מוגבל בגלל ההתמקדות בגנים יעילה באמצעות רקומבינציה הומולוגי מדויק בשמרים זה הנו נמוכים ביותר אירועי האינטגרציה להתרחש באמצעות הצטרפותו קצה שאינו הומולוגי (NHEJ) 19. במחקר זה, אנו מדווחים על פרוטוקול טרנספורמציה אופטימיזציה עבור י lipolytica </em&gt; זן Po1g, אשר קל, מהיר, יעיל לשחזור. כדי לשפר את התדירות הומולוגית מדויק, מחקנו את גן KU70, אשר מקודד אנזים מפתח בנתיב NHEJ. באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה אופטימיזציה והפיכת קלטת בנוקאאוט ליניארי המכילה איגוף אזורי הומולוגיה של 1 קילו, גן KU70 של י &#39; lipolytica Po1g נמחק בהצלחה. חוסנו של המתודולוגיה המחיקה הגן הזה אז הודגם על ידי מיקוד dehydrogenase אלכוהול וגנים מונואמין אלכוהול זן Δ KU70 Po1g. היה נראה כי זן מחיקת KU70 הציג יעילות גבוהה באופן משמעותי של גן בתיווך הומולוגי מיקוד מזו של זן Po1g wild-type. בנוסף, פלסמיד ביטוי בשכפול הדנ&quot;א Cre נושא את סמן התנגדות B hygromycin נבנה לבצע הצלת סמן. הצלת הסמן מקלה סבבים רבים של גן המיקוד ב הדואר המתקבל מוטנטים מחיקת גן. מלבד מחיקת גן, הפרוטוקול שלנו לטרנספורמציה הגנטי מחיקת גן המתואר כאן ניתן ליישם להכניס גני לוקוסים ספציפיים, וכדי להציג מוטציות ספציפיות לאתר לתוך י &#39; הגנום lipolytica.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנט/חומר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריימרים אוליגונוקלאוטידים</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td></td><td>25 nmole DNA oligos</td></tr><tr><td>Y. lipolytica זן Po1g</td><td>Yeast Biotech</td><td></td><td>לאוצין נגזרת אוקסוטרופית של הזן הפראי W29 (ATCC 20460)</td></tr><tr><td>וקטור pYLEX1</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYY203-5MG</td><td>Y. lipolytica וקטור ביטוי</td></tr><tr><td>E. coli TOP10</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>לשיבוט והתפשטות של פלסמידים</td></tr><tr><td>וקטור pGEM-T&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td>TA וקטור שיבוט</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>לבידוד פלסמיד</td></tr><tr><td>אשף SV ג'ל ו מערכת ניקוי PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>חלץ שברי DNA מג'ל אגרוז וטהר מוצרי PCR מתגובת</td></tr><tr><td>הגברה iProof high-fidelity DNA פולימראז</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5302</td><td>DNA פולימראז</td></tr><tr><td>BamHI&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0136S</td><td>אנזים הגבלה</td></tr><tr><td>BglII&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0144L</td><td>אנזים הגבלה</td></tr><tr><td>KpnI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0142S</td><td>אנזים הגבלה</td></tr><tr><td>NdeI&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0111S</td><td>אנזים הגבלה</td></tr><tr><td>NotI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0189L</td><td>אנזים הגבלה</td></tr><tr><td>PmlI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0532S</td><td>אנזים הגבלה</td></tr><tr><td>PstI&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0140S</td><td>אנזים הגבלה</td></tr><tr><td>SacII</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0157S</td><td>אנזים הגבלה</td></tr><tr><td>SalI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0138S</td><td>אנזים הגבלה</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0146L</td><td>אנזים הגבלה</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA פולימראז& נ.ב.פ;</td><td>Bio-Rad</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11593-027</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>PAA</td><td>P21-014</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>GeneRuler סולם DNA 1 kb Thermo</td><td>Scientific</td><td>SM0312</td><td>סולם DNA 1 kb</td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Sigma</td><td>95904-F</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0729</td><td></td></tr><tr><td>זרע סלמון DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15-632-011</td><td></td></tr><tr><td>ליתיום אצטט</td><td>סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>חרוזי זכוכית סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(425-600 ומיקרו; m)</td> <td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>DNA טעינת צבע</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים בקטו</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>בקטו פפטון</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>בסיס ראשון</td><td>BIO-1101</td><td></td></tr><tr><td>YNB ללא חומצות אמינו</td><td>סיגמא</td><td>Y0626</td><td></td></tr><tr><td>DO תוסף-Leu</td><td>Clontech</td><td>630414</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB מרק</td><td>BD</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB אגר</td><td>BD</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>בקטו אגר</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr> <tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכונת PCR</td><td>Biorad</td><td>T100 אמבט מים תרמי Cycler</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Memmert</td><td>WNB 14</td><td></td></tr><tr><td>חממה נייחת/טלטול</td><td>Yihder</td><td>LM-570RD</td><td></td></tr><tr><td>שייקר תרמו</td><td>Allsheng</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>אפנדורף&nbsp;</td><td>ביופוטומטר פלוס</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת ג'ל</td><td>GE</td><td>Amersham Imager 600</td><td></td></tr></tbody></table>

הנדסה גנטית של שמרים לא קונבנציונליים עבור biofuel מתחדשת והפקה ביוכימיים

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Yarrowia lipolytica הוא מין שמרים שאינם פתוגניים, דימורפית ו אירובית בהחלט. בשל התכונות הפיזיולוגיות הייחודיות שלה מאפיינים מטבוליים, שמרים הלא השיגרתי הזה הוא לא רק מודל טוב ללימוד של הטבע הבסיסי של בידול פטרייתי אבל הוא גם פלטפורמה מיקרוביאלי מבטיחה לייצור ביוכימיים יישומים ביוטכנולוגיים שונים, הדורשים מניפולציות גנטיות נרחבות. עם זאת, מניפולציות גנטיות של י &#39; lipolytica היה מוגבל בשל העדר מערכת טרנספורמציה גנטית יעילה ויציבה כמו גם שיעור גבוה מאוד של רקומבינציה שאינו הומולוגי שניתן לייחס בעיקר גן KU70. כאן אנו מדווחים פרוטוקול קל ומהיר עבור השינוי הגנטי היעיל למחיקת גני י lipolytica Po1g. פרוטוקול ראשית, עבור השינוי היעיל של ה- DNA אקסוגני לתוך י &#39; lipolytica Po1g הוקמה. SecoND, כדי להשיג את השיעור ההומולוגי פעמים המוצלבות המשופר למחיקה נוספת של גני המטרה, גן KU70 נמחק על ידי הפיכת קלטת שיבוש נושאת 1 נשק הומולוגית kb. שלישית, כדי להדגים את יעילות מחיקת גן המשופרת לאחר המחיקה של גן KU70 מחקנו בנפרד 11 גני מטרת קידוד dehydrogenase אלכוהול מונואמין אלכוהול באמצעות אותם ההליכים על זן הפלטפורמה בנוקאאוט KU70. היה נראה כי השיעור הומולוגי מדויק גדילה בצורה ניכרת מפחות מ -0.5% למחיקה של גן KU70 ב Po1g ל -33% -71% עבור מחיקת הגן היחידה של 11 גני יעד Po1g KU70 Δ. פלסמיד בשכפול הדנ&quot;א נושא את סמן התנגדות B hygromycin ומערכת Cre / LoxP נבנה, ואת גן סמן בחירה זני בנוקאאוט שמרים בסופו של דבר הוסר על ידי ביטוי של recombinase Cre כדי להקל סבבים רבים של targeמניפולציות גנטיות טד. מוטציות מחיקת גן יחיד וכתוצאה מכך יש יישומים פוטנציאליים דלק ביולוגי וייצור ביוכימיים.

י &#39;לינארית וקטור ביטוי lipolytica הוכנס לתוך פלטפורמת עגינה PBR בגנום של י &#39; lipolytica Po1g זן על ידי ביצוע רקומבינציה מוצלב יחיד 27. באמצעות הליך השינוי הכימי המהיר הוקם בשינה במחקר זה, י &#39;לינארית וקטור ביטוי lipolytica הפך בהצלחה לתוך זן Po1g wild-type בכל יעילות השינוי של&gt; 100 CFU / מיקרוגרם DNA. קלטת בנוקאאוט המוקפת רצפים הומולוגיים 1 kb הפכה לזן Po1g ואת גן KU70 נ...

אנו מדווחים כאן על שיטות למניפולציה גנטית מולקולרית של זן Yarrowia lipolytica Po1g לשיפור יעילות מחיקת הגנים. לזני Y. lipolytica המהונדסים המתקבלים יש יישומים פוטנציאליים בייצור דלק ביולוגי וביוכימי.

הנדסה גנטית של שמרים לא קונבנציונליים עבור Biofuel מתחדשת והפקה ביוכימיים

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לפתח שיטות הנדסה גנטית יעילות עבור מין שמרים לא שגרתי, כולל בניית DNA לטרנספורמציה, טרנספורמציית DNA, בחירת טרנספורמנטים ומחיקה ממוקדת של גנים באמצעות רקומינציה הומולוגית. ביססנו טכניקת מחיקת גנים יעילה מאוד במאבט yarrowia lipolytica PO1G עם יישומים פוטנציאליים בייצור דלק ביולוגי וכימיקלים ביולוגיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיבוש גנים באמצעות PCR, הוא הזמינות של כמויות גדולות של קטעי מחיקת גנים ומגוון רחב של סמנים ברירה.במחקר זה, אנו מדווחים על פרוטוקול לטרנספורמציה גנטית עבור זן ה-yarrowia lipolytica PO1G, שהוא יעיל, פשוט, מוכח וניתן לשחזור. זן מחיקת ה-KU70 של yarrowia lipolytica PO1G שנבנה במחקר זה מראה תדירות רקומינציה הומולוגית יעילה מאוד, המאפשרת סריקות מהירות וקלות יותר של מחיקות גנים ממוקדות. השלב הראשון בהליך זה הוא הגברה באמצעות PCR של קסטת הביטוי LEU2 מתוך וקטור ביטוי של Y.lipolytica, והחדרת אתרי LoxP לקצוות ה-5-prime וה-3-prime של קסטת ה-LEU2.בפריימר אחד הוכנס גם אתר הגבלה של BamHI עבור שלבים מאוחרים יותר בתהליך השבט. לאחר טיהור של הקסטה LoxP promoter LEU2 terminator LoxP, מתווספים שלושה בליטות (overhangs) מסוג prime-A לתוצר ה-PCR המטופה. לאחר מכן, תוצר ה-PCR בעל זנב A מולחם לתוך וקטור TA cloning כדי להפיק את הפלסמידה T-LEU2.שלב ה-PCR השני הוא הגברה של רצף של קילו-בסיס אחד במעלה הזרם (5-prime) של הגן KU70, תוך שימוש בפריימרים שלושה וארבעה מתוך ה-genomic DNA של Y.lipolytica PO1G. לאחר מכן, יש לבצע עיכול כפול הן של תוצר ה-PCR המנוקה והן של פלסמיד T-LEU2 באמצעות האנזימים SacII ו-BamHI, ולחבר (ligate) את תוצר ה-PCR המנוקה והמעובל לאתרי SacII BamHI של T-LEU2 כדי להפיק את הפלסמיד T-LEU2-5E. שלב ה-PCR השלישי הוא הגברה של רצף של קילו-בסיס אחד במורד הזרם (3-prime) של הגן KU70, תוך שימוש בפריימרים חמישה ושש מתוך ה-genomic DNA של Y.lipolytica PO1G.לאחר מכן, בצעו עיכול כפול שלทั้ง תוצר ה-PCR המופק ושל הפלסמיד T-LEU2-53 באמצעות האנזימים NotI ו-NdeI, וקשרו (ligate) את תוצר ה-PCR המופק והמעובל לאתרי NotI ו-NdeI של T-LEU2-5E כדי ליצור את הפלסמיד T-KO. לבסוף, בצעו עיכול של הפלסמיד T-KO באמצעות האנזימים SacII ו-NdeI כדי להפיק את קסטת השיבוש (disruption cassette). התחילו את ההליך על ידי הכנת תאי Y.lipolytica PO1G כשירים (competent).החדירו מושבה של זן *Y. lipolytica* PO1G ממעבדה טריאית של תמצית שמרים, פפטון ודקסטרוז (YPD) לתוך 10 מיליליטר של מצע YPD בבקבוק (flask) של 100 מיליליטר. הדגרירו באינקובטור נערער בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס במהירות של 225 סטורים לדקה (RPM) למשך 20 שעות עד להגעה לרוויה. למחרת, השקיעו את התאים על ידי צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-5000g בטמפרטורת החדר.שטוף את התאים באמצעות 20 milliliters של תמיסת TE והשק התאים שוב. לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), השהה את התאים ב-1 milliliter של 0.1 molar lithium acetate והדגר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. חלק את התאים המסמיליים (competent cells) למכסות (aliquots) של 100 microliter בתוך מבחנות סטריליות של 1.5 milliliter.עברו מיד להליך הטרנספורמציה על ידי ערבוב עדין של 10 µL של DNA מזרע סלמון דנטורי ובין 1 µg ל-5 µg של קסטת השבירה (disruption cassette) המופקת יחד עם 100 µL של תאים כשירים (competent cells). דגרו בטמפרטורה של 30 °C למשך 15 דקות. הוסיפו 700 µL של 40% polyethylene glycol 1000.ערבבו היטב, והדגירו באינקובטור עם ניעור בטמפרטורה של 30 °C במהירות של 225 RPM למשך 60 דקות. לאחר מכן, בצעו heat shock לתערובת הטרנספורמציה על ידי הנחת המבחנה באמבט מים בטמפרטורה של 39 °C למשך 60 דקות. לאחר 60 דקות, הוסיפו למבחנה 1 mL של מצע YPD ואפשרו לתאים להתאושש במשך שעתיים בטמפרטורה של 30 °C ובמהירות של 225 RPM.סובבו במערך צנטריפוגה ב-9000 ×g למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) והשביו מחדש את המשקע (pellet) ב-1 mL של תמיסת TE buffer. סובבו את התאים שוב במערך צנטריפוגה והשליכו את הנוזל העליון.ששעה מחדש את המשקע ב-100 µL של תמיצת TE ופרוס על מצע דל בל悠צין. דגור את המצע בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים עד שלושה ימים. לפני ביצוע הצלה של סמן באמצעות רקומבינאז CRE, בונים את פלסמיד הביטוי של CRE כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.חלק מהמאפיינים של פלסמיד זה, המשכפל באופן אפיסומלי, כוללים גן של רקומבינז CRE, סמן עמידות להיגרומיצין B וגן עמידות לאמפיסילין. כדי להתחיל בהליך זה, העבירו את הפלסמיד לביטוי CRE לתאים כשירים של זן ה-knockout של KU70, בהתאם לפרוטוקול הטרנספורמציה שהודגם קודם לכן. זרעו את התאים שעברו טרנספורמציה על מצעי YPD בתוספת היגרומיצין B והדגרימו בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך יומיים עד שלושה ימים.לאחר ביצוע colony PCR, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט לזיהוי מושבות חיוביות, בחרו שיבט חיובי להחדרה לשני מיליליטר של מצע YPDH והדגירו באינקובטור עם ניעור בטמפרטורה של 30 °C ובמהירות של 225 RPM למשך לילה עד לרוויה. למחרת, מדדו את ה-OD 600 של התרבית באמצעות ספקטרופוטומטר. כאשר התאים מגיעים ל-OD 600 של כ-15, קצרו אותם על ידי צנטריפוגציה ב-5000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.הסיר את העליון, הוסף שני מיליליטר של מים סטריליים וסבב שוב במערכת הצנטריפוגה. הסר את העליון ושחזר את התאים במצע YPD. זרע מחדש את התאים לשני מיליליטר של מצע YPD עם OD 600 ראשוני של 0.1. אפשר לתאים לגדול באינקובטור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס במהירות של 225 RPM למשך הלילה.ביום למחרת, בצעו מריחה של תרבית התאים מהלילה על צלחות YPD כדי לבודד מושבות בודדות. דגרו בטמפרטורה של 30 Celsius עד להופעת מושבות. בצעו העברה של המושבות (Replica plating) לצלחות YPD, YPDH וצלחות חסרות Leucine.דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים. מוצגת סכימה של הפלסמיד לשביטה (knockout) של KU70. עיכול של הפלסמיד באמצעות האנזימים SacII ו-NdeI מייצר את קסטת השבירה (disruption cassette).אלקטרופורזה של ג'ל מאשרת את נוכחותו של פס של 4.3 kilobase, שהוא הגודל הצפוי של קסטת השיבוש. מחיקת הגן KU70 ב-Y.lipolytica PO1G מאושרת באמצעות PCR. נתיבים 1 עד 10 מכילים תוצרי PCR שהוגברו מה-DNA הגנומי של הטרנספורמנטים, ונתיב 11 מכיל תוצרי PCR מזן הפרא.נתיב שבעה ממחיש ביטול גן (knockout) חיובי, בעוד שנתיב אחד מראה תוצאה חיובית שגויה. הגן המסמן לבחירה בזן שבו בוטל הגן KU70 הוסר בסופו של דבר על ידי ביטוי של CRE recombinase. טרנספורמנטים חיוביים נטולי סמן אומתו על ידי צמיחתם על מצע YPD בלבד.כדי לאמת את העלייה בשיעור מחיקת הגנים, לאחר מחיקת הגן KU70, נמחקו בנפרד 11 גנים מטרתם באמצעות אותו הליך בזן ה-KU70 knockout. כל שיבוש של גן אומת באמצעות PCR ותוצאה מייצגת מוצגת כאן, כאשר נמסים אחת, שתיים וארבע מזוהים כ-knockouts חיוביים. זן הפלטינום של Yarrowia lipolytica PO1G עם מחיקת KU70 מספק מערכת יעילה יותר ובחירה טובה יותר ליישומים בהנדסת מסלולים ואופטימיזציה של זנים בעת בניית מוטנטים אחרים עם מחיקה כרומוזומלית.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה מקיפה של אסטרטגיית מחיקה ממוקדת של גן בודד באמצעות רקומבינציה הומולוגית בתאי yarrowia lipolytica PO1G.

genetic-engineering-an-unconventional-yeast-for-renewable-biofuel

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

שיטת המפלצת הירוקה מאפשרת הרכבה המהירה של מחיקות מרובות מסומנות בחלבון כתב גן קידוד ירוק זרחני. שיטה זו מבוססת על נהיגת זני שמרים במחזורים חוזרים ונשנים של מגוון מיני של מחיקות והעשרה פלואורסצנטי המבוסס של תאים שנשאו יותר מחיקות.

תהליך המפלצת הירוקה לדור של זני שמרי נשיאת מחיקות Gene מרובות

אנו מציגים כאן תיאור אחיד של טכניקות שיכולות לשמש לפיתוח, לשנות, לנהל, ולבדוק ביטוי חלבון Heterologous של boulardii Saccharomyces שמרים פרוביוטיים.

טרנספורמציה של שמרים פרוביוטיים ושחזור שלהם מרקמות העיכול החיסון בעקבות Gavage אוראלי עכברים

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבנייה וסינון של ספריות מוטנטיות עבור מסעות אבולוציה מכוונים ב-Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

טכניקות אבולוציה והבידוד מסתגלים מתוארות והפגינו להניב נגזרות של stipitis זן Scheffersomyces NRRL Y-7124 כי הם מסוגלים לצרוך hexose במהירות וסוכרים מעורבים פנטוז ב אנזים saccharified hydrolyzates undetoxified וכדי לצבור יותר מ -40 גרם / אתנול L.

טכניקות האבולוציה של שמרי פנטוז-תוסס יציבים לשם bioconversion של lignocellulose כדי אתנול

עיצבנו מנגנון culturing רציפה לשימוש עם מערכות optogenetic להאיר תרבויות של חיידקים ותאים תמונה בקביעות הקולחים עם מיקרוסקופ הפוכה. Culturing, הדגימה, ההדמיה, וניתוח התמונה באופן אוטומטי לחלוטין, כך תגובות דינמיות תאורה ניתן למדוד על פני כמה ימים.

השרשה של תאורה אוטומטית, Culturing, מערכת דגימה עבור יישומים מיקרוביאלית optogenetic

צוואר בקבוק במחזור ' עיצוב-לבנות בדיקה ' של הנדסת חיידקים היא המהירות שבה אנחנו יכולים לבצע מסכי פונקציונלי של זנים. אנו מתארים שיטת תפוקה גבוהה לסינון המתח המוחל על מאות אלפי תאים שמרים לכל ניסוי העושה שיטה ברצף RNA מבוסס droplet.

תפוקה גבוהה שמרים להתאמץ פנוטיפים עם רצפי רנ א מבוססי Droplet

שליטה אופטוגנטית בחילוף החומרים המיקרוביאלי מציעה שליטה דינמית גמישה על תהליכי תסיסה. הפרוטוקול כאן מראה כיצד להגדיר תסיסה מווסתת אור כחול לייצור כימי וחלבון בקנה מידה נפחי שונה.

תסיסה מבוקרת אור לייצור כימיקלים וחלבון מיקרוביאליים

פרוטוקול זה משתמש במדווח ביולומינסנט המאפשר מדידות של פעילות השעתוק ב-Saccharomyces eubayanus כדי לנטר את המעבר מגלוקוז למלטוז, מה שמאפשר ניתוח בזמן אמת של התאמות מטבוליות ותומך באופטימיזציה של זנים לתסיסה תעשייתית בתנאים מגוונים.

ב Vivo ניטור פעילות שעתוק במהלך מעבר מטבולי באמצעות מדווח ביולומינסנט בשמרים

A-תפוקה גבוהה, אוטומטית, מתודולוגיה ייצור וטרנספורמציה טבק פרוטופלאסט מתוארת. המערכת הרובוטית מאפשרת ביטוי גנים מקביל מסיבי וגילוי במודל BY-2 המערכת שאמורה להיות לתרגום לגידולים שאינם מודל.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

שיטות ליצירת ספריות gRNA בקנה מידה גדול צריך להיות פשוט, יעיל וחסכוני. אנו מתארים פרוטוקול לייצור של ספריות gRNA מבוסס על עיכול אנזימטי של יעד ה-DNA. שיטה זו, CORALINA (ספריית gRNA מקיף הדור באמצעות פעילות נוקלאז מבוקר) מציג אלטרנטיבה סינתזה יקר oligonucleotide מותאם אישית.

פרוטוקול אוניברסלי עבור gRNA בקנה מידה גדול ספריית הפקה מכל מקור ה-DNA

למדו שיטה יעילה למחיקת גנים מכוונת בשמרים Yarrowia lipolytica באמצעות מחיקת KU70 ושילוב הומולוגי. הפרוטוקול מאפשר הנדסה גנטית מתקדמת לייצור ביודלק וביוכימיקלים.

הנדסה גנטית של שמרים לא קונבנציונליים עבור Biofuel מתחדשת והפקה ביוכימיים

גלה סרטונים נוספים