Name: דור של תאי גזע מושרים ממלנומה האדם שחדר-גידול לימפוציטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: למד לייצר תאי גזע מושרים מלימפוציטים חודרי-גידול במלנומה. שיטה זו מאפשרת ייצור בלתי מוגבל של תאי T ספציפיים לגידול לטיפול אימונותרפי במלנומה גרורתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לגב' דבורה פוסטיף ולגב' ג'קלין בריקדר בליבת רכש הרקמות ולד"ר סינדי דלונג במעבדת ליבת תאי גזע פלוריפוטנטיים באוניברסיטת מישיגן על הסיוע הטכני שלה. מחקר זה נתמך על ידי מימון סטארט-אפ של אוניברסיטת מישיגן ומענקים מהאגודה הכירורגית המרכזית, הקולג' האמריקאי למנתחים, ברית מחקר המלנומה ו-NIH/NCI (1K08CA197966-01) ל-F. Ito.

הערה: חולים צריכים לתת הסכמה מהדעת להשתתף דירקטוריון הסקירה המוסדי האנוש pluripotent גזע ועדת Cell אשרה מחקר. 1. ניתוק והתרבות של TILs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג חומר גידול כי אינו נדרש לאבחון histopathologic מליבת רכש פתולוגיה שירות / רקמות. מניחים 20-100 גרם של דגימות הגידול בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל עם 30 מ&quot;ל התקשורת איסוף הגידול (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח מוצק, מוצק, רקמות בריאות של דגימת גידול מאזורים נמקי שברירי ו / או דמים באמצעות מספריים. לאחר הסרת רקמות נימקים, להשתמש במספריים כדי לרכך את הדגימה קטנה ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הדגימה הטחונה לתוך השעית תא בודד באמצעות ערכת דיסוציאציה Dissociator סרטנית (אדם) על פי הוראות היצרן. סנן את ההשעיה עם מסננת תא 70 מיקרומטר זה מוגדר על צינור 50 מ&quot;ל ולשטוף את המסננת 2 פעמים עם2 מ&quot;ל של RPMI 1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 200 בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. בטל supernatant ו resuspend התאים ב 10 מ&quot;ל של התקשורת תא T (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון שיפוע שני שלבים כגון Ficoll (שיפוע פתרון) בצינור 50 מיליליטר, עם מדרגה תחתונה של 10 מיליליטר של תמיסת צבע 100% ו צעד באמצע 30 מיליליטר של תמיסת שיפוע 75% בדילול עם phosphate- של Dulbecco בופר, לא סידן, מגנזיום לא (D-PBS (-)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבת השעית התא (משלב 1.4) על שיפוע הפתרון (מ שלב 1.5). צנטריפוגה ב 400 XG ב 20 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את השכבה המכילה את TILs מועשר על הממשק בין שיפוע הפתרון 100% והפתרון שיפוע 75% בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל. לדלל את שכבת הפתרון עם TILs מועשר על ידי הוספת 20-30 מ&quot;ל של D-PBS (-). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 200 בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. בטל supernatant ו resuspend השבר TIL מועשר ב 10 מ&quot;לשל תקשורת תא T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות השבר (מ שלב 1.8) עם 2 מ&quot;ל של התקשורת תא T ו- 6,000 IU / ml אנושי רקומביננטי (RH) IL-2 בצלחת 6-היטב על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה וחצי בתקשורת ביום 5 לאחר תחילת התרבות וכל ואילך 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול התאים ביחס של 1: 2 ללא trypsinization לאחר השעיית ברכות, הכפלת מספר בארות כאשר מגיעים confluency 80-90%. הוספת נפח מחצית (1 מיליליטר) של תקשורת תא T הטריה rhIL-2 ב 6,000 IU / ml. </li></ol> 2. הכנת mitomycin-C שטופלו SNL מזין סלולרי פלייט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מזין תרבות SNL ב 10 מ&quot;ל של התקשורת תא מזין SNL (טבלה 1) על צלחת 0.1% ג&#39;לטין מצופה 10 ס&quot;מ עד המפגש 80-90% (3-4 x 10 6 תאים) הוא הגיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 310 μl של 0.4 מ&quot;ג / פתרון C mitomycin מ&quot;ל ישירות לתוך צלחת תרבית תאים מזין SNL לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 על 2 שעה ו 15 דקות. לשאוב את התקשורתnd לשטוף את התאים פעמיים עם 5 מ&quot;ל D-PBS (-). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של 0.25% טריפסין / 1 mM EDTA ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 דקה כדי לנתק את התאים. להוסיף 4.5 מיליליטר של תקשורת תא מזין SNL לנטרל מחדש להשעות את התאים לתוך השעיה בודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל ב XG 200 במשך 5 דקות. לשאוב התקשורת לספור את התאים עם hemocytometer אחרי מחדש השעיית ב 10 מ&quot;ל של התקשורת תא מזין SNL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 1.5 x 10 6 תאים לכל טוב של תאים מזין SNL על צלחת 10 ס&quot;מ לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. השתמש מזין תאי SNL בתוך 3 ימים. </li></ol> דור 3. iPSCs שימוש וירוס סנדאי (SEV) וקטור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר TILs (משלב 1.11) ולהפעיל 5 x 10 5 תאים של TILs עם אנטי אנושי העכבר צלחת הנכנס CD3 (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו CD28 אנטי אנושי עכבר מסיסים (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל), עם rhIL-2 (6,000 IU / ml) ב 2 מ&quot;ל של התקשורת תא T בצלחת 6-היטב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר TILs (מ שלב 3.1) בצינור 15 מ&quot;ל בעזרת פיפטה ולספור את מספר הסלולרי עם hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מחדש 1 x 10 5 תאים של TILs עם אנטי אנושי עכבר הנכנס צלחת CD3 (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו CD28 אנטי אנושי עכבר מסיסים (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל), עם rhIL-2 (60 IU / ml) ב 500 μl תכנות מחדש של התקשורת (טבלה 1) לכל היטב צלחת 24 גם ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות. כן 3 בארות עבור זיהום sev: OCT3 / 4, Sox2, KLF4, ו- c-myc (1 טוב); זיהום sev (GFP: חלבון פלואורסצנטי ירוק) (1 טוב); וספירת כדוריות (1 היטב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות (מ שלב 3.3), לספור את מספר הסלולרי עם hemocytometer ולקבוע את עוצמת הקול של כל וירוס עבור שונים (3-20) multiplicities של זיהום (משרד הפנים). הסר קבוצה אחת של צינורות וקטור וירוס סנדאי מהאחסון -80 ° C. הפשרת וקטורי sev במהירות באמבט מים (37 מעלות צלזיוס) ומניח אותם על קרח. נפח של הנגיף (μl)= מואה (CIU / תא) x מספר תאים / כייל הנגיף (CIU / מ&quot;ל) × 10-3 (μl / מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הכרכים מחושב של אחד הצינורות וקטור וירוס ארבעה סנדאי שכל אחד מהם בנפרד נשאו OCT3 / 4, Sox2, KLF4, ו- c-myc על ידי הוספת תערובת של וקטורים sev ב 10-20 הפנים לתוך התקשורת, כולל מופעל TILs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את היעילות התמר, להוסיף הכרכים המחושבים של sev-GFP לתוך באר של TILs מופעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הצלחת (מ שלב 3.5 ו שלב 3.6) בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, להעריך את יעילות זיהום באמצעות TILs נגוע sev-GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוספים את התאים (מ שלב 3.5) בצינור 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה ב XG 200 בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 0.5 מ&quot;ל של התקשורת hESC עם המדיום הסלולרי ES הפרימאטים ו גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF, 4 ng / ml). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה לתוך צלחת 10 ס&quot;מ כי Contaתוספות mitomycin-C שטופלו תאים מזין SNL ב 10 מ&quot;ל של התקשורת hESC. שנה את תקשורת hESC פעם בימים עד המושבות גדלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבות היום 18 עד 21, להסיר את תאי מזין SNL סביב המושבות תחת מיקרוסקופ באמצעות קצה של 10 μl של הספסל הנקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרדו את מושבות באמצעות קצה של 10 μl ולהעביר אותם באמצעות טיפ 200-μl לתוך 100 μl של התקשורת iPSCs לכל גם צלחת בתרבית רקמה 96-היטב. Pipet מעלה ומטה 2-3 פעמים כדי לשבור את המושבות לגושים קטנים בהיקף ממוצע של 50-100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הגושים הקטנים לתוך צלחות תרבית רקמת 6-היטב עם תאי מזין SNL mitomycin-C שטופלו (משלב 2) ב 2 מיליליטר לכל טוב של תקשורת iPSCs עם גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF, 4 ng / ml). שינוי תקשורת iPSCs מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את iPSCs צלחות בתרבית רקמה 6-היטב עם תאים מזין SNL שטופלו C-mitomycin טרי עם 1 מ&quot;ג / IV collagenase מ&quot;ל כל 5-6 ימים. כן 2 בארות לכל צלחות של כל שיבוט עבור immunostaining. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את תכנות מחדש מלא של כל שיבוט ידי מכתים immunohistochemical של סמנים pluripotency (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, tra-1-81, ו OCT3 / 4) 1. הערה: לצורך הערכה נוספת של הפוטנציאל pluripotency, לאשר-לתכנות מחדש באופן מלא קווי iPSC יכולים להתמיין שלוש שכבות הנבט ידי היווצרות הגוף embryoid ו assay בידול או במערך teratoma assay 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא-לתכנות מחדש באופן מלא קווי iPSC להפגין קריוטיפ נורמלי ידי ניתוח ציטוגנטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור היווצרות תפלצת רוחנית, להזריק iPSC TIL נגזרות מובחן (1 x 10 6) להשעיה 100 μl של DMEM המכיל 10% FCS לתוך הרקמה התת עורית של עכברי NOD / SCID נקבה בת 6-8 בשבוע. סעיפים teratoma הכתם עם hematoxylin ו eosin. </li></ol> 4. Immunofluorescence מכתים של iPSCs עבור SSEA3, SSEA4, TRA1-60 ו TRA1-81 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף iPSCs עם 1 מ&quot;ל של PBS ולתקן את iPSCs עם 1 מ&quot;ל של 4% לשנהפתרון raformaldehyde במשך 10 דקות. הסר את הפתרון paraformaldehyde 4% ולשטוף את iPSCs עם 1 מ&quot;ל של 3 פעמים PBS. הערה: היזהר בעת שימוש paraformaldehyde כי הוא רעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pretreat iPSCs עם חסימת חיץ (טבלה 1) במשך 30 דקות. בינתיים, לדלל את הנוגדנים הראשוניים (SSEA3 אנטי אנושי חולדה, SSEA4 אנטי אנושי עכבר, TRA1-60 אנטי אנושי עכבר TRA1-81 אנטי אנושי העכבר) 01:50 ב -1.5% פתרון עז בסרום מדולל עם PBS TritonX -100 (הנפח הכולל: 1 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוצץ חסימת (טבלה 1). מוסיפים את פתרון נוגדן ראשוני מדולל דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. בינתיים, לדלל את נוגדנים משני (IgG נגד העכבר IgM או-עכברוש אנטי IgM) 01:50 ב -1.5% פתרון סרום עיזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון נוגדן ראשוני מדולל ולשטוף את iPSCs עם 1 מ&quot;ל PBS 3 פעמים, כל 5 דקות. מוסיפים את פתרון נוגדנים משני בדילול דגירה במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר בחדר חשוך. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון נוגדנים משני בדילול ולשטוף את iPSCs עם 1 מ&quot;ל של 3 פעמים PBS, כל 5 דקות. שימו לב iPSCs עם מיקרוסקופ immunofluorescence. </li></ol> 5. Immunofluorescence מכתים של iPSCs עבור Oct3 / 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף iPSCs עם 1 מ&quot;ל של PBS ולתקן את iPSCs עם 1 מ&quot;ל של תמיסת paraformaldehyde 4% במשך 10 דקות. הסר את הפתרון paraformaldehyde 4% ולשטוף את iPSCs עם 3 פעמים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ permeabilization (טבלה 1) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הסר את חוצץ permeabilization ולהוסיף חיץ חסימת (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בינתיים, לדלל את הנוגדן הראשוני (עכבר אנטי אנושי Oct3 / 4) 01:50 בחסימת המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את פתרון נוגדן ראשוני מדולל דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון הנוגדן הראשוני המדולל ולשטוף את iPSCs עם 1ml של PBS 3 פעמים, כל 5 דקות. בינתיים, דילאוטה נוגדנים משני (עז נגד העכבר IgG / IgM) 1: 100 בחסימת המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את פתרון נוגדנים משני בדילול דגירה בטמפרטורת החדר בחדר חשוך במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון משני מדולל ולשטוף את iPSCs עם 1 מ&quot;ל של 3 פעמים PBS, כל 5 דקות. שימו לב iPSCs תחת מיקרוסקופ immunofluorescence. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
<li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li>
<li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Human+Tumor+Antigen-Specific+T+Cells+from+iPSCs+Derived+from+Mature+CD8%28%2B%29+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).</li>
<li>Wakao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+functional+human+mucosal-associated+invariant+T+cells+via+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).</li>
<li>Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor-infiltrating+lymphocyte+cultures+for+use+in+adoptive+transfer+therapy+for+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients.</a> J Immunother. 26, 332-342 (2003).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+identifies+the+patient-specific+CD8%28%2B%29+tumor-reactive+repertoire+infiltrating+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors.</a> J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).</li>
<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+Complete+Responses+in+Heavily+Pretreated+Patients+with+Metastatic+Melanoma+Using+T-Cell+Transfer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).</li>
<li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+for+cancer%3A+harnessing+the+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+Melanoma+Tumor-Infiltrating+Lymphocytes+to+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 11(2016).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Fujie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Type+of+Sendai+Virus+Vector+Provides+Transgene-Free+iPS+Cells+Derived+from+Chimpanzee+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood.</a> PLoS One. 9, e113052(2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הנה, הראינו פרוטוקול תכנות מחדש מלנומה TILs כדי iPSCs ידי התמרה בתיווך sev של שעתוק ארבעה גורמים OCT3 / 4, Sox2, KLF4, ו- c-myc. גישה זו, באמצעות מערכת sev לתכנת מחדש תאי T, מציעה את היתרון של שיטת שילוב אי 7. מחקר קודם הראה כי מערכת תכנות מחדש sev היה יעיל מאוד ואמין לתכנת מחדש לא רק פיברובלסטים אלא גם תאים היקפיים דם T 7,17. בנוסף, אנו לאחרונה הראינו כי TILs מלנומה כי הם מובחנים יותר ולהבי...

הטכנולוגיה לתכנות מחדש של תאים המאפשר דור של תאי גזע מושרים (iPSCs) דרך ביטוי יתר של קבוצה מוגדרת של גורמי שעתוק טומן בחובו הבטחה גדולה בתחום טיפולים מבוססי תאים 1,2. IPSCs אלה להפגין תכונות תעתיק ו אפיגנטיים ויש להם את היכולת התחדשות עצמית pluripotency, בדומה לתאי גזע עובריים (ESCs) 3-5. התקדמות מרשימה שנעשו בטכנולוגיה תכנות מחדש בעשור האחרון אפשרה לנו ליצור iPSCs האנושית אפילו תאים מובחנים סופני, כגון תאי T 6-8. T תאים שמקורם iPSCs (TiPSCs) לשמור על אותה התצורה מחדש של קולטן תא T (TCR) גני שרשרת כמו תאי T המקוריים, אשר מאפשרת התחדשות של תאי T אנטיגן ספציפי מן TiPSCs 9-11. כמעט 80% של לימפוציטים שחדר מלנומה (TILs) המתקבל גידול של המטופל במיוחד להכיר אנטיגנים גידולים הקשוריםnd לשמור cytotoxicity נגד תאי הסרטן המקורי 12. יש לציין, כי הביטוי של-1 חלבון מוות תאי מתוכנת (PD-1) על TILs נמצא לזהות את רפרטואר גידול-reactive העצמי, כולל CD8 neoantigen ספציפי מוטציה + לימפוציטים 13. העברת מאמצת של TILs העצמי המורחב לשעבר vivo בשילוב עם משטרי lymphodepleting preparative ומנהל מערכתי של אינטרלויקין -2 (IL-2) יכולה לגרום רגרסיה משמעותית של מלנומה גרורתית תת קבוצות של חולים 14. למרות תוצאות מעודדות במודלים פרה ובחולים, הישרדות עניה של תאי T החדורים וקיומה של מסלולים מדכאים חיסון להופיע להתפשר את מלוא הפוטנציאל של טיפול בתא מאמצת T. פרוטוקולים קליניים נוכחי דורשים מניפולציה vivo לשעבר נרחב של תאי T עצמיים על מנת לקבל מספר גדול. זו תוצאה של הדור של תאי T בדיל סופנים שיש הישרדות עניה, prol מופחתקיבולת iferative, ורמות גבוהות של PD-1 15. מגבלה זו של טיפול T תא המאמצת ניתן להתגבר באופן תיאורטי באמצעות iPSCs שיכול לספק מקור בלתי מוגבל של תאי T עצמיים עבור חיסוני. דיווחנו תכנות מחדש לאחרונה של מלנומה TILs להביע רמות גבוהות של PD-1 על ידי וירוס סנדאי (SEV) התמרה בתיווך מארבעת גורמי שעתוק, OCT3 / 4, Sox2, KLF4, ו- c-myc 16. בעוד וקטורים רטרווירוס דורשים אינטגרציה לתוך הכרומוזומים מארחים לבטא גני תכנות מחדש, וקטורי sev הנם ללא שילוב ולבסוף מסולקות מן הציטופלסמה. תכנות מחדש יעילות גבוהה בהרבה עם מערכת sev לעומת וקטורי lentivirus או רטרו-וירוס 6-8. יתר על כן, sev יכול במיוחד לתכנת מחדש תאי T בתאים דם היקפיים mononuclear (PBMCs), בעוד כמה שיבוטים iPSC שנוצר על ידי lentivirus או וקטורים רטרווירוס יכול להיות משורות nonlymphoid 6-8. כאן, אנו בפירוטהנהלים מיושמים עבור הבידוד והפעלת TILs מלנומה אנושי לייצור iPSCs TIL הנגזר באמצעות מערכת תכנות מחדש sev.

<table><tbody><tr><td>צינורות MACS C עדינים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>MACS Dissociator עדין</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>ערכת דיסוציאציה של גידולים, Human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 um Cell Sfilters</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50 מ"ל צינורות קנטריפוגה חרוטיים</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>סרום AB אנושי</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין (200 מ"מ)</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול (1000x, 55 מ"מ)</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין&nbsp;</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>גנטמיצין</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי (rh) IL-2</td><td>Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עכבר NA/LE מטוהר אנטי-אנושי CD3</td><td>BD</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>מטוהר NA/LE עכבר אנטי-אנושי CD28</td><td>BD</td><td></td> 555725-X-VIVO <td></td></tr><tr><td>15</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-אצטילציסטאין</td><td>קמברלנד פרמצבטיקה בע"מ</td><td>NDC 66220-207-30</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית רקמות פלקון (6 בארות)</td>לוחות תרבית רקמות <td>פלקון</td><td>353046</td><td></td>קורנינג</tr><tr><td>(24 בארות)</td><td>קורנינג</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>וקטור וירוס סנדאי</td><td>תאי הזנה DNAVEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SNL</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>CBA-316</td><td></td></tr><tr><td>מיטומיצין C</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>מסיס במים (0.5 מ"ג/מ"ל)</td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF)</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>PHG0264</td><td></td></tr></tbody></table>

דור של תאי גזע מושרים ממלנומה האדם שחדר-גידול לימפוציטים

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

העברת מאמצת של vivo לשעבר מורחבת לימפוציטים עצמיים שחדר-גידול (TILs) יכולה לתווך תגובות יציבות ומלאות תת משמעותי של חולים עם מלנומה גרורתית. מכשולים עיקריים של גישה זו הם כדאיים המופחתת של תאי T להעברה, הנגרמים על ידי קיצור הטלומרים, והמספר המצומצם של TILs המתקבל חולה. פחות בדיל תאי T טלומרים ארוכים יהיו משנה תאי T אידיאלי עבור טיפול בתאים T מאמצת, אולם יצירת מספר גדול של תאי T פחות בדיל אלה הן בעייתית. מגבלה זו של טיפול T תא מאמצת ניתן להתגבר באופן תיאורטי על ידי תאי גזע מושרים אלקטרוניים (iPSCs) כי עצמי לחדש, לשמור pluripotency, יש טלומרים מוארכים, ומהווה מקור בלתי מוגבל של תאי T עצמיים עבור חיסוני. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצור iPSCs באמצעות וקטורי וירוס סנדאי עבור התמרה של גורמי תכנות מחדש לתוך TILs. פרוטוקול זה ליצורזה מלא לתכנות מחדש, שיבוטים וקטור חינם. TIL נגזר אלה iPSCs עלול להיות מסוגל לייצר פחות בדיל בפציינט, ואת הגידול ספציפי תא T עבור טיפול בתא מאמצת T.

איור 1 מציג סקירה כללית של ההליך המערבת את ההתפשטות הראשונית של מלנומה TILs עם rhIL-2, אשר מלווה הפעלה עם אנטי CD3 / CD28 ו הגן העברת OCT3 / 4, KLF4, Sox2, ו- c-myc כדי TILs עבור הדור של iPSCs. בדרך כלל, TILs על תרבות עם תחילת rhIL-2 כדי ליצור כדורים 21-28 ימים לאחר תחילת התרבות. בשלב זה, TILs מוכנים להיות מופעל עם אנטי CD3 / CD28. איור 2 א מראה TILs, על תרבות עם rhIL-2 ביום 21, כי הם מוכנים להיות מופעל עם אנטי CD3...

מטרת פרוטוקול זה היא להראות את הפרוטוקול לתכנות מחדש של לימפוציטים חודרים לגידול מלנומה לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים.

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להפיק תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים, או iPSCs, מלימפוציטים חודרי מלנומה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה של הגידולים, ובמיוחד עבור אימונותרפיה לסרטן. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיכולת להפיק תאי iPS אנושיים מלימפוציטים חודרי גידול עשויה לספק מספרים בלתי מוגבלים של תאי T ספציפיים לגידול, במצב פחות מובחן, לצורך אימונותרפיה.לטכניקה זו עשויות להיות יישומים לטיפול במלנומה גרורתית, שכן נכון לעת זו, הישרדותם הדלה של תאי T בקליניקה היא המגבלה העיקרית של טיפול תאי T אדפטיבי. שיטה זו עשויה להיות מועילה גם בחקירת רפרטוא르는 של הקולטן של תאי T במיקרו-סביבת הגידול. את הפרוצדורה תדגים ד"ר קומיקו איवाबוצ'י (Kumiko Iwabuchi), עמיתת פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי.לאחר השגת חומר הגידול, בחרו חמישה עד 20 גרם של דגימות גידול והשתמשו במספריים כדי להפריד את הרקמה הנורמלית, המוצקה והקשיחה מהאזורים הנמקריים השבירים ו/או המדממים של דגימות הגידול. קצצו את הדגימות שהופרדו בצורה דקה ככל האפשר, ולאחר מכן השתמשו במכשיר לפירוק (dissociator) ובערכה לפירוק גידולים אנושיים כדי להפוך את חלקי הגידול הקצוצים לסספנסיה של תאים בודדים, בהתאם להוראות היצרן. בסיום תהליך הפירוק, סננו את התאים דרך מסנן של 70 micron לתוך מבחנה של 50 milliliter ושטפו את המסנן פעמיים עם שני מיליליטר של RPMI 1640.לאחר מכן, שקיעו את התאים באמצעות סנטריפוגה והשעיכו אותם מחדש ב-10 milliliters של מצע T-cell טרי. כדי להפריד את התאים באמצעות מדרג צפיפות, שכיבו תחילה 30 milliliters של תמיסת gradient בריכוז 75%, ולאחריהן 10 milliliters של תמיסת gradient בריכוז 100% ב-DPBS ללא סידן או מגנזיום, לתוך מבחנה חדשה בנפח 50 milliliter. לאחר מכן, העבירו בזהירות את התאים מעל תמיסת המדרג, תוך הקפדה לא להפר את השכבות, וסובבו את הדגימה בסנטריפוגה.בסיום ההפרדה, העבירו את הלימפוציטים המסננים גידול (TILs) המועשרים, הנמצאים בממשק שבין תמיסות המדרג, לשפופרת קונית חדשה בנפח 50 milliliter ושטפו את התאים ב-20 עד 30 milliliters של DPBS רענן. השעיו שוב את המשקע ב-10 milliliters של מצע גידול לתאי T רענן, ולאחר מכן הוסיפו שתי milliliters של TILs לכל באר בחמש בארות של פלטת שש בארות. הוסיפו לתרביות ה-TILs Recombinant Human IL-2 למשך חמישה ימים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide. ביום החמישי, החליפו מחצית מהמצע בכל בארה, והמשיכו להחליפו בכל יומיים עד שלושה ימים לאחר מכן.כאשר התרביות מגיעות ל-80 עד 90% התמזגות (confluency), השתמשו בפיפטה כדי להשהות בעדינות את התאים בכל באר וחלקו את התרביות ביחס של אחת לשתיים במיליליטר אחד של מצע T-cell טרי המועשר ב-Recombinant Human IL-2. להכנת פלטות תאי מאכל (feeder plates) של SNL שעברו טיפול ב-mitomycin-C, גרבו תחילה תאי מאכל SNL ב-10 מיליליטר של מצע תאי מאכל SNL בצלחת בקוטר 10 סנטימטרים מצופה ב-0.1% ג'לטין. כאשר התאים מגיעים ל-80 עד 90% התמזגות, טפלו בתאי המאכל ב-mitomycin C למשך שעתיים ו-15 דקות ב-37 °C וב-5% carbon dioxide.בסיום הדגירה, שטפו את התאים פעמיים עם 5 ml של DPBS. לאחר מכן, נתקו את תאי המזינה (feeders) באמצעות Trypsin-EDTA בטמפרטורת החדר. לאחר דקה אחת, נטרלו את תגובת הדיסוציאציה עם 4.5 ml של מצע מזינה SNL טרי והעבירו את תרחיף התאים הבודדים לשפופרת קונית של 15 ml לצורך צנטריפוגציה.שחזר את המשקע ב-10 milliliters של מצע תאי מאכילה SNL טרי לצורך ספירה. לאחר מכן, זרע 1.5 times 10 to the six תאי מאכילה SNL לכל באר בצלחות של 10 centimeter והדגר את התרביות ב-37 degrees Celcius ב-5% carbon dioxide למשך עד שלושה ימים. כדי להפיק iPSCs באמצעות Sendai Virus, העבר five times 10 to the fifth TILs לכל באר לפלטה חדשה של שש בארות המצופה ב-mouse anti-human CD3, ב-two milliliters של מצע תאי T טרי מועשיר ב-Recombinant Human IL-2 וב-soluble mouse anti-human CD28.הפעילו את ה-TILs באינקובטור לתרביות תאים למשך חמישה ימים. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה כדי לאסוף את התרביות לשפופרת קונית בנפח 15 milliliter לצורך ספירה. לאחר מכן, העבירו 1×10⁵ TILs לכל באער לתוך פלטת 24 באערים מצופה ב-anti-human CD3 ב-500 microliters של מדיום תכנות מחדש (reprogramming medium) מועשר ב-soluble mouse anti-human CD28 וב-Recombinant Human IL-2.לאחר 24 שעות באינקובטור לתרביות תאים, ספרו את התאים בכל באר והכינו מספר נפחים של נגיף בריבויים מתאימים של זיהום (MOI). לאחר מכן, הוסיפו תערובת של וקטורי Sendai Virus בריכוז של 10 עד 20 MOI לנפח המתאים של מצע, והוסיפו את המצע המכיל את הנגיף לכל באר של TILs. כדי לקבוע את יעילות התעתוק, הוסיפו את הנפח המחושב של Sendai Virus GFP לבאר של TILs מופעלים והחזירו את התרביות לאינקובטור למשך 24 שעות.ביום למחרת, בחנו את התאים שהודבקו בנגיף Sendai GFP באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להעריך את יעילות ההדבקה של הטרנסדוקציה. רכזו את התאים שהודבקו בנגיף מכל באר לשפופרת של 15 milliliter לצורך סנטריפוגציה, והשביעו מחדש את המשקע ב-0.5 milliliters של מצע תאי גזע עובריים אנושיים,י משופר עם מצע תאי גזע עובריים של פרימטים וגורם צמיחה בסיסי לפיברובלסטים (basic fibroblast growth factor).בתמונה זו מוצגים TILs ביום ה-21 של תרבית עם Recombinant Human IL-2, המוכנים להפעלה באמצעות anti CD3 ו-CD28. ניתן להחדיר ל-TILs את ה-Sendai Virus בריבוי זיהום (multiplicity of infection) של 20. כאן מוצג clone פלוריפוטנטי טיפוסי על תאי הזנה מסוג SNL, 18 עד 21 ימים לאחר זיהום ב-Sendai Virus.כפי שניתן לראות בקריוגרמה מייצגת זו, ה-iPSCs שהופקו מ-TILs מראים קריוטיפ תקין. צביעה אימונופלואורסצנטית לאישור ביטוי של סמני פלוריפוטנציה ב-iPSCs שהופקו מ-TILs מדגימה כי תאים אלו מראים את רמות הביטוי הצפויות של סמני פלוריפוטנציה טיפוסיים. בנוסף, iPSCs שהופקו מ-TILs של מלנומה מסוגלים ליצור טרטומה המכילה מגוון תאים משלוש שכבות העובר.בנוסף, iPSCs שנגזרו מ-TIL שמרו על ארגון קולטני תאי ה-T שלהם, כפי שנבדק באמצעות אלקטרופורזה נימיות. פיתוח ראשון זה סולל את הדרך לחוקרים בתחום האונקולוגיה לבחון אימונותרפיות יעילות יותר לסרטן עבור חולים עם מלנומה גרורתית. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לבדוק את שריד ותאיות תאי ה-T לפני הדבקה בנגיף Sendai ולהעריך את יעילות ההדבקה באמצעות ביטוי GFP קונטורי.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי הדרך ליצירת תאי TIL אנושיים מתאי TIL של מלנומה.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-human-melanoma-tumor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הדור של לימפוציטים T מ המושרה גזע pluripotent (שב"ס) תאים נותן גישה חלופית של שימוש בתאי גזע עובריים על חיסוני מבוססי תאים T. השיטה מלמדת כי על ידי ניצול...

התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T

כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הדור של iPSCs אדם ממ"ל של 3-4 דם היקפי באמצעות וקטור תכנות מחדש lentiviral אחת. תכנות מחדש של תאי דם זמינים ונגישים מבטיח להאיץ את הניצול של טכנולוגית iPSC ידי ההפיכה לנגישה לקהילת מחקר רחבה יותר.

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

סרטון זה מדגים בדיקה ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ספציפיים לגידול (iPSC) הנגזרים מתאי CD8αβ+ T. תאי גזע מושרים ספציפיים לאנטיגן הגידול גדלים על חד-שכבה של תאי סטרומה ומתמיינים לתאי אב המטופויטיים (HPC). HPCs מתמיינים לתאי T חיוביים כפולים CD4+ CD8+ באמצעות מדיום התמיינות. תאים אלה מגורים לאחר מכן כדי ליצור תאי T חיוביים בודדים המבטאים CD8.

יצירת תאי CD8 T חיוביים בודדים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

מאמר זה מתאר את ההכנה של רקמה המתקבלת מלנומה טרי לתרבויות העיקריות של תאים, וכיצד להסיר זיהומים של אריתרוציטים ופיברובלסטים מתאי הגידול. לבסוף, אנו מתארים כיצד...

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

כתב יד זה מספק נוהל שלב אחר שלב לגזירה ותחזוקה של קרטינוציטים אנושיים משיער מרוט ויצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ללא אינטגרציה (hiPSCs) על ידי וקטורים אפיזומליים.

דור של תאי גזע האינטגרציה נטול האדם המושרה pluripotent שימוש קרטינוציטים נגזר שיער

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) מתאי T היקפיים אנושיים בתנאים נטולי הזנה באמצעות שילוב של וקטורים של וירוס מטריג'ל וסנדאי המכילים גורמי תכנות מחדש.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מתאי T ההיקפיים אנושיים באמצעות וירוס סנדאי בתנאים ללא מזין

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול בידול במבחנה לייצר מלנוציטים פיגמנט, מתאי גזע אנושיים pluripotent באמצעות רכס עצבי ואת melanoblast שלב ביניים באמצעות פרוטוקול מזין ללא, 25 יום.

מזין ללא גזירת &quot;מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש

מאמר זה מתאר את השיטה הרומן לייצר אנטיגן הגידול-ספציפי המושרה ביותר תאים גזע מהגרים הרתי (iTE) על ידי תלת מימדי (3D) מערכת התרבות הרתי. iTE הינם תת-קבוצה הומוגנית של תאי T הקשורים היטב לתאי T תמימים עם יכולת התפשטות, היווצרות הזיכרון ודיכוי הגידול.

תלת מימדי הרתי תרבות מערכת לייצר Murine המושרה תא גזע Pluripotent-הגידול הנגזר אנטיגן-מהגרים ספציפיים הרתי

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת אנטיגן גידול פונקציונלי-ספציפי המושרה pluripotent תא גזע בודד באמצעות OP9/DLL1 מערכת התרבות המשותף.

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

כאן, אנו מתארים מערכת תכנות מחדש ישירה ממוטבת עבור מלנוציטים ומערכת אריזה מרוכזת של וירוסים ביעילות גבוהה המבטיחה תכנות מחדש ישיר חלק.

תכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים של עכברים למלנוציטים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים שמקורם בחולי מלנומה על ידי תרבית תרחיפים של תאים מנותקים מרקמות מלנומה טרייה. אורגנואידים אלה משחזרים בנאמנות גידולים ספציפיים למטופל במבחנה, ומציעים גישה חדשנית לחקר מנגנוני דיכוי החיסון של הגידול, בדיקות סקר לתרופות, מנגנוני עמידות לתרופות וגישות מעקב אחר סרטן.

חשיפת הזדמנויות טיפוליות עם מודלים אורגנואידים שמקורם בחולה מלנומה

למד לייצר תאי גזע מושרים מלימפוציטים חודרי-גידול במלנומה. שיטה זו מאפשרת ייצור בלתי מוגבל של תאי T ספציפיים לגידול לטיפול אימונותרפי במלנומה גרורתית.

דור של תאי גזע מושרים ממלנומה האדם שחדר-גידול לימפוציטים

גלה סרטונים נוספים