בונה אלגינט Layered: פלטפורמה עבור Co-תרבות של אוכלוסיות תאים הטרוגניות
7 באוגוסט 2016
הנדסה וניתוח של רקמות נושאות עומס עם אוכלוסיות תאים הטרוגניות עדיין מהווים אתגר. כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת דיסקי הידרוג'ל אלגינט דו-שכבתיים כפלטפורמה לתרבית משותפת של אוכלוסיות תאים מגוונות בתוך מבנה אחד.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור באופן הדיר דיסקים של הידרוג'ל אלגינאט דו-שכבתיים לצורך חקירת הקשרים בין אוכלוסיות תאים שונות במהלך תרבית משותפת (co-culture) בתלת-ממד. שיטה זו מקלה על חקר האינטראקציות בין מספר אוכלוסיות תאים בתרביות תלת-ממדיות הטרוגניות מבחינה מרחבית, דבר שיכול לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בהנדסת רקמות ובפיזיולוגיה של רקמות נושאות עומס. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מציעה דרך פשוטה, חסכונית וניתנת לשחזור לבניית הידרוג'לים של אלגינאט רב-שכבתיים המוזרעים בתאים, אשר מבנהם תומך בגירוי מכני.
את הפרוצדורה תדגים פונאם שארמה, סטודנטית לתואר מתקדם מהמעבדה שלי. כדי להכין את דיסקי האלגינאט, ראשית הניחו פיסת נייר סינון עבה על פלטת קצה בגודל של שלושה על שלושה אינץ', ולאחריה ממברנת מיקרו-מסננת לתאים. השתמשו בשפכטל סטרילי כדי להחליק את הממברנה ואת נייר הסינון.
לאחר מכן, הפכו את הערימה על ערימת נייר סופג והפעילו לחץ על החומרים כדי להסיר את עודפי תמיסת ה-calcium chloride. בשלב הבא, הניחו תבנית ליצירת ג'ל בעלת בארות גליליות מעל ממברנת המיקרו-נפה (microsieve membrane), והשתמשו בתפסני בינדר כדי להצמיד בעדינות את התבנית ללוח הקצה בצדדים הימני והשמאלי. כעת, הניחו פיסת נייר סינון עבה על לוח קצה קטן, ולאחריה פיסת ממברנת מיקרו-נפה, והפכו את הערימה כדי להסיר עודפי calcium chloride, כפי שהודגם כעת.
כאשר שני חלקי התבנית מוכנים, השביו מחדש 10⁶ תאים רלוונטיים למיליליטר של מצע אלגינאט סטרילי. התערובת תיראה עכורה באופן הומוגני כאשר התאים יתפזרו כראוי. לאחר מכן, העבירו 130 µL של תאים בטיפות לבארות בודדות בקוטר 6 mm ובגובה 3 mm בחלק התחתון של מבנה התבנית.
מעטפת קעורה (meniscus) קמורה קלה צריכה להיות גלויה מעל קצהו של כל באר. כאשר כל התאים נזרעו, השתמשו בשפכטל סטרילי כדי להחליק בזהירות את החצי העליון של מבנה התבנית. לאחר מכן, הפכו את התבנית כך שמעטפת המיקרו-סינון (microsieve membrane) תהיה מעל הבארות, והניחו את התבנית על גבי הבארות, תוך הקפדה על כיסוי מלא של הבארות המכילות את תערובות התאים והאלגינאט.
כאשר התבנית במקומה, הרימו את מבנה התבנית הטעון, ובעודכם לוחצים בחוזקה על המרכז, הצמידו תסביכי נייר לשני הצדדים הנותרים של המבנה כדי להדק את החלקים העליון והתחתון של התבנית. תמיסות האלגינאט עם התאים צריכות להיות מקובעות בבטחה בתוך הבארות. לאחר מכן, טבלו את מבנה התבנית כולו בתוך אמבט של calcium chloride בריכוז 102 millimolar, בתוך מנדף תרביות תאים בטמפרטורת החדר, למשך 90 דקות.
בסיום הדגירה, העבירו את המבנה אל ערימה של נייר סופג והסִירו את שני תפסני הנייר המקבעים את לוחית הקצה העליונה לתבנית. הפרידו בין שני חצייה של המבנה. ההידרוג'לים שנוצרו בבארות לא אמורים להכיל בועות, ועליהם למלא את הבארות באופן מלא.
הסרו את שני תפסני הנייר שנותרו והפרידו את התבנית המכילה את ההידרוג'ל מלוח הקצה הנותר. באמצעות שפכטל, עקבו בזהירות אחרי קצוות הבארים המכילות את ההידרוג'לים כדי לשחרר אותם בעדינות. לאחר מכן, העבירו את ההידרוג'לים ישירות לאמבט של DPBS עם calcium chloride ו-magnesium chloride.
לאחר דקה אחת עד חמש דקות, העבירו את ההידרוג'לים לבארות בודדות בלוח של שש בארות המכיל מספיק תמיסת מצע גידול לבזיליקום כדי להטביע את הג'לים לחלוטין למשך שעה אחת לפחות ב-37 degrees Celsius וב-5% CO2. במהלך 30 הדקות האחרונות של הדגירה, השתמשו בתפסני משרד כדי להצמיד את התבנית בעלת הבארות שגובהן מחצית מגובה תבנית עיצוב הג'ל ללוח קצה מאלומיניום בגודל 3x3 אינץ' או 3x1.5 אינץ' בצדדים השמאלי והימני, כדי ליצור תבנית חיתוך. לאחר מכן, צרו את תבנית ההשמה (annealing mode) על ידי הצמדת התבנית בעלת הבארות שקוטרן גדול ב-3 mm מקוטר בארות תבנית עיצוב הג'ל ללוחות קצה מאלומיניום בגודל 3x3 אינץ' בצדדים השמאלי והימני.
כעת, העבירו את ההידרוג'לים לבארות של תבנית החיתוך. כל ג'ל צריך להתאים באופן הדוק לבאר, כאשר מחצית מהג'ל בולטת מעל התבנית. השתמשו בסכין מנתחים כדי לחתוך לאורך פני התבנית ובכך לחתוך את ההידרוג'ל לשניים.
הפכו את החצי העליון של הג'ל והניחו אותו בתוך באר של תבנית פתוחה. פיסת הג'ל צריכה להתאים בדיוק לבאר, כך ששני החצאים יהיו כעת בגובה התבנית, כאשר המשטח הפנימי החתוך גלוי. לאחר מכן, הניחו פיסת ממבנה מיקרו-מסננת (microsieve membrane) יבשה של תאי רשת מעל הבארה, תוך וידוא שהממברנה נמצאת במגע עם כל חצאי הג'ל המיועדים להלחמה (annealing), וכסו את הממברנה בפיסת נייר סינון עבה.
כאשר הג'לים מכוסים לחלוטין, הרוו את נייר הסינון בנתרן ציטראט בתוספת EDTA, והדגירו את הג'לים בטמפרטורת החדר. לאחר דקה אחת, השליכו את ממבני המיקרו-סינוק של התאים ואת נייר הסינון העבה, והסירו את תפסני הנייר. לאחר מכן, פתחו את התבנית והעבירו חצי ג'ל לתבנית חימום (annealing mold) מוכנה, כאשר הצד החתוך פונה כלפי מעלה.
באמצעות שפכטל, העבירו חצי ג'ל מטופל שני על הג'ל הראשון, כך שהמשטח החתוך יהיה במגע עם המשטח החתוך של הג'ל הראשון. לאחר שכל הג'לים הוצבו, השתמשו בשפכטל כדי ללחוץ בעדינות על הג'לים להוצאת בועות אוויר, וטבלו בזהירות את תבנית ההשחיה (annealing mold) לאמבט calcium chloride. לאחר 30 דקות, העבירו את תבנית ההשחיה על ערימה של נייר סופג והסירו את תפסני הקיבוע.
לאחר מכן, הפרד את התבנית מלוח הקצה והעבר את הג'לים לזמן קצר לאמבט DPBS, ולאחריו טבול אותם במצע תרבית תאים מתאים. ג'לים דו-שכבתיים שהושלמו מראים הפרדה ראשונית מלאה של אוכלוסיות התאים, כפי שנראה בתמונה זו של תאי 293 FT המסומנים בצבעי מעקב לתאים בירוק או אדום. החיות של תאי גזע מזנכימליים אנושיים שהוטמעו לאחר ההלחמה (annealing) היא גבוהה בתוך הידרוג'לים שכבתיים, בדומה לחיות התאים שנצפתה בהידרוג'לים במסה (bulk hydrogels).
לאחר בידוד מאמץ השיא מכל מחזור במהלך דחיסה מחזורית ללא אילוץ במשך ארבע שעות, הידרוג'לים שכבתיים נטולי תאים מראים תגובת מאמץ לדחיסה המחזורית שהיא קטנה משמעותית בעוצמתה בהשוואה להידרוג'לים נטולי תאים שאינם שכבתיים, אף על פי ששני סוגי ההידרוג'ל נותרים שלמים לאחר שבעה ימי תרבית. ברגע שהטכניקה תשלט, כולל הכנת כל החומרים, ניתן להשלימה בפחות מארבע שעות וחצי אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לעבוד בצורה מחושבת ואיטית כדי למנוע שגיאות, וכדי לעקוב בקלות רבה יותר אחר הדגימות השונות.
בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון גרייה מכנית וצביעה אימונוהיסטוכימית כדי להשיב על שאלות נוספות בנוגע לאינטראקציות בין אוכלוסיות התאים השונות במטריצות החוץ-תאיות שעשויות להיווצר. טכניקה זו תאפשר לחוקרים בתחומי המכנוביולוגיה והנדסת הרקמות לחקור בקלות רבה יותר את הקשר בין אוכלוסיות תאים שונות, כגון תאי גזע מזנכימליים, כונדרוציטים ותאי nucleus pulposus. זכרו כי עבודה עם חפצים חדים, חומרים ביולוגיים, ובמיוחד תאים אנושיים, עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים בעת ביצוע פרוצדורה זו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה ליצירת דיסקים של הידרוג'ל אלגינט דו-שכבתי לצורך חקר האינטראקציות בין אוכלוסיות תאים מגוונות בתרבית משותפת (co-culture) בתלת-ממד. הטכניקה נועדה להקל על מחקר בהנדסת רקמות ובפיזיולוגיה של רקמות נושאות עומס.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- הנדסת רקמות
- תרבית תאים
- טכנולוגיית הידרוג'ל
רקע
- רקמות נושאות עומס הן מורכבות ודורשות גישות הנדסיות חדשניות.
- מערכות של תרביות משולבות (Co-culture) יכולות לספק תובנות לגבי אינטראקציות תאיות.
- תרביות בתלת-ממד מדמות תנאים פיזיולוגיים טוב יותר מאשר תרביות דו-ממדיות.
- הידרוג'לים של אלגינט הם תואמים ביולוגית ורב-גמישיים למחקרי תאים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה ניתנת לשחזור ליצירת הידרוגלים של אלגינאט בעלי שתי שכבות.
- בחינת הקשרים בין אוכלוסיות תאים שונות.
- העמקת ההבנה של יישומים בהנדסת רקמות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סידור שכבות של נייר סינון וממברנת מיקרו-מסננת לתאים על פלטה קצית.
- שימוש בשפכטל סטרילי להחלקת הממברנה ונייר הסינון.
- יצירת הידרוג'לים של אלגינט רב-שכבתיים להזרעת תאים.
- סיוע בגירוי מכני של המבנים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת יצירה של הידרוגלים בעלי מבנה תומך.
- היא תומכת בחקר של אינטראקציות תאיות בלתי הומוגניות מרחבית.
- הטכניקהי היא כלכלית ופשוטה ליישום.
- התהליך מודגם על ידי סטודנט לתואר מתקדם, מה שמדגיש את ערכו הלימודי.
מסקנות
- שיטה זו מהווה כלי בעל ערך למחקר בהנדסת רקמות.
- היא משפרת את ההבנה של דינמיקה של אוכלוסיות תאים בתרביות תלת-ממדיות.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בטכניקה זו עבור יישומים מגוונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מבני הידרוג'ל מאלגינט שכבתיים מאפשרים תרבית משותפת (co-culture) מרחבית ומדויקת של אוכלוסיות תאים הטרוגניות, ובכך תומכים במחקרים מכניסטיים של אינטראקציות בין-תאיות במודלים של רקמות נושאות עומס. פלטפורמה זו נותנת מענה לאתגר של הנדסת אזורי רקמה השונים מבנית מבחינה מבנית, ומספקת ביטחון חיזוי עבור מחקר ופיתוח בשלבים מוקדמים של הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית. היכולת לשחזר ולהרחיב את השיטה הופכת אותה לנכס רב-פעמי עבור תהליכי גילוי וזרימות עבודה פרה-קליניות המתמקדות במערכות רקמה מורכבות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של אינטראקציות בין תא לתא ובין תא למטריקס בסביבות תלת-ממדיות הרלוונטיות פיזיולוגית.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מידול של הטרוגניות מרחבית הנמצאת ברקמות טבעיות.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של סוגי תאים מועמדים ליישומים של הנדסת רקמות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת פלטפורמה סטנדרטית לבדיקות co-culture הדירות עם פלטים כמותיים.
- מאפשרת הכנה של מבנים מתוקפים לצורך גירוי מכני ובדיקה פנוטיפית בהמשך.
- תומכת ביכולת הרחבה של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה עבור סוגי תאים ותנאים ניסיוניים מרובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים של רקמות הרלוונטיים למחלה לצורך גילוי ביומרקרים תרגומיים.
- שומר על רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות למחקרי מנגנון תחת עומסים מכניים רלוונטיים פיזיולוגית.
- מפחית את הסיכון התרגומי באמצעות תמיכה במידול חזוי של תגובות רקמה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו של הידרוג'ל שכובתי משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשרת מחקרים מונחים היפותזה, פיתוח בדיקות ומודלים תרגומיים של מערכות רקמות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של אינטראקציות בין אוכלוסיות תאים וחישוש מכני (mechanosensing) ברקמות מהונדסות.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור להערכת חיוניות תאים ותגובה מכנית.
- אנליזה: מספק פלטים מדידים, כגון תגובת מאמץ תחת דחיסה מחזורית, לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלב הגילוי לאישור פרה-קליני באמצעות מידול של סביבות רקמה נושאות עומס.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה מודולרית וניתנת להרחבה, הניתנת להתאמה למגוון מחקרי הנדסת רקמות ותרביות משולבות (co-culture).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בהשערות של הנדסת רקמות ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה של תרביות משולבות (co-culture) ושיפור השחזוריות בין צוותי מחקר ופיתוח.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות בנוגע להמשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ואת היעילות ההונית על ידי אפשור הפחתת סיכונים מוקדמת של מודלי רקמות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם-סיכונים של תוכניות הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרבית תאים בתלת-ממד ובטיפול בהידרוגלים.
- נדרשת גישה למתקני תרבית תאים, לציוד לגירוי מכני ולכלי דימיון.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים להכנה וניתוח של המבנה.
- ניתן להתאמה לסוגי תאים ולמודלים של רקמות שונים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- טיפול זהיר וביצוע מחושב של זרימת העבודה הם קריטיים לשחזור התוצאות ולשלמות הדגימה.
