זיהוי תפוקה גבוהה של חיידקים פולימרים דוחה עבור אביזרים ומכשור רפואי

המטרה הכוללת של טכניקת מיקרו-מערך פולימרים זו היא לזהות פולימרים סינתטיים המסוגלים לווסת את ההתקשרות של חיידקים למשטחים אביוטיים. שיטה זו יכולה לסייע להאיץ את ההתקדמות בגילוי של ביו-חומרים פשוטים וחסכוניים המעכבים היצמדות חיידקים למכשירים רפואיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו בהשוואה למחקר ביו-חומרים קונבנציונאלי של בדיקת חומר אחד בכל פעם הוא היכולת שלה לסנן מאות פולימרים בו זמנית בנכס אחד.

כדי להתחיל, הכינו תמיסות פולימריות והוסיפו אותן לבארות של צלחת בת 384 בארות, על פי פרוטוקול הטקסט. צור שגרה להדפסת פולימרים בריבוע המורכב מ-1536 נקודות, המסודרות כ-48 שורות ו-32 עמודות, והדפס 32 תמיסות פולימר בכל פעם, כך שניתן יהיה לעצור את המדפסת לאחר הדפסת כל חלק כדי לאפשר ניקוי של הסיכות. כעת הנח את השקופיות המצופות אגרוז על הפלטפורמה והקפיד על איטום ואקום טוב כדי להחזיק את המגלשות במקומן.

כדי לכוונן את ראש ההדפסה כך שכל הפינים יהיו באותו גובה, הורד את הראש באופן ידני על מגלשת זכוכית וודא שהפינים נעים כלפי מעלה בו-זמנית. הנח את צלחת הבאר על מחזיק הצלחת עם באר A1 בפינה השמאלית העליונה של המחזיק וודא שלוחית הבאר קבועה היטב. ודא שהמגלשה וצלחת הבאר נמצאים במקומם כאשר תתבקש.

הדפס קטע אחד בכל פעם, מה שמאפשר ניקוי של הפינים בין המקטעים. לאחר מכן השתמש במגבת נייר טבולה באצטון כדי לנקות היטב את הסיכות. ואחריו נייר טישו יבש כדי להבטיח שהפינים יבשים לחלוטין.

כאשר המיקרו-מערכים מודפסים במלואם, הניחו אותם במחזיק שקופיות והעבירו אותם לתנור ואקום, המוגדר לייבוש של 40 מעלות צלזיוס, כדי להסיר את ה-N&P בכתמי הפולימר. לאחר מכן השתמש באור UV כדי לעקר את הצלחות למשך 30 דקות. לפני חיסון שקופיות בחיידקים, בצע מדידה של פלואורסצנטיות הרקע לפי פרוטוקול הטקסט.

לאחר תרבית והכנת חיסון למיקרו-מערכים, על פי פרוטוקול הטקסט, הנח את המיקרו-מערכי הפולימר המעוקר UV בצלחות מלבניות של ארבע בארות והוסף שישה מיליליטר של תרביות חיידקים מעורבות. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה למשך חמישה ימים. לאחר הדגירה, השתמש ב-PBS כדי לשטוף בעדינות את המיקרו-מערכים פעמיים.

לאחר מכן הוסף מיקרוגרם אחד למיליליטר DAPI ב-PBS ודגר למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו את המיקרו-מערכים לצלחת טרייה של ארבע בארות, כסו את המיקרו-מערכים ב-PBS ואז סובבו בעדינות. לאחר מכן החלף את ה-PBS פעם אחת וחזור על הכביסה.

לאחר השטיפה, יבש את המיקרו-מערכים תחת זרימת אוויר ולאחר מכן מרח סרט איטום והצמד החלקות כיסוי זכוכית על שקופיות המיקרו-מערך. כאשר הדבק יבש, השתמש באתנול של 70% כדי לעקר את המשטח החיצוני. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, המצויד בסובייקטיבי פי 20, צלם תמונות בודדות עבור כל נקודת פולימר בשדה בהיר ובתעלות רצועות.

לציפוי תלושי כיסוי בפולימרים, הכינו תמיסות של פולימרי HIT בטטרהידרופורן או ממס מתאים אחר. בעזרת ציפוי ספין, מעיל מסתובב כיסוי זכוכית עגול מחליק בגודל מתאים עם תמיסות הפולימר ב-2000 סל"ד למשך עשר שניות. יבש את הכיסוי המצופה מחליק בתנור הסעה בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

והשתמש באור UV כדי לעקר את החלקות הכיסוי למשך 30 דקות לפני החיסון בחיידקים. הנח את החלקות הכיסוי המעוקרות UV בצלחת סטנדרטית של 12 או 24 בארות ודגירה עם חיידקים כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. לאחר הדגירה, השתמש במאגר קקודילאט מולארי 0.1 כדי לשטוף את החלקות הכיסוי המצופות פעמיים ולאחר מכן עם 2.5% משקל לנפח גלוטרלדהיד ו-0.1 מאגר קקודילאט מולרי, תקן את הדגימות למשך שעתיים.

לאחר תיקון החלקות הכיסוי עם 1% טטרוקסיד אוסמיום למשך שעה בטמפרטורת החדר. לפני ייבוש בסדרת אתנול למשך 30 דקות בכל ריכוז. לאחר מכן, עם ציפוי מקרטע ותערובת סגסוגת זהב עד פלטינה של 60 עד 40%, מצפים את הדגימות באמצעות זרם של 30 מיליאמפר ואקום של 0.75 טור.

לאחר צילום תמונות עם SEM, השווה ויזואלית תמונות של החלקות הכיסוי הלא מצופות ואלה המצופות באגרוז או בפולימרי HIT כדי לאשר את יכולות הקישור או הדחייה של החיידקים של הפולימרים. כדי להעריך ממיסים שונים לתאימות לחלק הקצה של הצנתר, כמו גם ליכולתם להמיס את פולימר HIT, טבלו את חלקי הקטטר בממיסים ודגרו למשך 12 שעות לפני הערכה ויזואלית של תקינות הצנתר ובהירות הממס. כדי לנתח התקשרות חיידקים בצנתרים על ידי SEM, הכינו תמיסת פולימר של 10% באצטון.

לחץ על קצה מיקרופיפטה של 200 מיקרוליטר לתוך החלק האמצעי של החלק החתוך של הצנתר כדי להחזיק אותו ולתקוע את החתיכה בתמיסת הפולימר למשך כ-30 שניות. יבש את החלק המצופה בתנאי סביבה למשך 30 דקות ולאחר מכן החל ציפוי שני על ידי טבילת חתיכת הקטטר שוב בתמיסת הפולימר וייבש למשך הלילה בתנאי הסביבה. לאחר הדגירה של חלקי קטטר מצופים ולא מצופים ב-LB מחוסן, על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש במיליליטר אחד של PBS כדי לשטוף את הצנתרים.

לאחר מכן השתמש ב-10% פרפורמלדהיד ב-PBS כדי לתקן את החיידקים למשך 30 דקות. לאחר שטיפה עם PBS, השתמש ב-DAPI כדי להכתים את החיידקים על חלקי הצנתר למשך 20 דקות. לפני הכביסה עם מיליליטר אחד של PBS.

שימו לב לסידור הדגימות בתא. באמצעות ההגדרות הבאות, צלם תמונות קונפוקליות של חלקי הצנתר. השלם את ההדמיה הקונפוקלית על ידי ערימת z של 50 תמונות לאורך 100 מיקרומטר של הצנתר.

לאחר טיפול UV ודגירה עם חיידקים, השתמש במיליליטר אחד של PBS כדי לשטוף את החלקים פעמיים ולהעביר אותם לצלחות של 48 בארות המכילות 10% פורמלדהיד ב-PBS למשך 30 דקות. לאחר תיקון הדגימות, בצע שטיפה נוספת עם PBS וייבש במהלך הלילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הרכיבו על דודים עם דיסקי פחמן מוליכים והשתמשו בציפוי מקרטע לציפוי זהב.

לפני ההדמיה, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. איור זה מראה את ההתקשרות של חיידקים למספר פולימרים כפי שנקבע על ידי ניתוח מיקרו-מערך. כתמים המודפסים ללא פולימר פועלים כבקרה שלילית מכיוון שאגרוז מתנגד מאוד לקשירת חיידקים ולכן הקרינה נמוכה מאוד.

הפולימרים המוצגים הם קשירת סגסוגת, אם כי ברוב המקרים, תכונות הדחייה של פולימר משתנות באופן משמעותי בין מיני החיידקים שנבדקו. זה משקף את ההבדלים הרחבים בין מנגנוני ההתקשרות בין מינים שונים. ניתן לזהות בקלות את הפולימרים בעלי הקישור הנמוך בהשוואה לאגרוז.

פולימרים בעלי קשירה גבוהה עשויים להיות מזוהים במערך ויכולים לשמש כבקרות חיוביות לניסויים הבאים. עבור פולימרים שאינם מראים פלואורסצנציה אוטומטית בערוץ DAPI, ניתן לבצע השוואה איכותית של תמונות הספוט באופן חזותי. בוצעו ניסויים בקנה מידה לבדיקת ציפוי משטחים גדולים יותר כדי לאשר את תכונות דוחי החיידקים של 22 פולימרים מתאימים שזוהו.

מוצגות כאן, הדגימות בעלות הביצועים הטובים ביותר המשמשות לציפוי פתקי כיסוי זכוכית כפי שנותחו על ידי SEM. נתונים אלה מראים פרוסות קטטר שנותחו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית ו-SEM. לשתי השיטות המיקרוסקופיות יש את היתרון בכך שהן מאפשרות ספירת תאים ישירה על פני השטח ומספקת נתונים חד משמעיים מכיוון שהפחתה בהתקשרות התאים נראית בקלות.

לאחר הליך זה, ניתן לבדוק את רכיבי הסרום או הדם כדי לקבוע את השפעתם על קשירת החיידקים. ניתן להשתמש במודל של בעלי חיים על מנת להעריך את הפוטנציאל של ציפוי הפולימר לשימוש קליני. אל תשכח שעבודה עם כימיקלים ואורגניזמים פתוגניים עלולה להיות מסוכנת.

ויש לבצע בקרות נחוצות במהלך הטיפול והסילוק כדי להפחית סיכונים אישיים וסביבתיים.