זיהוי תפוקה גבוהה של חיידקים פולימרים דוחה עבור אביזרים ומכשור רפואי

המטרה הכללית של טכניקת מערך המיקרו של הפולימרים היא לזהות פולימרים סינתטיים המסוגלים לווסת את היצמדותן של חיידקים למשטחים אביוטיים. שיטה זו יכולה לסייע בהאצת ההתקדמות בגילוי חומרים ביולוגיים פשוטים ובעלי עלות-תועלת המעכבים היצמדות חיידקים למכשירים רפואיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו, בהשוואה למחקר חומרים ביולוגיים קונבנציונלי שבו נבחן חומר אחד בכל פעם, הוא היכולת לסרוק מאות פולימרים בו-זמנית בנכס בודד.

ראשית, הכינו תמיסות פולימר והוסיפו אותן לבארים של פלטת 384 בארות, בהתאם לפרוטוקול הכתוב. צרו שגרה להדפסת פולימרים בארבעה העתקים המורכבת מ-1536 נקודות, המסודרות כ-48 שורות ו-32 עמודות, כאשר מדפיסים 32 תמיסות פולימר בכל פעם כדי שניתן יהיה להפסיק את המדפסת לאחר הדפסת כל חלק לצורך ניקוי הפינים. כעת הניחו את השקפים המצופים באגרוז על הפלטפורמה וודאו שישו sealing ואקום תקין להחזקת השקפים במקומם.

כדי לכוון את ראש ההדפסה כך שכל הפינים יהיו באותו גובה, הורד את הראש ידנית על עלית זכוכית ואשר שהפינים עולים בו-זמנית. הנח את פלטת הבארים על מחזיק הפלטות כאשר באר A1 נמצאת בצד ימין למעלה של המחזיק, וודא שהפלטה מקובעת היטב. אשר שהעלית ופלטת הבארים נמצאות במיקומן כאשר תתבקש לכך.

הדפיסו חלק אחד בכל פעם, כדי לאפשר ניקוי של הפינים בין החלקים. לאחר מכן, השתמשו בנייר סופג טבול באצטון כדי לנקות את הפינים ביסודיות. לאחר מכן, השתמשו בנייר סופג יבש כדי להבטיח שהפינים יבשים לחלוטין.

כאשר הדפסת המיקרומערכים הושלמה במלואה, הניחו אותם במחזיק שקופיות והעבירו אותם לתנור ואקום, המכוון ל-40 °C לייבוש, כדי להסיר את ה-N&P מנקודות הפולימר. לאחר מכן, השתמשו באור UV כדי לעקר את הפלטות למשך 30 דקות. לפני הדבקת חיידקים על השקופיות, בצעו מדידה של פלואורסצנציית רקע בהתאם לפרוטוקול הכתוב.

לאחר גידול והכנת התרביות להזריקה למערכי המיקרו-מערכים (microarrays), בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הניחו את המיקרו-מערכים הפולימריים שעקרו ב-UV בתוך פלטות מלבניות בעלות ארבעה בארות והוסיפו 6 milliliters של תרבויות חיידקים מעורבבות. דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C עם ערבוב עדין למשך חמישה ימים. לאחר הדגירה, השתמשו ב-PBS כדי לשטוף בעדינות את המיקרו-מערכים פעמיים.

לאחר מכן, הוסיפו 1 µg/mL של DAPI ב-PBS והדרימו למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו את המערכים הזעירים (microarrays) לפלטה חדשה בעלת ארבעה בארות, כסו את המערכים ב-PBS וסובבו אותם בעדינות. לאחר מכן, החליפו את ה-PBS פעם אחת וחזרו על השטיפה.

לאחר השטיפה, ייבשו את המערכים המיקרוסקופיים (microarrays) תחת זרימת אוויר, ולאחר מכן הצמידו סרט איטום וחברו כיסויי זכוכית לשקופיות המערך המיקרוסקופי. כאשר הדבק יבש, השתמשו ב-70% ethanol לסטריליזציה של השטח החיצוני. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה, המצויד בעדשה אובייקטיבית 20x, צלמו תמונות בודדות עבור כל נקודת פולימר בשדה בהיר (bright field) ובערוצים רצועתיים (strappy channels).

כדי לצפות זכוכית כיסוי בפולימרים, הכינו תמיסות של פולימרי HIT בטטרהידרופוראן או בממס מתאים אחר. בעזרת spin coater, בצעו ציפוי סיבובי (spin coating) של זכוכית כיסוי עגולה בגודל מתאים עם תמיסות הפולימר במהירות של 2000 RPM למשך עשר שניות. ייבשו את זכוכית הכיסוי המצופה בתנור קונבקציה בטמפרטורה של 40 °C למשך לילה.

השתמשו באור UV כדי לעקר את לביבות הכיסוי למשך 30 דקות לפני ההדבקה בחיידקים. הניחו את לביבות הכיסוי שעוקרו ב-UV בתוך פלטה סטנדרטית של 12 או 24 בארות והדגירו אותן עם חיידקים כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. לאחר ההדגרה, השתמשו בבופר cacodylate בריכוז 0.1 molar כדי לשטוף את לביבות הכיסוי המצופות פעמיים, ולאחר מכן קבעו את הדגימות למשך שעתיים באמצעות glutaraldehyde בריכוז 2.5% weight per volume ובבופר cacodylate בריכוז 0.1 molar.

בצעו קיבוע לאחר הסתירה (Post-fixation) של כיסויי הזריקה ב-1% osmium tetroxide למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצעו דהידרציה של הדגימות בסדרת אתנול למשך 30 דקות בכל ריכוז. לאחר מכן, השתמשו במכשיר לציפוי בבזיקה (sputter coater) ובסגסוגת של 60% זהב ו-40% פלטינה כדי לצפות את הדגימות בזרם של 30 milliamps ובואקום של 0.75 torr.

לאחר צילום ב-SEM, השוו חזותית בין התמונות של לוחות הכיסוי ללא הציפוי לאלו המצופים באגרוז או בפולימרי HIT, כדי לאשש את יכולות הקישור או הדחייה של החיידקים על ידי הפולימרים. כדי להעריך ממסים שונים לבחינת התאימות שלהם עם חלק הקצה של הקטטר, וכן את יכולתם להמיס את פולימר ה-HIT, טבלו את חלקי הקטטר בממסים והדגירו למשך 12 שעות לפני הערכה חזותית של שלמות הקטטר וצלילות הממס. לניתוח היצמדות חיידקים על קטטרים באמצעות SEM, הכינו תמיסת פולימר בריכוז 10% באצטון.

הדחף טיפ של מיקרופיפט של 200 microliter למרכזו של קטע הקטטר הגזור כדי להחזיקו, וטבול את הקטע בתמיסת הפולימר למשך כ-30 שניות. ייבש את הקטע המצופה בתנאי סביבה למשך 30 דקות, ולאחר מכן החל בשכבת ציפוי שנייה על ידי טבילה חוזרת של קטע הקטטר בתמיסת הפולימר וייבוש למשך לילה בתנאי סביבה. לאחר דגירה של קטעי קטטר מצופים ולא מצופים ב-LB מוחדר, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמש ב-one milliliter של PBS לשטיפת הקטטרים.

לאחר מכן, השתמש ב-10% paraformaldehyde ב-PBS כדי לקבע את החיידקים למשך 30 דקות. בעקבות שטיפה ב-PBS, השתמש ב-DAPI כדי לצבוע את החיידקים על חלקי הקטטר למשך 20 דקות. לפני השטיפה ב-one milliliter של PBS.

בחנו את סידור הדגימות בתא. באמצעות ההגדרות הבאות, צלמו תמונות קונפוקאליות של חלקי הקטטר. השלימו את ההדמיה הקונפוקאלית על ידי ביצוע z-stacking של 50 תמונות לאורך 100 micrometer של הקטטר.

בעקבות טיפול ב-UV ודגירה עם חיידקים, השתמשו במיליליטר אחד של PBS כדי לשטוף את החלקים פעמיים, והעבירו אותם ללוחיות בעלות 48 בארות המכילות 10% formaldehyde ב-PBS למשך 30 דקות. לאחר קיבוע הדגימות, בצעו שטיפה נוספת ב-PBS והניחו לייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, קבעו את הדגימות על גבי stubs עם דיסקים של פחמן מוליך והשתמשו במכשיר sputter coater לציפוי בזהב.

לפני הדמיה, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. איור זה מראה היצמדות חיידקית למספר פולימרים כפי שנקבע באמצעות אנליזת מיקרו-מערך. נקודות שהודפסו ללא פולימר משמשות כביקורת שלילית, מכיוון שאגרוז עומד בעקשריות רבה בפני קישור חיידקים ולכן הפלואורסצנציה נמוכה מאוד.

הפולימרים המוצגים הם בעלי קישור לסבך, אם כי ברוב המקרים, תכונות הדחייה של פולימר משתנות באופן משמעותי בין מיני החיידקים שנבדקו. הדבר משקף את ההבדלים הרבים בין מנגנוני ההיצמדות של מינים שונים. ניתן לזהות בקלות את הפולימרים בעלי הקישור הנמוך באמצעות השוואה לאגרוז.

סביר להניח שפולימרים בעלי קישוריות גבוהה יזוהו במערך, וניתן להשתמש בהם כביקורות חיוביות לניסויים עוקבים. עבור פולימרים שאינם מראים פלואורסצנציה עצמית בערוץ ה-DAPI, ניתן לבצע השוואה איכותית של תמונות הנקודות באופן חזותי. ניסויי הרחבה לבדיקת ציפוי של משטחים גדולים יותר בוצעו כדי לאשר את תכונות דחיית החיידקים של 22 פולימרים מתאימים שזוהו.

מוצגים כאן הדגימות עם הביצועים הטובים ביותר ששימשו לציפוי לוחות כיסוי מזכוכית, כפי שנותחו באמצעות SEM. איורים אלה מציגים פרוסות של קטטרים שנותחו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקאלית ו-SEM. לשתי השיטות המיקרוסקופיות יש את היתרון של מתן אפשרות לספירה ישירה של תאים על פני השטח, מה שמספק נתונים חד-משמעיים מכיוון שפגיעה בהיצמדות התאים נראית בבירור.

בעקבות נוהל זה, ניתן לבחון רכיבי נסיק או דם כדי לקבוע את השפעתם על קישור חיידקים. ניתן להשתמש במודל בעלי חיים כדי להעריך את הפוטנציאל של ציפויי הפולימר לשימוש קליני. זכרו כי עבודה עם כימיקלים ואורגניזמים פתוגניים עלולה להיות מסוכנת.

ויש להפעיל את הבקרות הדרושות במהלך הטיפול והסילוק כדי לצמצם סיכונים אישיים וסביבתיים.