בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת
January 16th, 2017
כתב יד זה מתאר גישה לבידוד RNPs קוגנטיים נבחרים הנוצרים בתאים אוקריוטיים באמצעות העשרה מכוונת אוליגונוקלאוטידים ספציפית. אנו מדגימים את הישימות של גישה זו על ידי בידוד RNP מקביל הקשור לאזור הרטרו-ויראלי 5' הלא מתורגם המורכב מ-DHX9/RNA הליקאז A.
המטרה הכוללת של טכניקת אימונו-משקעים RNA זו היא לבודד ולאפיין באופן סלקטיבי קומפלקסים של חלבוני RNA אנדוגניים הנוצרים בתאים אוקריוטיים באמצעות העשרה מכוונת אוליגונוקלאוטיד ספציפית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הבקרה שלאחר השעתוק, כגון הרכב חלבוני קשירת RNA המגדירים את חמשת ה-UTR העיקריים של תעתיק רטרו-ויראלי כדי לווסת את ביטוי הגנים שלו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לחוקר לבודד ולאפיין באופן סלקטיבי קומפלקס חלבון RNA ספציפי מעניין תוך שמירה על האפשרות לבצע ניתוח גלובלי יותר של RNP במורד הזרם.
ובכן, ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הבנה בסיסית של זיהומים נגיפיים ומחלות תאיות רבות. ומספק תובנה משמעותית לגבי מנגנוני הבקרה לאחר השעתוק של ביטוי גנים. זה יכול להיות מטרות תרופות חדשות ברות-קיימא.
לאחר תרבית תאים וביצוע משקעים חיסוניים של חלבון מתויג FLAG על פי פרוטוקול הטקסט, העבירו 60 מיקרוליטר לכל IP של תמיסת חרוזים מגנטית pro-TG לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.7 מיליליטר. הנח את הצינור על מתלה מגנטי והסר את תמיסת האחסון על ידי פיפטינג בזהירות. לאחר מכן הסר את הצינור מהמתלה.
הוסף 600 מיקרוליטר של מאגר כביסה 1x. והניחו את הצינור על מסובב קצה מעל קצה בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות, כדי לשטוף ולאזן את החרוזים. הנח את הצינור על המתלה המגנטי והסר את מאגר הכביסה.
לאחר מכן הוסף 10 נפחים של מאגר כביסה טרי פי אחד. הוסף נוגדן FLAG משקע חיסוני לחרוזים המגנטיים המאוזנים pro-TG. ואז סובב את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות, כדי להצמיד את הנוגדן המשקע את מערכת החיסון.
הנח את הצינור על המגנט והסר את הסופרנטנט. לאחר מכן הסר את הצינור מהמגנט והוסף מאגר כביסה פי 1 לחרוזים וסובב בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. חזור על שלב הכביסה פעמיים והסר את המאגר הסופי.
הסר את מדיום התרבות מהתאים על ידי שאיפה והשתמש ב -1.5 מיליליטר PBS קר כקרח כדי לשטוף את התאים פעמיים. בעזרת מגרד תאים עקורים את התאים הרטובים והדבקים. פיפטו את תרחיף התא לצינורות טריים ולאחר מכן צנטריפוגה את התרבית ב-226 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס, למשך ארבע דקות.
הוסף 375 מיקרוליטר של מאגר מלח נמוך קרח לכדור התא, ודגר את הדגימה על קרח למשך חמש דקות כדי לאפשר נפיחות. חשוב לנקוט משנה זהירות בעת הוספה והשעיה מחדש של כדור התא במאגר הליזיס הנמוך במלח, כדי להבטיח טבילה ונפיחות מוחלטת ללא הפרעה מכנית מוקדמת. כדי לאסוף את הליזאט של התא הציטופלזמי, הוסף 125 מיקרוליטר של מאגר ליזה קר כקרח, ולאחר מכן השתמש בהומוגנייזר Dounce מקורר מראש לביצוע עשר פעימות.
להומוגניזציה בכוח מספיק כדי לאפשר ליזה של קרום הפלזמה ומזהמים של הליזאט הציטופלזמי המשוחרר. אך הקפד לא להאריך יתר על המידה את השיבוש המכני ולהסתכן בזיהומים גרעיניים, שיבוש של קומפלקס חלבון RNA או אובדן שחרור סובב את ההומוגנאט במיקרופוגה במהירות מרבית למשך דקה אחת. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.7 מיליליטר שהיה על קרח.
קבע את ריכוז החלבון הכולל. שמור 10% לניתוח כתם מערבי, שישמש כבקרת קלט. כדי לבצע משקעים חיסוניים, הוסף את הנפח הרצוי של ליזט תאים שנקטף לחרוזים המצומדים של נוגדן המטרה.
בעזרת מאגר כביסה 1x, הביאו את הנפח הכולל עד 600 מיקרוליטר וסובבו את הדגימה בטמפרטורת החדר. לאחר 90 דקות של דגירה, הנח את צינור ה-IP על מתלה המגנט כדי לאסוף את החרוזים. לאחר מכן אספו את הסופרנטנט ושמרו אותו כזרימה.
לאחר מכן, הוסף 10 נפחים של מאגר כביסה NETN 150 קר כקרח לחרוזים מצומדים של RNP הקשורים לנוגדנים, וסובב את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. לאחר השעיה מחדש של מתחמי ה-RNP המשותקים במאגר כריכה 1x בהתאם לפרוטוקול הטקסט, התאם את הנפח הנותר ב-100 מיקרוליטר של מאגר כריכה קר כקרח 1x. ומחממים את הצינור בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.
כדי לבודד קומפלקסים של חלבון RNA קוגנטי, הוסף כ-30 אוליגו DNA נוקלאוטיד, המשלים את גבול שלושת הרצפים הראשוניים של ה-RNA המעניין. ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדינה. הוסף חמש עד עשר יחידות או RNase H לצינור ודגר את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כדי לבקע את ה-RNA מהכלאת ה-RNA DNA.
לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט המכיל את קומפלקסי ה-RNP שנלכדו המעניינים לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.7 מיליליטר. כדי לאסוף את ה-RNA המשקע החיסוני, יש להשעות מחדש מחצית מהדגימה הכוללת של קומפלקסי RNA שנלכדו ב-750 מיקרוליטר של מגיב חומצה גואנידיניום תיוציאנט. מוסיפים 200 מיקרוליטר כלורופורם לשפופרת, מנערים במרץ במשך 10 שניות ומדגרים בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות.
לאחר הצנטריפוגה, אוספים את השלב המימי בצינור טרי, ומוסיפים נפח שווה של איזופרופנול. מערבבים היטב ומדגרים את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך עשר דקות לפחות. הוסף לדגימה מיקרוליטר אחד של גליקול כחול ואחסן אותו בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשקעים יעילים או לעיבוד במועד עתידי.
צנטריפוגה של הצינור ב -16, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך עשר דקות. השתמש במיקרופיפטה P200 כדי לאסוף בזהירות ולזרוק את הסופרנטנט כדי לא להפריע לכדור ה-RNA. הוסף 500 מיקרוליטר של 75% אתנול לכל צינור.
מערבולת וצנטריפוגה את הצינורות למשך חמש דקות. אסוף בזהירות והשליך את הסופרנטנט כפי שהודגם זה עתה. יבש את הגלולה באוויר למשך שתיים-שלוש דקות והשתמש ב-100 מיקרוליטר מים ללא RNase כדי להשעות אותה מחדש.
החל 100 מיקרוליטר מדגימת ה-RNA על עמודת ניקוי RNA. ולעבד אותו על פי פרוטוקול היצרנים. לבסוף, יש להוציא את ה-RNA ב-30 מיקרוליטר מים נטולי RNase ולאחסן אותו בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים.
לבודד רכיבי בקרה לאחר שעתוק, או קומפלקסים של ריבונוקלאופרוטאין PCE, GAG, RNA, RHA הנוצרים בתאים מתרבים. משקעים חיסוניים של FLAG-MS2 RNP בוצעו בליזטים של תאי HECK293 שעברו טרנספטציה. התוצאות מראות משקעים יעילים של חלבון FLAG-MS2.
מכיוון ש-DHX9/RHA נמצא בקומפלקס RNP ולא בתוך בקרת האיזוטופ IgG, וגם לא בתוך הבקרה השלילית. מוצגים כאן כתמים מערביים מקומפלקסי DNA של RNase H מעוכלים. RNase H חתך את PCE GAG RNA, ושחרר את קומפלקס ה-RNP הקשור במיוחד לחמשת ה-UTR הראשוניים.
ה-RNPs הקשורים ל-DHX9/RHA הועשרו בנוזלים. חשוב לציין, ה-RNPs הקשורים ל-FLAG-MS2 נשארו עם החרוזים המצומדים של הנוגדנים. בניסוי זה, משקעים חיסוניים HO של לולאת הגזע MS2, המכילה PCE GAG RNA רטרו-ויראלי בתאים ובחומרי סיכה, אומתו על ידי RT-PCR ו-QRT-PCR.
התוצאות אישרו קשר נבחר בין DHX9/RHA לבין ה-UTR הרטרו-ויראלי, שהודגש כ-RNP ייחודי, חשוב לבקרת תרגום ממוקדת. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כחמש שעות, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע את כל השלבים ביעילות ובזהירות, כדי להבטיח תחזוקה של מתחמי RNP שלמים ובידוד של מתחם ה-RNP הספציפי המעניין.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ספקטרומטריית מסה ו-RNA-Seq, על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו קשר חלבון גלובלי עם RNA המטרה. וניתוח אזור או מלא של כל התמלילים המעורבים ב-RNP מסוים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום בקרת גנים לאחר שעתוק לחקור את קומפלקסי חלבון ה-RNA הייחודיים השולטים בתפוגת גנים נגיפיים פתוגניים ומנגנון כללי של בקרת ביטוי גנים תאי.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקצור מתחמי RNP תאיים שלמים ולקבוע את הרכבם באמצעות העשרה מכוונת אוליגונוקלאוטידים סלקטיבית. אל תשכח גם, עבודה עם וירוסים פתוגניים ודגימות ביולוגיות וכימיקלים מסוכנים כמו חומצה או פנול, עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט תמיד בכל אמצעי הזהירות, כגון ציוד מגן אישי מתאים בעת ביצוע הליך זה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
כתב היד הזה מתאר טכניקה של אימונופרציפיטציה של RNA כדי לבודד ולאפיין באופן סלקטיבי קומפלקסים של RNA-חלבון אנדוגניים בתאים אוקריוטיים. השיטה מתמקדת באזור ה-5' לא מתורגם של רטרווירוסים ומדגישה את התפקיד של DHX9/RNA helicase A.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה של RNA
- שליטה פוסט-תעתיקית
- ביטוי גנים ויראליים
רקע
- קומפלקסים של RNA-חלבון ממלאים תפקידים קריטיים בוויסות גנים.
- הבנת קומפלקסים אלו יכולה לספק תובנות לגבי זיהומים ויראליים.
- שליטה פוסט-תעתיקית חיונית לוויסות ביטוי גנים.
- ה-UTR חמש פרימים משמעותי בתמלילים רטרו-ויראליים.
מטרת המחקר
- לבודד קומפלקסים ספציפיים של RNA-חלבון באמצעות העשרה מכוונת אוליגונוקלאוטידים.
- לאפיין את הרכב חלבוני קישור RNA בתמלילים רטרו-ויראליים.
- לחקור את ההשלכות על זיהומים ויראליים ומחלות תאיות.
שיטות ששימשו
- טכניקה של אימונופרציפיטציה של RNA.
- העשרה מכוונת אוליגונוקלאוטידים.
- אפיון של חלבוני קישור RNA.
- ניתוח של אינטראקציות RNA-חלבון.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של RNPs קרובים הקשורים לתמלילים רטרו-ויראליים.
- זיהוי של DHX9/RNA helicase A בקומפלקסים המבודדים.
- תובנות לגבי מנגנוני השליטה הפוסט-תעתיקית.
- זיהוי פוטנציאלי של מטרות תרופתיות חדשות לזיהומים ויראליים.
מסקנות
- הטכניקה משפרת את ההבנה של אינטראקציות RNA-חלבון.
- היא מספקת מסגרת לחקר ויסות פוסט-תעתיקית.
- הממצאים עשויים להוביל לאסטרטגיות טיפוליות חדשניות נגד מחלות ויראליות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables selective isolation of specific RNA-protein complexes from eukaryotic cells, supporting target validation in post-transcriptional gene regulation. By enriching cognate RNPs at the 5' UTR of retroviral transcripts, it provides mechanistic insights into viral translation control and cellular stress response pathways. The approach aids in de-risking target hypotheses by defining RNP composition relevant to antiviral and disease-modifying strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by defining RNA binding protein composition at specific RNA elements.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of RNA-protein interactions in disease-relevant contexts.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by linking RNP complexes to translational control of viral and stress-response genes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated RNP complexes for downstream proteomic and biochemical analysis.
- Operational Value: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay standardization and screening readiness.
- Platform Value: Enables scalable isolation of cognate complexes for reliable compound evaluation in follow-up workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational continuity by linking discovery-phase RNP identification to preclinical validation of gene regulation mechanisms.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions through mechanistic de-risking of post-transcriptional targets.
- Predictive Value: Aligns with biomarker development by identifying RNP components associated with pathogenic gene expression.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for RNA-mediated mechanisms of gene expression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating specific RNP complexes from cellular lysates.
- Screening: Enables assay readiness through standardized isolation of RNA-protein complexes with defined composition.
- Analytics: Generates protein and RNA readouts that allow comparative analysis of RNP composition under varying conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing mechanistic insight into viral and cellular gene expression control.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for probing RNA-protein interactions across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in RNA-regulated pathways.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility in RNP isolation across laboratories and projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early de-risking of targets involved in post-transcriptional control.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral and cellular stress-response programs based on RNP composition data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, immunoprecipitation, and RNA handling techniques.
- Depends on access to magnetic bead systems, centrifuges, and RNase-free laboratory equipment.
- Necessitates cross-team standardization of oligonucleotide design and RNase H digestion protocols.
- Involves adaptation considerations when applying to different RNA targets or cell types.
- Includes practical limitations such as the need for careful handling to preserve RNP integrity during lysis and elution steps.
