Name: בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: למד טכניקת RNA immunoprecipitation לבידוד קומפלקסים RNA-חלבון בתאים איקריוטיים באמצעות עשרת oligonucleotide מכוונת. השיטה מאפשרת אפיון אינטראקציות RNA-protein וזיהוי חלבוני קישור כמו DHX9/RNA helicase A ברצפי רטרו-וירוס.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים תמיכה בהכרת תודה על ידי NIH P50GM103297, P30CA100730 ומקיף סרטן P01CA16058.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> קומפוזיציות הצפה </td></tr><tr><td> לשטוף הצפה: </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 </td></tr><tr><td> 150 מ&quot;מ NaCl </td></tr><tr><td> 3 מ&quot;מ MgCl2 </td></tr><tr><td> נמוך מלח הצפה: </td></tr><tr><td> 20 mM Tris-HCl, 7.5 pH </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;מ NaCl </td></tr><tr><td> 3 מ&quot;מ MgCl2 </td></tr><tr><td> 2 מ&quot;מ DTT </td></tr><tr><td> EDTA ללא קוקטייל מעכבי פרוטאז 1x </td></tr><tr><td> RNase מתוך 5 μl / מ&quot;ל ​​(מעכב RNase) </td></tr><tr><td> Cytoplasmic הצפת תמוגה: </td></tr><tr><td> 0.2 M סוכרוז </td></tr><tr><td> 1.2% Triton X-100 </td></tr><tr><td> NETN-150 לשטוף הצפה: </td></tr><tr><td> 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 </td></tr><tr><td> 150 מ&quot;מNaCl </td></tr><tr><td> 0.5% NP-40 </td></tr><tr><td> 3 מ&quot;מ MgCl2 </td></tr><tr><td> 10% גליצרול </td></tr><tr><td> חיץ מחייב: </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;מ HEPES pH 7.6 </td></tr><tr><td> 40 מ&quot;מ KCl </td></tr><tr><td> 3 מ&quot;מ MgCl2 </td></tr><tr><td> 2 מ&quot;מ DTT </td></tr><tr><td> גליצרול 5% </td></tr></tbody></table> טבלה 2: קומפוזיציות הצפה. 1. הכנת התאים ואת מטריקס הזיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות קו תא מעניין-מפגש קטן (80%) בצלחת 10 סנטימטרים. השתמש 10 ס&quot;מ צלחות עבור immunoprecipitations עצמאית (IP) של חלבון מעיל FLAG-מתויג NLS-MS2. בצעו את IP באמצעות נסיובי לתג FLAG-epitope. היא הביעה את הפלסמיד חלבון מעיל MS2-tagged FLAG, transfect תאים 24-48 שעות מראש של הקציר 20. הערה: RNP מסוים עשוי להיות מועשרת גרעיני או בציטופלסמהlysates ic או הכנה ביוכימית-מופרדים, כגון שברים של שיפוע סוכרוז. מומלץ לקצור את lysate מתאי הלא transfected במקביל להנהיג פקד שלילי נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 60 μl לכל IP של slurry חרוז מגנטי חלבון G לצינור 1.7 מ&quot;ל microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור על מדף אבן שואבת צינורות microcentrifuge להפריד את החרוזים מן פתרון אחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון האחסון על ידי בקפידה ציור אותו עם micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור ממדף המגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף לאזן את החרוזים עם 600 μl (10 פעמים את נפח בשימוש של חרוזים) של חיץ לשטוף 1x (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 3 מ&quot;מ MgCl 2; ו -150 מ&quot;מ NaCl) וסיבוב הקצה מעל לקצה עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור על מתלה מגנט ולהסיר למאגר לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 כרכים (600 μl) של חיץ 1x לשטוף נוגדן FLAG immunoprecipitating אל pr equilibratedחרוזים מגנטיים otein G (בהתאם לסכום המומלץ על ידי היצרן עבור immunoprecipitation) וסוף-יתר בסוף הסיבוב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות כדי להטות את הנוגדן immunoprecipitating. השתמש IgG isotype המקביל כביקורת שלילית נוגדן מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור על מתלה מגנט לאסוף את החרוזים ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור ממדף המגנט ולשטוף את חרוזי מצומדות נוגדן עם 10 כרכים (600 μl) של חיץ וסיבוב לשטוף 1x עבור 3 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על פעולה זו פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור על מתלה מגנט ולהסיר למאגר לשטוף. </li></ol> 2. קציר RNPs הערה: הכן את RNPs בזמן הדגירה לאחר שלב 1.8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני תרבות מן התאים על ידי שאיפה לשטוף את התאים פעמיים עם 1-5 מ&quot;ל של בופר פוספט 1x קר כקרח (PBS). השתמש מגרד תא כדי לסלק רטוב,תאים חסידים לפני לאוסף על ידי צנטריפוגה ב 226 XG במשך 4 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 375 μl של קר כקרח, חיץ מלח נמוכה (20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 3 מ&quot;מ MgCl 2; 10 מ&quot;מ NaCl; 2 מ&quot;מ DTT; קוקטייל פרוטאז-מעכב 1x, EDTA ללא; ו -5 μl / מ&quot;ל RNase מונע) אל התא הגלול ולאפשר נפיחות ידי הצבתו על קרח במשך 5 דקות. הערה: חייט בהיקף של חיץ מלח נמוך פי לגודל התא הגלול. עבור 1.2 x 10 6 תאים מצלחת 10 סנטימטרים, 375 μl של חיץ מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף את lysate תא cytoplasmic, להוסיף 125 μl של חיץ תמוגה קרים כקרח (0.2 M סוכרוז / 1.2% Triton X-100), ולאחר מכן לבצע 10 משיכות עם homogenizer Dounce כי היה מראש צונן בתוך דלי קרח. הערה: כדי לאסוף את תמצית התא הכולל, חיץ תמוגה תקן ריפה מומלץ solubilizing nucleoplasm / הכרומטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין microfuge במהירות שיא (16,000 XG) במשך 1 דקות; זו תנקה את supernatant של פסולתגרעיני nd. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant לצינור microcentrifuge 1.7 מ&quot;ל חדש כי כבר על הקרח. קביעת ריכוז החלבון הכולל על ידי תקן, שיטה מועדפת ומעבדה, כגון ברדפורד Assay 23. שמורת aliquot של 10% לפחות לניתוח כתם מערבי, כדי לשמש פקד קלט. השתמש lysate תא שנקטפו מיד immunoprecipitation או לאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס למשך ניתוח עתידי. הערה: מניסיוננו, דגימות אלה ניתן לאחסן ולהשתמש בהם כמה חודשים מאוחר יותר לניתוח immunoprecipitation ללא פשרה של שלמות. </li></ol> 3. Immunoprecipitation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את העוצמה הרצויה של lysate התא שנקטפו, מבוסס על ריכוז החלבון נקבע בשלב 2.5, את החרוזים נוגדן מצומדות היעד. באמצעות חיץ לשטוף 1x, ולהביא את הנפח הכולל עד 600 μl ולסובב-סוף סוף-על במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: פרק זמן זה מספיק כדי ליצורבידוד חזק של מתחמי RNP גבוהה זיקה תוך מזעור הלא ספציפי מחייב. לדלל מקורות RNP חלופיים, כגון שברים של שיפוע סוכרוז, לפחות 1: 1 עם חיץ לשטוף 1x, ולאחר מכן לדגור אותם עם מתחמי חרוז-נוגדן בעבר סיים, כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 90 דקות של דגירה, במקום צינור IP על המדף מגנט לאסוף את החרוזים. שומרים לעצמנו את supernatant כמו זרימה דרך. הערה: זה זרימת דרך הראשונה היא מדגם מלא חשוב למדוד יעילות IP. ב assay immunoblot יספק אינדיקציה היעילה IP, כמו גם את הספציפיות של האינטראקציות הנחקרות. מומלץ לשמור supernatant זה לניתוח במורד הזרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים RNP הנכנס, מצומדות נוגדן עם 10 כרכים (600 μl) של חיץ לשטוף קר כקרח NETN-150 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 מ&quot;מ NaCl; 3 מ&quot;מ MgCl 2; 0.5% NP40; ו 10% גליצרול) תחת סיבוב עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב 3 פעמים. הערה: מאגר זה נבדל למאגר תמוגה וביעילות מפחית עמותות חלשות או שאינן ספציפיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות לשטוף האחרון, resuspend מתחמי RNP משותקת 60 μl של חיץ מחייב 1x קרים כקרח (10 HEPES מ&quot;מ, pH 7.6, 40 KCl מ&quot;מ; 3 מ&quot;מ MgCl 2; 5% גליצרול; ו -2 מ&quot;מ DTT) ובמילואים 10% של חרוזים המורכבים המשותקים עבור כתם מערבי ו -20% עבור בידוד RNA. </li></ol> 4. Elution <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את העוצמת הנותרת עד 100 μl עם חיץ מחייב 1x קר כקרח לחמם את הצינור ב 70 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד מתחמי RNA חלבון מאותו מקור, להוסיף oligonucleotide DNA ~ 30-NT כי הוא משלים את הגבול 3 &#39;רצף של RNA של עניין דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדין (100 ננומטר של oligonucleotide מספיקה). הערה: oligonucleotide הוא antisense אל שאריות נוקלאוטיד סמוך התרגום להתחיל באתר של לבנות PCE משמש examplדואר בפרוטוקול זה. השלמת רצף מתאימה מסופקת על ידי תוכן GC ~ 40%. לעצב את מולקולת אנטיסנס קצר הכלאה יעילה באזור משלים המינימום של רנ&quot;א היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 5-10 יחידות של RNase H כדי צינור דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 לדבוק רנ&quot;א של RNA: היברידית DNA. מעבירים את supernatant לצינור 1.7 מ&quot;ל microcentrifuge סטרילית; מדגם זה מכיל מתחמי RNP בשבי של עניין. הערה: בהתאם הנגישות של רנ&quot;א מאותו המקור, שתיים או יותר סבבי טיפול RNase H עשויים להיות שימושיים כדי להגדיל את שפע המדגם עבור הניתוחים במורד הזרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 20% של eluate בתוך כתם המערבי עבור חלבונים הקשורים ידוע ו -20% של eluate עבור בידוד RNA ואחריו RT qPCR. 60% הנותרים יכולים לשמש עבור ספקטרומטריית מסה או לזהות מרכיבי חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, לייחד aliquot של lysate התא השמור בידוד RNA וניתוח RT-PCR. asse זהssment מספק אינדיקציה להעשרת RNA בתוך קומפלקס RNP. הערה: יש להשתמש בתכשיר החלבון המבודד כתם מלא מערבי כדי לוודא כי מחשוף RNase H היה יעיל בשחרור RNP ממתחם immunuoprecipitated. </li></ol> 5. חלבון אלקטרופורזה ומערב ניתוח כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ נושא 10-20% מכלל המדגם כדי SDS-PAGE וניתוח immunoblot פי פרוטוקול מעבדה סטנדרטי. הערה: שלב זה משמש כדי לאמת IP יעיל וספציפי לפני ניתוח RNA במורד זרם. זה יכול לשמש גם כדי להעריך את רכב החלבון של מתחם RNP מבודד. </li></ol> אוסף 6. של RNA immunoprecipitated הערה: בידוד RNA יכול להיעשות על ידי שיטת Trizol או בעקבות הפרוטוקול המתואר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend חצי מכלל המדגם ב 750 μl של מגיב thiocyanate guanidinium חומצה לדגור בחדר temperature במשך 5 דקות לפני חילוץ RNA מן מתחמי PCE-RNP בשבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של כלורופורם אל הצינור, לנער במרץ ל -10 שניות, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה ב XG 16,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C, לאסוף את השלב המימי לתוך צינור מחדש ולהוסיף נפח שווה של isopropanol. מערבבים היטב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפחות. הוסף 1 μl של כחול גליקול למדגם ולאחסן אותו ב -20 ° C במקפיא במשך ממטרים או עיבוד יעילים במועד עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב XG 16,000 במשך 10 דקות ב 4 °. בזהירות לאסוף וזורקים supernatant כדי לא להפריע גלולה RNA; השימוש טיפ micropipette p-200 מומלץ כדי להקל על התהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של אתנול 75% על צינור אחד, מערבולת, ו צנטריפוגות צינורות ב XG 16,000 במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות לאסוף וזורקים supernatant כמו בשלב 6.4. אוויר-לייבש את הגלולה במשך 2-3 דקות ו resuspend ב 100 μl של RNase ללא מים. הערה: אין להאריך את זמן האוויר-מתייבש גלולה על מנת למנוע בעיה עם resuspension. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 100 μl של מדגם RNA לעמודה לנקות RNA. לעבד אותו באמצעות הפרוטוקול של היצרן. Elute רנ&quot;א 30 μl של מים ולאחסן RNase ללא ב -80 ° C עד 3 חודשים. הערה: RNA בודד זו מתאימה לניתוח במורד הזרם על ידי RT-PCR בזמן אמת (qPCR), microarray, וסדר RNA. בהתאם השפע של RNP ואת היעילות שבה RNP עניין מבודד, אותו lysate עלול להיות כפוף להם שניים או יותר סיבובים של IP כדי ליצור RNA מספיק רלוונטי עבור הניתוחים במורד הזרם. </li></ol> 7. RNA שעתוק לאחור והגברה של cDNA על ידי PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא רנ&quot;א המבודד להפוך שעתוק על ידי פריימר אקראי עם transcriptase הפוך באיכות גבוהה (RT), על פי manufaההוראות של cturer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגביר את RNA של עניין, לעצב פריימר antisense גן ספציפי בתוך רצף מחשוף H RNase. השתמש כמויות דומות של מולקולת אנטיסנס קצר, פריימר אקראי, או פריימר אוליגו-DT (ראה לוח חומרים). הערה: פריימר אוליגו-DT ו mRNA-adenylated פולי לספק תגובות בקרה חיוביות עבור תגובות RT-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור 5% של תגובת RT (1 μl) עבור preparative qPCR נעשתה בד בבד עם IP lysate שלילי מלא דגימות DNA חיובי שליטה להגדיר את החיתוך לייצר עקומת סטנדרט. אם הערך CT של qPCR preparative הוא מעבר לטווח של עקומת סטנדרט, לדלל את התגובה RT ב ברציפות 1: 5 דילולים וחזור על שלב 7.2. הערה: עבור רצף RNA וטכניקת ספקטרומטריית מסה, עיין קובץ השיטה המשלים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54391/Supplementary_method_File_Jove.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן t</a>o לקבלת קובץ שיטת משלים זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.) </li></ol>

<ol><li>Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+as+developmental+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins as developmental regulators.</a> Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).</li>
<li>Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+RNA-binding+proteins+interact+with+functionally+related+sets+of+RNAs%2C+suggesting+an+extensive+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system.</a> PLoS Biol. 6 (10), e255(2008).</li>
<li>Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li>
<li>Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins%3A+modular+design+for+efficient+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Mol.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins: modular design for efficient function.</a> Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).</li>
<li>Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retrovirus+RNA+trafficking+granule%3A+from+birth+to+maturity%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity.</a> Retrovirology. 3, 18(2006).</li>
<li>Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+helicase+A+is+necessary+for+translation+of+selected+messenger+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Struct.Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs.</a> Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).</li>
<li>Pullmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+turnover+and+translation+regulatory+RNA-binding+protein+expression+through+binding+to+cognate+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs.</a> Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).</li>
<li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+regulons%3A+coordination+of+post-transcriptional+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).</li>
<li>Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+birth+to+death%3A+the+complex+lives+of+eukaryotic+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs.</a> Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).</li>
<li>Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleoprotein+immunoprecipitation+%28RNP-IP%29%3A+a+direct+in+vivo+analysis+of+microRNA-targets%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell.Biochem%22%5BJournal%5D)">Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets.</a> J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).</li>
<li>Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+RNA-protein+interactions+in+vivo+by+RNA+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation.</a> Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).</li>
<li>Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Cognate+Cellular+and+Viral+Ribonucleoprotein+Complexes+of+HIV-1+RNA+Applicable+to+Proteomic+Discovery+and+Molecular+Investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations.</a> Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).</li>
<li>Stake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+and+two+avian+retroviral+5%27+untranslated+regions+bind+orthologous+human+and+chicken+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins.</a> Virology. 486, 307-320 (2015).</li>
<li>Sung, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+using+microarray+identified+complex+signaling+pathways+modulated+by+hypoxia+in+nasopharyngeal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma.</a> Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Michlewski, G., Caceres, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNase-assisted+RNA+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNase-assisted RNA chromatography.</a> RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).</li>
<li>Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+identification+of+proteins+interacting+with+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids.</a> J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).</li>
<li>Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+understanding+RNA-mediated+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J.Genet.Genomics%22%5BJournal%5D)">Towards understanding RNA-mediated neurological disorders.</a> J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).</li>
<li>Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+RNA+terminus+of+spleen+necrosis+virus+contains+a+novel+posttranscriptional+control+element+that+facilitates+human+immunodeficiency+virus+Rev%2FRRE-independent+Gag+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production.</a> J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).</li>
<li>Bolinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+helicase+A+interacts+with+divergent+lymphotropic+retroviruses+and+promotes+translation+of+human+T-cell+leukemia+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1.</a> Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).</li>
<li>Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+helicase+A+modulates+translation+of+HIV-1+and+infectivity+of+progeny+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions.</a> Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).</li>
<li>Lee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+the+DHX9+helicase+induces+premature+senescence+in+human+diploid+fibroblasts+in+a+p53-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner.</a> J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Glenn, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+protein+samples+for+mass+spectrometry+and+N-terminal+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing.</a> Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).</li>
<li>Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP-Chip%3A+the+isolation+and+identification+of+mRNAs%2C+microRNAs+and+protein+components+of+ribonucleoprotein+complexes+from+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.</a> Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).</li>
<li>Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+double-stranded+RNA-binding+domains+of+RNA+helicase+A+are+necessary+for+selective+recognition+and+translation+of+complex+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs.</a> J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בידוד RNP ואסטרטגית זיהוי RNA מאותו המקור המתואר כאן הוא אמצעי סלקטיבית של חוקרת אינטראקצית RNA חלבון ספציפית לגילוי חלבוני מועמד שיתוף ויסות RNP ספציפי בתאים. היתרון של שימוש מכוון oligonucleotide מחשוף RNase H לבודד RNPs הוא היכולת ללכוד במיוחד לנתח את ציס-מתנהג RNP אלמנט RNA מעל RNPs הטרוגנית הכבול במורד לאלמנט RNA ציס-בפועל של עניין. בגלל השפע של רנ&quot;א מאותו מקור בתוך RNP נתונה הנו חלק מינורי של RNPs שנאס...

שלאחר תעתיק ביטוי גנים מוסדר בדיוק, החל שעתוק ה- DNA בגרעין. בשליטת RNA מחייב חלבונים (RBPs), biogenesis mRNA וחילוף החומרים להתרחש חלקיקים ribonucleoprotein מאוד דינמי (RNPs), אשר כלולות לנתק עם mRNA מבשר המצע במהלך ההתקדמות של RNA מטבוליזם 1-3. שינויים דינמיים רכיבי RNP להשפיע על הגורל שלאחר התעתיק של mRNA ולספק אבטחת איכות במהלך העיבוד של תמלילים עיקריים, הסחר ולוקליזציה הגרעין שלהם, פעילותם כתבניות mRNA לתרגום, ואת המחזור הסופי של mRNAs הבוגרת. חלבונים רבים מיועדים RBPs מכוח תחומי חומצת אמינו המשומר שלהם, כוללים מוטיב הכרת רנ&quot;א (RRM), תחום מחייב פעמים התקועות RNA (RBD), והוא משתרע של שאריות בסיסיות (למשל, ארגינין, ליזין, גליצין) 4. RBPs הם שגרתימבודד על ידי אסטרטגיות immunoprecipitation ו מוקרנים לזהות RNAs מאותו המקור שלהם. חלק RBPs שיתוף להסדיר-mRNAs מראש כי הם-קשורות מבחינה פונקציונלית, יועד regulons RNA 5-8. RBPs אלה, mRNAs מאותו המקור שלהם, ולפעמים RNA ללא קידוד, יוצרים RNPs קטליטי שמשתנה רכב; ייחודם נובע שילובים שונים של גורמים הקשורים, כמו גם לרצף הזמני, מיקום, ומשך האינטראקציות ביניהם 9. Immunoprecipitation RNA (RIP) היא טכניקה רבת עוצמה כדי לבודד RNPs מתאי ולזהות תמלילי הקשורים באמצעות רצף ניתוח 10-13. מעבר מ מועמד הגנום כולו הקרנה אינה ריאלית באמצעות RIP בשילוב עם ניתוח microarray 14 או רצף תפוקה גבוהה (RNA-seq) 15. כמו כן, חלבונים-מזרז שיתוף יכולים להיות מזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה, אם הם נמצאים בשפע מספיק להפרדת הנוגדן מזרז-שיתוף 16,17. כאן, אנחנו כתובת המתודולוגיה לבידוד רכיבי RNP של רנ&quot;א מאותו מקור ספציפי מתא אדם תרבותי, אם כי הגישה היא עָשׂוּי לְהִשׁתָנוֹת עבור lysates המסיס של תאי צמח, פטריות, וירוסים, חיידקים. ניתוחים Downstream של החומר כוללים זיהוי המועמד ואימות על ידי immunoblot, ספקטרומטריית מסה, assay האנזימטית ביוכימיים, RT-qPCR, microarray, ו RNA-seq, כפי שמסוכם איור 1. בהתחשב התפקיד הבסיסי של RNPs בשליטת ביטוי גנים ברמה שלאחר התעתיק, שינויים בביטוי של RBPs רכיב או נגישותן מאותו מקור RNAs יכול להיות מזיק עבור התא ומזוהה עם כמה סוגים של הפרעות, כולל מחלות נוירולוגיות 18. DHX9 / RNA helicase A (RHA) הוא הכרחי עבור התרגום של mRNAs שנבחרו ממוצא הסלולר retroviral 6. RNAs מאותו מקור אלה להפגין אלמנטים ציס-מתנהג מבנית הקשורה בתוך שלהם5 &#39;UTR, אשר יועד אלמנט השליטה שלאחר תעתיק (PCE) 19. RHA-PCE שפעילות מתבקשת על תרגום הכובע תלוי היעיל של רטרווירוסים רבים, כולל HIV-1, ושל גני רגולטוריים צמיחה, כוללים ג&#39;ונד 6,20,21. קודד על ידי גן חיוני (dhx9), RHA חיוני התפשטות תא ומטה בתקנה שלה מבטל כדאיויות תא 22. הניתוח המולקולרי של RHA-PCE RNPs הוא צעד חיוני כדי להבין מדוע פעילות RHA-PCE יש צורך לשלוט התפשטות תאים. האפיון המדויק של רכיבי RNP RHA-PCE על מצב יציב או על הפרעות פיסיולוגיות של התא דורש להעשרת סלקטיבית לכידתו של RNPs RHA-PCE בשפע מספיק לניתוח במורד זרם. הנה, retroviral PCEgag RNA תויגה עם 6 עותקים של אתר הקישור RNA ציס-מתנהג לחלבון מעיל MS2 (CP) בתוך מסגרת קריאה פתוחה. החלבון מעיל MS2 היה Exoהשיתוף הביע genously עם RNA PCEgag ידי transfection פלסמיד כדי להקל על הרכבת RNP בתאים גדלו. RNPs המכיל חלבון מעיל MS2 עם RNA PCEgag מאותו מקור MS2-tagged היו immunoprecipitated מהתמצית התא שנתפסו על חרוזים מגנטיים (איור 2 א). כדי סלקטיבי ללכוד את רכיבי RNP המאוגדים PCE, את משותקת RNP הודגר עם oligonucleotide משלים רצפי דיסטלי PCE, ויוצרים היברידי RNA-DNA כי הוא המצע לפעילות RNase H. מאז PCE ממוקמת ב &#39;מסוף של 5&#39; 5 באזור הלא מתורגם, את oligonucleotide היה משלים רצפי הרנ&quot;א סמוך לאתר תחילת התרגום retroviral (קודון ההתחלה איסור פרסום). RNase H מחשוף בסמוך לנקודת התחלת איסור פרסום קודון שוחרר במתחם UTR &#39;5 מן RNP המשותקת, אשר נאספה כמו eluent. לאחר מכן, המדגם הוערך על ידי RT-PCR כדי לאשר את לכידתו של PCEgag ועל ידי PAGE ו immunoblot SDS כדי לאשר את captuמחדש של חלבון מעיל MS2 היעד. אימות של חלבון מחייב PCE הקשורים RNA, DHX9 / RNA helicase A, בוצע אז.

<table><tbody><tr><td>חלבון Dynabeads A</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads חלבון G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד FLAG</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד FLAG</td><td>Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד RHA</td><td>Vaxron</td><td>PA-001</td><td></td></tr><tr><td>TRizol LS</td><td>מגיב טכנולוגיית</td> <td>חיים10296-028</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>Ambion</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26184</td><td></td></tr><tr><td>RNaeasy clean-up column</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Omniscript reverse transcriptase</td><td>Qiagen</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>RNase Out</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים הקסמרים אקראיים</td><td>Invitrogen</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT פריימרים</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AM5730G פריימרים PCR</td><td>IDT</td><td></td><td>פריימרים ספציפיים לגן עבור &nbsp; הגברת PCR</td></tr><tr><td>אוליגונוקלאוטיד עבור RNase H מחשוף בתיווך</td><td>IDT</td><td></td><td>פריימר אנטי-חושי ל-RNA מטרה</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco Life technology</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM מדיום תרבית רקמות</td><td>Gibco Life טכנולוגיה</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>טכנולוגיית Gibco Life</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת ניטרוצלולוזה</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מגנטי</td><td></td><td></td><td>צינור מיקרו צנטריפוגה 1.7 מ"ל המחזיק</td></tr><tr><td>מכסה מנוע</td><td></td><td></td> למינרי <td>לתרבית רקמות מן החי</td></tr><tr><td>חממת</td><td></td><td></td> CO2 <td>לתרבית רקמות מן החי</td></tr><tr><td>מכשיר</td><td></td><td></td> ג'ל חלבון <td>הפרדת דגימת חלבון</td></tr><tr><td>מנגנון</td><td></td><td></td> העברת <td>חלבון העברת דגימת חלבון</td></tr><tr><td>מוכן לשימוש ג'ל חלבון (4-15%)</td><td></td><td></td> <td>הפרדת דגימת חלבון</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td> עליונה <td>לשולחן גלולה במורד הדגימה</td></tr><tr><td>מסובב</td><td></td><td></td> השולחן <td>מערבב את הדגימה מקצה לקצה</td></tr><tr><td>מערבולת</td><td></td><td></td><td>מערבב את הדגימות</td></tr></tbody></table>

בידוד של קומפלקסים rna חלבון מאותו מקור מתאי שימוש elution oligonucleotide מכוונת

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

חלקיקי ריבונוקלאופרוטאין מכוונים את הביוגנזה והוויסות שלאחר השעתוק של כל ה-mRNA באמצעות שילובים נפרדים של חלבונים קושרי RNA. הם מורכבים מרכיבי RNA תלויי מיקום, הפועלים על ציס ושילובים ייחודיים של חלבונים קושרי RNA. הגדרת ההרכב של RNP ספציפי חיונית להשגת הבנה בסיסית של ויסות גנים. הבידוד של RNP נבחר דומה למציאת מחט בערימת שחת. כאן, אנו מדגימים גישה לבידוד RNPs הקשורים באזור 5' הלא מתורגם של mRNA נבחר בתאים אסינכרוניים וטרנספטנטיים. RNP קוגנטי זה הוכח כהכרחי לתרגום של נגיפים נבחרים וגנים של תגובת עקה תאית.
פרוטוקול המשקעים המשותף המוכח של RNA-חלבון מתאים לניתוח במורד הזרם של רכיבי חלבון באמצעות אנליזות פרוטאומיות, אימונובלוטים או מבחני זיהוי ביוכימיים מתאימים. פרוטוקול ניסיוני זה מדגים כי הליקאז A של DHX9/RNA מועשר בקצה 5' של RNA רטרו-ויראלי קוגנטי ומספק מידע ראשוני לזיהוי הקשר שלו עם huR הקשור למתח תאי ו-mRNA קוגנטי junD.

תוצאות RIP לפני מזוהה RNAs איסור פרסום retroviral נבחרים RNAs הסלולר כי שיתוף המשקע עם DHX9 / RHA, כולל HIV-1 6, ג'ונד 6 וחור (פריץ ובוריס-לאוורי, לא פורסם). 5 retroviral 'UTR הודגמה לשתף המשקע עם DHX9 / RHA בגרעין לשתף לבודד בציטופלסמה על polyribosomes. זה מוגדר באופן ייחודי כמו אלמנט השליטה שלאחר תעתיק -acting cis (PCE) 6. כדי לבודד PCEgag מתחמי ribonucleoprotein RNA-RHA (RNPs) נוצר בתאים מתרבים, ביצענו F...

כתב יד זה מתאר גישה לבידוד RNPs קוגנטיים נבחרים הנוצרים בתאים אוקריוטיים באמצעות העשרה מכוונת אוליגונוקלאוטידים ספציפית. אנו מדגימים את הישימות של גישה זו על ידי בידוד RNP מקביל הקשור לאזור הרטרו-ויראלי 5' הלא מתורגם המורכב מ-DHX9/RNA הליקאז A.

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

המטרה הכוללת של טכניקת אימונו-משקעים RNA זו היא לבודד ולאפיין באופן סלקטיבי קומפלקסים של חלבוני RNA אנדוגניים הנוצרים בתאים אוקריוטיים באמצעות העשרה מכוונת אוליגונוקלאוטיד ספציפית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הבקרה שלאחר השעתוק, כגון הרכב חלבוני קשירת RNA המגדירים את חמשת ה-UTR העיקריים של תעתיק רטרו-ויראלי כדי לווסת את ביטוי הגנים שלו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לחוקר לבודד ולאפיין באופן סלקטיבי קומפלקס חלבון RNA ספציפי מעניין תוך שמירה על האפשרות לבצע ניתוח גלובלי יותר של RNP במורד הזרם.ובכן, ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הבנה בסיסית של זיהומים נגיפיים ומחלות תאיות רבות. ומספק תובנה משמעותית לגבי מנגנוני הבקרה לאחר השעתוק של ביטוי גנים. זה יכול להיות מטרות תרופות חדשות ברות-קיימא.לאחר תרבית תאים וביצוע משקעים חיסוניים של חלבון מתויג FLAG על פי פרוטוקול הטקסט, העבירו 60 מיקרוליטר לכל IP של תמיסת חרוזים מגנטית pro-TG לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.7 מיליליטר. הנח את הצינור על מתלה מגנטי והסר את תמיסת האחסון על ידי פיפטינג בזהירות. לאחר מכן הסר את הצינור מהמתלה.הוסף 600 מיקרוליטר של מאגר כביסה 1x. והניחו את הצינור על מסובב קצה מעל קצה בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות, כדי לשטוף ולאזן את החרוזים. הנח את הצינור על המתלה המגנטי והסר את מאגר הכביסה.לאחר מכן הוסף 10 נפחים של מאגר כביסה טרי פי אחד. הוסף נוגדן FLAG משקע חיסוני לחרוזים המגנטיים המאוזנים pro-TG. ואז סובב את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות, כדי להצמיד את הנוגדן המשקע את מערכת החיסון.הנח את הצינור על המגנט והסר את הסופרנטנט. לאחר מכן הסר את הצינור מהמגנט והוסף מאגר כביסה פי 1 לחרוזים וסובב בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. חזור על שלב הכביסה פעמיים והסר את המאגר הסופי.הסר את מדיום התרבות מהתאים על ידי שאיפה והשתמש ב -1.5 מיליליטר PBS קר כקרח כדי לשטוף את התאים פעמיים. בעזרת מגרד תאים עקורים את התאים הרטובים והדבקים. פיפטו את תרחיף התא לצינורות טריים ולאחר מכן צנטריפוגה את התרבית ב-226 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס, למשך ארבע דקות.הוסף 375 מיקרוליטר של מאגר מלח נמוך קרח לכדור התא, ודגר את הדגימה על קרח למשך חמש דקות כדי לאפשר נפיחות. חשוב לנקוט משנה זהירות בעת הוספה והשעיה מחדש של כדור התא במאגר הליזיס הנמוך במלח, כדי להבטיח טבילה ונפיחות מוחלטת ללא הפרעה מכנית מוקדמת. כדי לאסוף את הליזאט של התא הציטופלזמי, הוסף 125 מיקרוליטר של מאגר ליזה קר כקרח, ולאחר מכן השתמש בהומוגנייזר Dounce מקורר מראש לביצוע עשר פעימות.להומוגניזציה בכוח מספיק כדי לאפשר ליזה של קרום הפלזמה ומזהמים של הליזאט הציטופלזמי המשוחרר. אך הקפד לא להאריך יתר על המידה את השיבוש המכני ולהסתכן בזיהומים גרעיניים, שיבוש של קומפלקס חלבון RNA או אובדן שחרור סובב את ההומוגנאט במיקרופוגה במהירות מרבית למשך דקה אחת. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.7 מיליליטר שהיה על קרח.קבע את ריכוז החלבון הכולל. שמור 10% לניתוח כתם מערבי, שישמש כבקרת קלט. כדי לבצע משקעים חיסוניים, הוסף את הנפח הרצוי של ליזט תאים שנקטף לחרוזים המצומדים של נוגדן המטרה.בעזרת מאגר כביסה 1x, הביאו את הנפח הכולל עד 600 מיקרוליטר וסובבו את הדגימה בטמפרטורת החדר. לאחר 90 דקות של דגירה, הנח את צינור ה-IP על מתלה המגנט כדי לאסוף את החרוזים. לאחר מכן אספו את הסופרנטנט ושמרו אותו כזרימה.לאחר מכן, הוסף 10 נפחים של מאגר כביסה NETN 150 קר כקרח לחרוזים מצומדים של RNP הקשורים לנוגדנים, וסובב את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. לאחר השעיה מחדש של מתחמי ה-RNP המשותקים במאגר כריכה 1x בהתאם לפרוטוקול הטקסט, התאם את הנפח הנותר ב-100 מיקרוליטר של מאגר כריכה קר כקרח 1x. ומחממים את הצינור בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.כדי לבודד קומפלקסים של חלבון RNA קוגנטי, הוסף כ-30 אוליגו DNA נוקלאוטיד, המשלים את גבול שלושת הרצפים הראשוניים של ה-RNA המעניין. ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדינה. הוסף חמש עד עשר יחידות או RNase H לצינור ודגר את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כדי לבקע את ה-RNA מהכלאת ה-RNA DNA.לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט המכיל את קומפלקסי ה-RNP שנלכדו המעניינים לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.7 מיליליטר. כדי לאסוף את ה-RNA המשקע החיסוני, יש להשעות מחדש מחצית מהדגימה הכוללת של קומפלקסי RNA שנלכדו ב-750 מיקרוליטר של מגיב חומצה גואנידיניום תיוציאנט. מוסיפים 200 מיקרוליטר כלורופורם לשפופרת, מנערים במרץ במשך 10 שניות ומדגרים בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות.לאחר הצנטריפוגה, אוספים את השלב המימי בצינור טרי, ומוסיפים נפח שווה של איזופרופנול. מערבבים היטב ומדגרים את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך עשר דקות לפחות. הוסף לדגימה מיקרוליטר אחד של גליקול כחול ואחסן אותו בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשקעים יעילים או לעיבוד במועד עתידי.צנטריפוגה של הצינור ב -16, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך עשר דקות. השתמש במיקרופיפטה P200 כדי לאסוף בזהירות ולזרוק את הסופרנטנט כדי לא להפריע לכדור ה-RNA. הוסף 500 מיקרוליטר של 75% אתנול לכל צינור.מערבולת וצנטריפוגה את הצינורות למשך חמש דקות. אסוף בזהירות והשליך את הסופרנטנט כפי שהודגם זה עתה. יבש את הגלולה באוויר למשך שתיים-שלוש דקות והשתמש ב-100 מיקרוליטר מים ללא RNase כדי להשעות אותה מחדש.החל 100 מיקרוליטר מדגימת ה-RNA על עמודת ניקוי RNA. ולעבד אותו על פי פרוטוקול היצרנים. לבסוף, יש להוציא את ה-RNA ב-30 מיקרוליטר מים נטולי RNase ולאחסן אותו בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים.לבודד רכיבי בקרה לאחר שעתוק, או קומפלקסים של ריבונוקלאופרוטאין PCE, GAG, RNA, RHA הנוצרים בתאים מתרבים. משקעים חיסוניים של FLAG-MS2 RNP בוצעו בליזטים של תאי HECK293 שעברו טרנספטציה. התוצאות מראות משקעים יעילים של חלבון FLAG-MS2.מכיוון ש-DHX9/RHA נמצא בקומפלקס RNP ולא בתוך בקרת האיזוטופ IgG, וגם לא בתוך הבקרה השלילית. מוצגים כאן כתמים מערביים מקומפלקסי DNA של RNase H מעוכלים. RNase H חתך את PCE GAG RNA, ושחרר את קומפלקס ה-RNP הקשור במיוחד לחמשת ה-UTR הראשוניים.ה-RNPs הקשורים ל-DHX9/RHA הועשרו בנוזלים. חשוב לציין, ה-RNPs הקשורים ל-FLAG-MS2 נשארו עם החרוזים המצומדים של הנוגדנים. בניסוי זה, משקעים חיסוניים HO של לולאת הגזע MS2, המכילה PCE GAG RNA רטרו-ויראלי בתאים ובחומרי סיכה, אומתו על ידי RT-PCR ו-QRT-PCR.התוצאות אישרו קשר נבחר בין DHX9/RHA לבין ה-UTR הרטרו-ויראלי, שהודגש כ-RNP ייחודי, חשוב לבקרת תרגום ממוקדת. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כחמש שעות, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע את כל השלבים ביעילות ובזהירות, כדי להבטיח תחזוקה של מתחמי RNP שלמים ובידוד של מתחם ה-RNP הספציפי המעניין.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ספקטרומטריית מסה ו-RNA-Seq, על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו קשר חלבון גלובלי עם RNA המטרה. וניתוח אזור או מלא של כל התמלילים המעורבים ב-RNP מסוים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום בקרת גנים לאחר שעתוק לחקור את קומפלקסי חלבון ה-RNA הייחודיים השולטים בתפוגת גנים נגיפיים פתוגניים ומנגנון כללי של בקרת ביטוי גנים תאי.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקצור מתחמי RNP תאיים שלמים ולקבוע את הרכבם באמצעות העשרה מכוונת אוליגונוקלאוטידים סלקטיבית. אל תשכח גם, עבודה עם וירוסים פתוגניים ודגימות ביולוגיות וכימיקלים מסוכנים כמו חומצה או פנול, עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט תמיד בכל אמצעי הזהירות, כגון ציוד מגן אישי מתאים בעת ביצוע הליך זה.

isolation-cognate-rna-protein-complexes-from-cells-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד...

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

צעד אחר צעד לפרוטוקול בידוד וזיהוי RNA מתחמים הקשורים באמצעות RIP שבב.

שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנ&quot;א ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP

סרטון זה מדגים בדיקת RNA במבחנה נפתחת לזיהוי חלבונים קושרי RNA (RBPs), אשר מקיימים אינטראקציה עם רצפי היסוד העשיר באדנילט-אורידילאט (ARE) ב-mRNA. RBPs המטרה מליזט התא מעורבבים עם בדיקת RNA כדי ליצור קומפלקסים של RNA-חלבון. הקומפלקסים מבודדים באמצעות טיהור זיקה תוך ניצול הזיקה של תווית הדסתיוביוטין של גשושית הרנ"א לחרוז מגנטי המסומן בסטרפטווידין.

RNA-Protein Pull-Down Assay לבידוד חלבונים קושרי RNA באמצעות מיצוי זיקה

אינטראקציות חלבון RNA נמצאות בלב תהליכים תאיים רבים. כאן, אנו מתארים שיטת in vivo לבידוד RNA ספציפי וזיהוי חלבונים חדשים הקשורים אליו. זה יכול לשפוך אור חדש על האופן שבו RNA מווסתים בתא.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

שיטה זו נפתחים RNA מאפשר זיהוי המטרות RNA של RNA לונג ללא קידוד (lncRNA). על סמך הכלאה תוצרת בית, מעוצב תחושה אנטי DNA oligonucleotide הגששים הספציפי הזה lncRNA רקמות כראוי קבוע או שורת התאים, ביעילות מאפשר לכידת כל המטרות RNA של lncRNA.

הליך RNA הנפתח כדי לזהות מטרות RNA לונג ללא קידוד RNA

טנדם RNA בידוד שגרה (טיול) עבור שחזור של mRNA בנוי endogenously-חלבון מתחמי מתואר. באופן ספציפי, מתחמי RNA-חלבון תפור ויוו, polyadenylated RNAs מבודדים של תמציות עם חרוזים oligo(dT), mRNAs מסוים נלכדים עם ששונה oligonucleotides antisense RNA. חלבונים מאוגדים mRNAs מזוהים על-ידי ניתוח immunoblot.

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

מתחמי RNA/חלבון מטוהרים באמצעות אסטרטגיה botin-streptavidin הם eluted פתרון תחת תנאים denaturing בטופס אינו מתאים עוד טיהור, אנליזה פונקציונלית. כאן, אנו מתארים שינוי של אסטרטגיה זו אשר מנצל מקשר צילום-cleavable RNA, צעד • UV-תנאי עדין, מניב את מתחמי ה-RNA/חלבון המקורי והמלא.

צעד אחר צעד טיהור של מתחמי Macromolecular בעזרת RNA המצורפת ביוטין, מקשר צילום-cleavable

כאן, אנו מתארים את ההרכבה של RNA פולימראז II (Pol II) מתחמי התארכות הדורשים רק די-אן-איי סינתטי ו-RNA olig, ומטוהרים פול II. מתחמי אלה שימושיים עבור מנגנוני לימוד בבסיס עיבוד שכונתיות של התעתיקים הקשורים למכלול התארכות פול השני.

RNA מלאכותי פולימראז השני מכלולי התארכות לניתוח אירועים בעיבוד RNA

פרוטוקול זה נועד לבודד mRNA ריבוזומלי ספציפי לסוג התא באמצעות מודל העכבר NuTRAP.

לבודד רנ"א ספציפיים לסוג תא מדגימות רקמות הטרוגניות קפואות ללא מיון תאים

כאן, אנו מציגים שיטה מותאמת במבחנה לחשיפה, כימות ואימות של אינטראקטורים חלבוניים של רצפי RNA ספציפיים, תוך שימוש בתמצית חלבון כוללת מתאים אנושיים, חרוזי סטרפטווידין המצופים ב-RNA ביוטינילציה וניתוח ספקטרומטריית מסות.

ניתוח כמותי אופטימלי של חלבונים קושרי RNA באמצעות RNA קצר ביוטינילציה

ALIBi (ALIBi) היא שיטה חדשה שמופעלת אופטוגנטית שפותחה לתיוג וטיהור אוכלוסיות תת-תאיות של ריבוזומים לצורך ריצוף וניתוח פרוטאומי במורד הזרם וניתוח פרוטאומי.

בידוד תת-אוכלוסיות ריבוזום תת-תאיות בהתבסס על ביוטינילציה מוגברת במיקום ספציפי לתג פפטיד רקומביננטי - תאורה מוגבלת -

למד טכניקת RNA immunoprecipitation לבידוד קומפלקסים RNA-חלבון בתאים איקריוטיים באמצעות עשרת oligonucleotide מכוונת. השיטה מאפשרת אפיון אינטראקציות RNA-protein וזיהוי חלבוני קישור כמו DHX9/RNA helicase A ברצפי רטרו-וירוס.

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

גלה סרטונים נוספים