זרימה מיון ו Exome רצף של תאים ריד סטרנברג של לימפומה קלאסית הודג'קין

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפריד ולרכז תאי הודג'קין ריד-שטרנברג או HRS ברי קיימא מגידולי הודג'קין לימפוציטיים דלקתיים קלאסיים או CHL לצורך יצירה וניתוח של נתוני ריצוף אקסום שלמים באיכות גבוהה מהדור הבא. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של CHR, כולל זיהוי מוטציות מניע מרכזיות, מוטציות בריחה חיסונית, וגם הסתכלות על מגוון גנטי בתוך הסיווג. טכניקה זו מניבה DNA שמקורו בגידול באיכות ובטוהר גבוהים מאוד.

הקלה על יצירת ספריות ריצוף מהדור הבא ללא צורך בשלב הגברה מראש. לטכניקה זו עשויות להיות השלכות חשובות לקראת האבחנה של לימפומת הודג'קין מכיוון שהיא עשויה לסייע בתת-סיווג ובחיזוי. זה עשוי גם להשפיע על בחירת הטיפול, מכיוון ששינויים מסוימים עשויים להצביע על רגישות או עמידות לתרופות ספציפיות.

יונתן פרום הגה את הרעיון הזה לראשונה כשגילה כיצד לדמיין תאי HRS על ידי זרימה ציטומטרית ולבצע את ניסויי המיון הראשונים עם תאים אלה. לפני הכנת התאים, ערבבו את הנוגדנים שנבדקו מראש בבקבוקון זכוכית כהה. לאחר מכן, הוסף PBS ו-BSA כדי להביא את קוקטייל הנוגדנים לנפח של 100 מיקרוליטר.

ולהעביר את הבקבוקון מחנקן נוזלי לדלי קרח או לקרח יבש. לאחר מכן, הפשירו במהירות את התאים המעניינים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. כאשר נותר רק חלק קפוא קטן, שפכו את התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל 45 מיליליטר של מדיום הפשרה של 37 מעלות צלזיוס, ושטפו את הבקבוקון הקריוגני פעמיים עם מיליליטר אחד של מדיום הפשרה טרי.

לאחר איגום שתי השטיפות, אפשר לתאים להתעכל בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. כאשר התאים התייצבו מחדש, אספו אותם על ידי צנטריפוגה. שאפו את כל המיקרוליטרים מלבד 200 המיקרוליטרים האחרונים של הסופרנטנט.

השהה מחדש את התאים במדיום ההפשרה שנותר ואפשר לתאים לנוח עוד שתיים-שלוש דקות. לאחר מכן, דגרו את התאים ב-100 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנים מפני אור. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים בשלושה מיליליטר של מדיום מיון, ולהשעות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום מיון טרי.

לאחר מכן, סנן את התאים דרך מסננת עליונה של צינור זרימה של חמישה מיליליטר. שוטפים את הצינור והמסננת במיליליטר נוסף של מדיום מיון, ומחזיקים את התאים על קרח. לפני תחילת מיון התאים, בתוכנת ציטומטר הזרימה מתחת לתפריט הניסוי, בחר ניסוי חדש ופתח את חלון מצב המכשיר.

בכרטיסייה פרמטרים, מחק את כל הפרמטרים שאינם בשימוש. לאחר מכן, פתח מחדש את כרטיסיית הניסוי ובחר את הגדרת הפיצוי כדי ליצור את פקדי הפיצוי. בחלון הדפדפן, לחץ על סימן הפלוס כדי להרחיב את דגימת בקרת הפיצוי, והפעל את שפופרות בקרת הפיצוי מבלי לרשום את הנתונים.

התאם את מתחי הגלאי לפי הצורך כך שאוכלוסיות החרוזים המוכתמות באופן חיובי עבור כל כרום פלורה יהיו בין 10,000 ל-100,000 ערוצים. ושל הבהירים ביותר בערוץ הזיהוי העיקרי שלהם. רשום את המתחים הדרושים לכל פרמטר עבור כל צינור.

לאחר מכן, תחת דגימת בקרת הפיצוי, לחיצה שמאלית אחת כדי להדגיש את צינור הבקרה הלא מוכתם ולטעון את צינור הבקרה הלא מוכתם על שלב הדגימה. בחלון בקרת הרכישה, לחץ על עומס והפעל את בקרות הפיצוי הבודדות לתוך שדות מתח הגלאי עבור כל הפרמטרים להזין ידנית את המתחים שנקבעו. לחץ על רשומה כדי לקבל את נתוני הבקרה הלא מוכתמים.

לאחר מכן הפעל את כל בקרות הפיצוי הנותרות, והקלט את הנתונים מבלי לשנות אף אחת מהגדרות הגלאי. לאחר ניתוח כל הבקרות, הפעל שפופרת של מים סטריליים נטולי יונים למשך חמש דקות כדי לנקות את המכשיר מכל חומר שנותר לפני שתמשיך. כדי לשער את התאים למיון HRS, טען את צינור הניסוי ורשום לפחות 100,000 אירועים תוך התאמת קצב הזרימה לרכישת 3,000 עד 4,000 אירועים בשנייה.

הקפד לתעד מספיק אירועים כדי לדמיין אוכלוסייה שיכולה להיות קטנה כמו אחד ל-1,000 תאים. כדי לזהות את בקרות תאי B ו-T הסומטיים, שער על התאים החיוביים CD20 ו-CD5 בהתאמה. לאחר שכל השערים הוקמו, מיין את התאים לצינורות חרוטיים מקוררים מראש של 15 מיליליטר המכילים שבעה עד שמונה מיליליטר של מדיום איסוף.

בסוף המיון, העבירו את אוכלוסיות התאים המבודדים לצינורות מיקרו צנטריפוגות של 1.5 מיליליטר. ולגלול את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, שטפו את התאים במיליליטר אחד של PBS טרי והוציאו את הסופרנטנטים מכל צינור, תוך הקפדה לא להפריע לכדוריות הזעירות.

לאחר הגברת הספרייה וניקוי חרוזי נקודה 8X, יש להקפיד על התפלגות אור רגילה של גדלי שברים בטווח הרצוי. ספריות המציגות סטיות מצורה זו מצביעות על נוכחות של חפץ בעל משקל מולקולרי גבוה או נמוך, ובאופן אידיאלי אין לרצף אותן. לדוגמה, ודימר מתאם עשוי לפעמים לעבור דרך ניקוי חרוזי ה-X המחודד הראשון, ולהופיע כשיא חד שבמרכזו 125 עד 130 זוגות בסיסים.

במקרה זה, יש לבצע ניקוי חרוזי X מחודד נוסף, ואחריו הדמיה חוזרת של התפלגות הגודל כדי להבטיח הסרה מוצלחת של הדימר. לאחר ריבוי ריצוף של ארבע דגימות לכל נתיב, ניתן להשיג עומק כיסוי חציוני של 50 עד 100 X על פני המטרה. למרות שעלילות מספר עותקים שנוצרו מספריית ננוגרם אחת עלולות לגרום לרווחים והפסדים מזויפים של מספר עותקים.

כ-70% מהמקרים של לימפומת הודג'קין קלאסית נושאים מוטציות B2M ו-820, ו/או מחיקות שנראות משובטות, ושניתן להשתמש בהן כדי להעריך את תכולת הגידול היחסית. אם תאי T משמשים כבקרות סומטיות, ריצוף HRS ידגים עלייה משמעותית במספר העותקים במיקומים המתאימים למיקומי אלפא, דלתא ובטא של קולטן תאי T. כמו גם הפסדים משמעותיים בעמדות השרשרת הכבדה של תאי B ושל קאפה עם עומס מוטציות כולל של 100 עד 400 מוטציות סומטיות לכל מקרה אקסום.

לאחר השליטה, טכניקה זו, כולל מיון התאים ובניית ספריית הרצף, יכולה להסתיים תוך שלושה עד ארבעה ימים אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, אנו יכולים לבצע מחקרים פרוספקטיביים גדולים יותר ושיטות אחרות, כמו אפיגנטיקה, פרוטאומיקה ומטבלומיקה כדי לצבור ידע נוסף על לימפומת הודג'קין ולהתקדם לעבר טיפולים מותאמים אישית ספציפיים יותר. לאחר פיתוחה אפשרה לנו השיטה לחקור תאי HRS בעלי טוהר גבוה במספרים גדולים יחסית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאי HRS וליזום את הניתוח הגנומי שלהם.