שרשרת פולימראז משופר אורך קטע התגובה הגבלת Genotyping פולימורפיזם של נפוחיתיים רעילים ידי נוזלי כרומטוגרפיה / ספקטרומטריית מסה

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לבצע גנוטיפיקציה מהירה ומדויקת של דגי נפח רעילים באמצעות ניתוח של אמפליקונים קטנים מ-PCR. החלק המאכל של דגי הנפח המשמשים להכנת מנת דג הנפח משתנה בהתאם למין הדג, וחלק מהמינים מכילים רעלים בכל רחבי הגוף. שימוש בשריר, בבסיס הסנפיר ובעור של דגי הנפח יכול לסייע בגנוטיפיקציה של דגי הנפח מנקודת מבט של בטיחות מזון מלאה לכולם ולצורכי מחקר.

לביצוע מיצוי DNA באמצעות קיט, ראשית העבירו 30 עד 50 מיליגרם של רקמת דג לשפרופר מיקרוצנטריפוגה בנפח 0.5 או 1.5 מיליליטר. מעכו את הרקמה, ללא סנפיר ועור, באמצעות מיקרוספטולה. הוסיפו 180 מיקרוליטר של בופר ליזיס לרקמת בעלי חיים ו-40 מיקרוליטר של proteinase k וערבבו באמצעות וורטקס למשך זמן קצר.

דגרו בטמפרטורה של 56 °C על מחמם בלוקים למשך שעתיים או במהלך הלילה. צנטריפוגו את הדגימה למשך חמש דקות ב-13000xg. לאחר העברת הנוזל העליון (supernatant) למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה בנפח 1.5 mL, הוסיפו 200 µL מהבופר הצאוטורפי (chaotropic buffer) המכיל guanidine hydrochloride מהערכה.

לאחר מכן, הוסיפו 200 µL של 99.5% ethanol וערבבו באמצעות vortexing. העבירו את התערובת, כולל כל משקע, אל עמודת הספין (spin column) הממוקמת בתוך מבחנת איסוף של 2 mL. לאחר צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-13000xg, השליכו את הנוזל שעבר סינון (flow-through).

הוסיפו 500 µL של תמיסת שטיפה 1, המכילה guanidine hydrochloride מהערכה, וסבבו בצנטריפוגה כפי שבוצע קודם לכן. השליכו את הנוזל שעבר דרך העמודה ואת מבחנת האיסוף. העמידו את עמודת הספין במבחנת איסוף חדשה בנפח 2 mL המסופקת עם הערכה.

הוסיפו 500 µL של תמיסת שטיפה 2 וסובבו בצנטריפוגה במשך שלוש דקות ב-20,000xg. לאחר השלכת הנוזל שpassed-through ושל מבחנת האיסוף, העבירו את עמודת הספין למבחנת צנטריפוגה חדשה בנפח 1.5 mL. טפטפו באמצעות פיפט 200 µL של תמיסת אלוציה למרכז ממבנה עמודת הספין.

לאחר דקה אחת, סנטריפוגה למשך דקה אחת ב-6000xg. לאחר מכן, העבר באמצעות פיפטה 50 µL מהתמיסלה לקובטת UV חד-פעמית. מדוד באמצעות ספקטרופוטומטר את ספקטרום ה-UV של התמיסלה בטווח של 220 עד 300 nm ואת הבליעה ב-260 nm.

השימוש בריאגנטים נטולי דטרגנטים הוא קריטי להצלחת הכרומטוגרפיה נוזלית, כיוון שדטרגנטים עלולים לגרום לנזק לעמודה האנליטית. כדי למנוע זיהום, עבדו בתוך תא עבודה סטרילי (clean bench), והכינו על קרח תגובת PCR בנפח 25 µL עבור כל דגימת DNA שהופקה, עבור ביקורת חיובית ועבור ביקורת שלילית, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לשם נוחות העבודה, הכינו כמות מספקת של תערובת (cocktail) המכילה את כל הריאגנטים ללא ה-DNA התבנית, וחלקו אותה למבחנות.

השתמשו ב-DNA polymerase בעל פעילות proofreading כדי למנוע הוספה של קצות יבלת (overhangs) של אדנין במיקום ה-prime לתוצר ה-PCR. בצעו הגברה של ה-PCR במכשיר thermal cycler באמצעות תוכנית המחזורים המוצגת בפרוטוקול הכתוב. לביצוע העיכול האנזימטי, הוסיפו 2 µL של תמיסת עיכוב אנזימטי לתוכנית ה-PCR.

הוסיפו מיקרוליטר אחד מכל אנזים להגבלה וערבבו בעדינות. הדגירו את הדגימה למשך 30 דקות ב-37 °C בתרמוסייקלר, ולאחר מכן למשך חמש דקות ב-72 °C. סננו את תמיסת התגובה באמצעות התקן סינון צנטריפוגלי של 0.2 עד 0.5 מיקרון כדי למנוע סתימה ולהימנע מפגיעה בעמודה האנליטית.

העבירו את התסנין למבחנה קונוית מפוליפרופילן ואחסנו בטמפרטורה של 20 degrees Celsius עד לניתוח. הכינו תמיסה של hexafluoroisopropanol ו-triethylamine בבקבוק של one liter כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. חברו את הבקבוק לקו A של מכשיר הכרומטוגרפיה הנוזלית, תוך קירור הבקבוק באמצעות מקרר נייד לקירור ישיר כדי למנוע התאיידות.

חבר בקבוק נוסף מלא במתנול לקו B. חבר את עמודת המגן ואת העמודה האנליטית למכשיר. התחל את זרימת הפאזה הניידת הראשונית כדי להגיע לשיווי משקל בעמודות. אם אתה משתמש בספקטרומטר מסות ללא תוכנה לבקרת הלחץ ב-C-Trap, עליך להפחית את הלחץ של ה-C-Trap באמצעות בקרה ידנית של השסתום.

כדי לבצע זאת, משכו את הכפתור כדי לשחרר את הנעילה, וסובבו את הכפתור נגד כיוון השעון באיטיות רבה כדי להפחית את לחץ הוואקום הגבוה ל-1/3. הלחץ המוצג אמור להשתנות בהדרגה ובאופן מושהה. התעלמו מהודעת האזהרה לגבי לחץ נמוך.

דחפו את הכפתור כדי לנעול. לאחר ההגדרות לכיול, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, הזיזו את גשושית היינונית החשמלית (electrospray ionization probe) המחוממת קרוב יותר לממשק של ספקטרומטר המסה במיקום B. חברו את הגשושית למזרק באמצעות צינור. העבירו את חומר הכיול באופן רציף בקצב זרימה של 10 microliters per minute באמצעות משאבת המזרקים המובנית.

בדוק רק את ששת היונים בעלי המסה הנמוכה בטבלת הכיול המותאמת אישית. המשך בכיול לאחר שעוצמת האותים תתייצב. לאחר הכיול, בדוק רק את ששת היונים בעלי המסה הגבוהה והמשך בכיול.

יש להימנע מכיול באמצעות כל היונים בבת אחת כדי למנוע כישלון. העבירו את הגשוש למסירה D עבור קצב זרימה של 0.4 milliliters per minute וחברו למכשיר באמצעות צינור מתכת אינרטי. לאחר הגדרת הפרמטרים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, הוציאו בועות אוויר על ידי הקשה על תחתיתו של הבקבוקון.

הניחו את מבחנאות הדגימה על מתקן הדגימות והזריקו מיקרוליטר אחד של דגימה באמצעות הדגימה האוטומטית כדי להתחיל את האנליזה. פתחו את קבצי הנתונים הגולמיים באמצעות תוכנת דפדפן ואשרו שכל הרכישות הסתיימו בהצלחה, כולל הביקורות החיוביות והשליליות. הגדירו שיטה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב ולאחר מכן לחצו על כפתור ההפעלה (run) בלשונית תור ההפעלה (run cue) כדי להפעיל את תוכנת הדקונבולוציה.

לאחר השלמת התור, בחר שורה ולחץ על "open result" בכותרת העליונה כדי לקבל את תוצאות הדה-קונוולוציה (deconvolution). כאן מוצגים כרומטוגרמות של זרם יונים כולל (total ion current) טיפוסיות שהתקבלו מבקרת שלילית וממדגם של דג נפח. כל שיא מייצג דופלקס של DNA המופרד על בסיס אורכו.

בדוגמה זו, נצפים שלושה שיאים מדגמנית דג הנפח. שיאים אלו הם תוצאה של עיכול האמפליקון באמצעות שתי אנדונוקליאזות. לא נצפו שיאים במדגם של ביקורת השלילה.

כל שיא מייצג ספקטרום מסים המורכב מאיונים בעלי מטען מרובה. הגדלה של ספקטום המסים מאפשרת להבחין בעשרות שיאים בעלי רזולוציה איזוטופית. רזולוציה זו היא תנאי הכרחי לקביעת מסה מונואיזוטופית והיא אפשרית רק באמצעות ספקטרומטר מסים בעל רזולוציה גבוהה.

בדוגמה זו, המסות המונו-איזוטופיות של הפסגה השלישית הן 16296.7656 ו-16468.6616 Daltons. בהתחשב בסבילות מסה של three ppm, הערכים הנמדדים זהים לערכים התאורטיים של takifugu rubripes כפי שמוצג כאן. לאחר שילטה בטכניקה זו, ניתן לבצעה ביום אחד באמצעות מכשירים וציוד נפוצים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לנתח אמפליקונים קטנים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ומספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה לצורך גנוטיפ. ניתן להחיל טכניקה זו בניתוח פולימורפיזמים אחרים של DNA, בתנאי שהשונות ברצף משתקפת באמפליקונים הקטנים המיועדים לניתוח. עם זאת, טכניקה זו מזהה רק הרכבי בסיסים; לא ניתן להבחין בין החלפות בסיסים בתוך אותה מולקולה.