שרשרת פולימראז משופר אורך קטע התגובה הגבלת Genotyping פולימורפיזם של נפוחיתיים רעילים ידי נוזלי כרומטוגרפיה / ספקטרומטריית מסה

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לבצע גנוטיפ מהיר ומדויק של דגי נפוח רעילים על ידי ניתוח מגברי PCR קטנים. החלק האכיל של דג נפוח המשמש להכנת מנת הדג הנפוח משתנה בהתאם למינו וחלק מהמינים מכילים רעלים בכל הגוף. שריר זה, מסד הנתונים ומאסו וסנפיר ועור לידה של דג נפוח יכול לעזור בגנוטיפ של דגי נפוח מנקודת מבט של מזון בטוח לחלוטין לכולם ולחקירה.

כדי לבצע מיצוי DNA באמצעות ערכה, הנח תחילה 30 עד 50 מיליגרם של רקמת דגים בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.5 או 1.5 מיליליטר. מועכים את הרקמה ללא סנפיר ועור, בעזרת מיקרו-מרית. הוסף 180 מיקרוליטר של מאגר הליזיס של רקמת החי ו-40 מיקרוליטר של פרוטאינאז k ומערבולת בקצרה.

דגירה בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס על תנור בלוקים למשך שעתיים או למשך הלילה. צנטריפוגה את הדגימה למשך חמש דקות ב-13000xg. לאחר העברת הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר, הוסף 200 מיקרוליטר של המאגר הכאוטרופי המכיל גואנידין הידרוכלוריד מהערכה.

לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטר של אתנול 99.5% ומערבבים על ידי מערבולת. העבירו את התערובת, כולל כל משקעים, לתוך עמוד הסיבוב המונח בצינור איסוף של שני מיליליטר. לאחר צנטריפוגה של דקה אחת ב-13000xg, השליכו את הזרימה.

הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה אחד, המכיל גואנידין הידרוכלוריד מהערכה, וצנטריפוגה כמו קודם. השלך את הזרימה ואת צינור האיסוף. הנח את עמוד הסיבוב בצינור איסוף חדש של שני מיליליטר המסופק עם הערכה.

הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה שניים וצנטריפוגה למשך שלוש דקות ב-20, 000xg. לאחר השלכת הזרימה וצינור האיסוף העבירו את עמוד הסיבוב לצינור צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. פיפטה 200 מיקרוליטר של מאגר הפליטה למרכז קרום עמוד הסיבוב.

לאחר דקה אחת, צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-6000xg. לאחר מכן פיפטה 50 מיקרוליטר מהאלוטה לקובטה אולטרה סגולה חד פעמית. מדוד את הספקטרום האולטרה סגול של האלואט ב-220 עד 300 ננומטר ואת הספיגה ב-260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.

שימוש במגיב ללא חומרי ניקוי הוא קריטי להצלחת כרומטוגרפיה נוזלית מכיוון שמגיב אכן גורם נזק אפשרי לעמודה האנליטית. עבדו על ספסל נקי כדי למנוע זיהום, הקימו PCR של 25 מיקרוליטר לכל דגימת DNA שחולצה, בקרה חיובית ובקרה שלילית, על קרח כמתואר בפרוטוקול הטקסט. להפעלה קלה, הכינו כמות מספקת של קוקטייל המכיל את כל הריאגנטים ללא DNA תבנית והוציאו אותו.

השתמש ב-DNA פולימראז בעל פעילות הגהה כדי למנוע תוספת של שלושה תלויים ראשוניים של אדנין למוצר ה-PCR. ביצוע הגברת PCR על מחזורי תרמי באמצעות תוכנית המחזור המוצגת בפרוטוקול הטקסט. כדי לבצע את העיכול האנזימטי הוסף שני מיקרוליטר של מאגר העיכול האנזימטי לתמיסת ה-PCR.

מוסיפים מיקרוליטר אחד מכל אנזים הגבלה ומערבבים בעדינות. דגרו את הדגימה למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס במחזור התרמי, ולאחר מכן חמש דקות ב-72 מעלות צלזיוס. סנן את תמיסת התגובה עם מכשיר מסנן צנטריפוגלי של 0.2 עד 0.5 מיקרון כדי למנוע סתימה ולמנוע פגיעה בעמודה האנליטית.

מעבירים את המסנן לבקבוקון פוליפרופילן מחודד ומאחסנים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד לניתוח. הכן תמיסה של hexafluoroisopropanol וטריאתילאמין בבקבוק ליטר אחד כמתואר בפרוטוקול הטקסט. חבר את הבקבוק לקו A של מכשיר הכרומטוגרפיה הנוזלית, קירור הבקבוק באמצעות מקרר נייד לקירור ישיר למניעת אידוי.

חבר בקבוק נוסף מלא במתנול לקו B.חבר את עמוד השמירה ואת העמודה האנליטית למכשיר. התחל להזרים את השלב הנייד הראשוני כדי לאזן את העמודות. אם אתה משתמש בספקטרומטר מסה ללא תוכנה לשליטה בלחץ ה-C-Trap, אתה נדרש להפחית את הלחץ של ה-C-Trap על ידי שליטה ידנית במוט.

לשם כך, משוך את הכפתור כדי לבטל את הנעילה, וסובב את הכפתור נגד כיוון השעון לאט מאוד כדי להפחית את לחץ הוואקום הגבוה ל-1/3. הלחץ המצוין צריך להשתנות בהדרגה בצורה מאוחרת. התעלם מהודעת האזהרה לגבי לחץ נמוך.

לחץ על הכפתור כדי לנעול. לאחר ההגדרה לכיול, כמתואר בפרוטוקול הטקסט, קרב את בדיקת היינון האלקטרו-ספריי המחוממת לממשק של ספקטרומטר המסה במצב B.התחבר לבדיקה ולמזרק עם צינור. החדירו את הקליברנט כל הזמן בקצב זרימה של 10 מיקרוליטר לדקה באמצעות משאבת המזרק המוטמעת.

בדוק רק את ששת יוני המסה התחתונה בטבלת הכיול המותאמת אישית. המשך בכיול לאחר ייצוב עוצמת האותות. לאחר הכיול, בדוק רק את ששת יוני המסה הגבוהים יותר והמשך בכיול.

הימנע מכיול באמצעות כל היונים בבת אחת כדי למנוע כשל. העבר את הגשושית למצב D לקצב זרימה של 0.4 מיליליטר לדקה והתחבר למכשיר באמצעות צינור מתכת אינרטי. לאחר הגדרת הפרמטרים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, נקה בועות על ידי הקשה על תחתית הבקבוקונים.

הנח את בקבוקוני הדגימה על מתלה הדגימה והזריק מיקרוליטר אחד של דגימה באמצעות הדגימה האוטומטית כדי להתחיל בניתוח. פתח את קבצי הנתונים הגולמיים עם תוכנת דפדפן ואשר שכל הרכישות הסתיימו בהצלחה, כולל הפקדים החיוביים והשליליים. הגדר שיטה כמתואר בפרוטוקול הטקסט ולאחר מכן לחץ על כפתור ההפעלה בכרטיסייה רמז הפעלה כדי להפעיל תוכנת דה-קונבולוציה.

לאחר השלמת הרמז, בחר שורה ולחץ על פתח תוצאה בכיתוב העליון כדי לקבל את תוצאות הפירוק. להלן כרומטוגרמה טיפוסית של זרם יונים כולל המתקבלת מבקרה שלילית ודגימת דג נפוח. כל פסגה מייצגת דופלקס DNA המופרד על סמך אורכם.

בדוגמה זו נצפות שלוש פסגות מדגימת הדג הנפוח. שיאים אלה הם תוצאות של עיכול האמפליקון באמצעות שני אנדונוקלאזות. לא נצפו שיאים בדגימת הבקרה השלילית.

כל פסגה מייצגת ספקטרום מסה המורכב מיונים טעונים כפולים. הגדלת ספקטרום המסה מאפשרת להבחין בעשרות פסגות שנפתרו איזוטופית. רזולוציה זו היא תנאי לקביעת מסה מונואיזוטופית והיא אפשרית רק באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה.

בדוגמה זו, המסות המונואיזוטופיות של הפסגה השלישית הן 16296.7656 ו-16468.6616 דלטון. בהתחשב בסובלנות מסה של שלושה ppm, הערכים הנמדדים זהים לערכים התיאורטיים של takifugu rubripes כפי שמוצג כאן. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו ביום אחד באמצעות מכשירים ומכשירים נפוצים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח אמפליקונים קטנים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה לגנוטיפ. ניתן ליישם טכניקה בניתוח פולימורפיזמים אחרים של DNA בתנאי ששונות הרצף באה לידי ביטוי באמפליקונים הקטנים שיש לנתח. עם זאת, טכניקה זו מזהה רק קומפוזיציות בסיס, לא ניתן להבחין בהחלפת בסיס באותו מרקיור.