Name: Assaying הרגלי התזונה הם טורפים ב Pristionchus נמטודות אחרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: למדו לנתח התנהגויות טריפה מורכבות בנמטודות Pristionchus pacificus באמצעות שיטות חדשניות לדימות מבני הפה ומעקב אחרי נשיכות וצריכת טרף. השיטות מאפשרות כימות מהיר ואמין של התאמות אכילה טורפניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר דניאל באמברגר על תמונת התנהגות הטריפה. עבודה זו מומנה על ידי אגודת מקס פלאנק.

1. טופס הפה phenotyping <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי טופס פה על רפידות Agarose הערה: כדי להמחיש את morphs הפה נמטודות, לשתק את התולעים עם טיפול הרדמה קלה על כריות agarose ולבחון כדלקמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצמוח ולשמור על תרבויות נמטודות כגון פ פקיפיקוס ב -6 ס&quot;מ התקשורת צמיחה נמטודות סטנדרטי (NGM) צלחות ניזונים מדשאה בקטריאלי של E. coli OP50 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך רפידות agarose ידי הוספת הראשונה agarose 0.06 גרם עד 3 מ&quot;ל H 2 O בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל לעשות 3 מ&quot;ל 2% פתרון agarose. זה יכול להיות מאוחסן במשך עד שנה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים וממיסים את agarose ביסודיות במיקרוגל או לחילופין להשתמש גוש חום מוגדר&gt; 88 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר נמס לגמרי, מוסיפים 10 μl של פתרון אזיד הנתרן 10% אל agarose ומערבבים היטב. זהירות: אזיד הנתרן יבש הוא מגיב כל הטפסים הם רעילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 1 מ&quot;לmicropipette, במקום ירידה של לא פחות מ -300 μl של תמהיל אזיד agarose נוזלי על באמצע שקופיות מיקרוסקופ זכוכית רגילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני אגר מתקרר, במהירות למקום המיקרוסקופ שקופית שנייה על גבי הירידה כדי לשטח את agarose המהווה כרית בקירור. חזור על פעולה עבור רפידות רבות ככל הנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני השימוש, קליפת לגזרים את שקופיות מיקרוסקופ זכוכית על ידי הזזה אותם אחד אחר. הערה: אם כריות agarose מוכנים מדי זמן רב מראש הם יכולים להיות יבש יתר על המידה עלול לגרום נזק נמטודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעביר תולעי רפידות agarose ההרדמה, במקום ירידה של חיץ M9 (2 - 3 μl) על גבי במרכז הכרית. פיק 2 - 3 צעיר פ מבוגרי פקיפיקוס לתוך הירידה של M9 לפני הצבת לכסות להחליק בזהירות מעל הכרית. פ נמטודות פקיפיקוס יהיה משותק ב agarose ומוכן לדמיין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את שקופית מיקרוסקופ המכילה את התולעת הרדימה אל מיקרוסקופ המתאיםnd להתבונן תחת אופטיקה Nomarski 63X. לסווג זהויות מורף מבוסס על התכונות הבאות: הנוכחות של שן תת-גחון נוסף, שן גב מוגדל ופתיחת פה רחבה מעידה על חית מורף הפה eurystomatous, בעוד שנוכחות שן גב יחיד ופתיחת פה צרה מצביעה על stenostomatous בעלי חיים (איור 1). הערה: על מנת לשמור על בריאות החיה, יש לשמור על תולעים על הכרית אגרה לא יותר מ -5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זיהוי מורף הפה, לשחזר או נמטודות eurystomatous או stenostomatous כנדרש על ידי הסרת להחליק את המכסה על ידי הזזה בעדינות אותה כרית agarose. בזהירות להרים את החיות שנבחרו מפנקס agarose (E. coli OP50 ניתן להשתמש על הבחירה על מנת להבטיח את stickier) לצלחות NGM טריות. אפשר התאוששות מההרדמה עד התנהגות ניע נורמלית חדשה שעליו חיות מוכנות מבחני טורפים נוספים. </li></ol></li> &lt;li&gt; ראפיד הפה phenotyping הערה: לחילופין, עם יותר ניסיון, סוג טופס הפה ניתן assayed ללא צורך בכל טיפול הרדמה באמצעות סטראו עם הגדלה גבוהה (150X). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נמטודות מקום על צלחות תקן NGM עם דשא בקטריאלי של E. coli OP50 על אזור צפיית מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי הבדלים בגודל ורוחב פה. הערה: בהגדלה זו לא שן כמו מבנים ניתנים לצפייה ולכן זיהוי מורף פה מבוסס על פה רחב מול פה צר. </li></ol></li></ol> Assay תנשך 2. הערה: מבחני כסיסה להתיר ניתוח התנהגות טורפים מפורט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצמוח ולשמור על תרבויות נמטודות על צלחות תקן NGM (6 ס&quot;מ) ולהאכיל על הדשא בקטריאלי של E. coli OP50 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך צלחות assay ידי גידול כמות גדולה של זחלים נמטודות טרף נבחר כגון ג elegans או אלternatively טרף מתאים אקולוגי רלוונטי. הערה: מבוגר ג elegans הם גדולים מדי כדי להיות טרף מתאים ולכן חשוב להשתמש בשלב הזחל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על ג elegans או מיני טרף פוטנציאליים אחרים על צלחות תקן NGM ולהאכיל על דשא בקטריאלי של E. coli OP50 עד האוכלוסייה רעב טרי, והתוצאה היא שפע של הזחלים L1 צעירים. הערה: הזמן רעב תלוי רבים גורמים סביבתיים הניסיונות, כוללים מספר נמטודות להשתמש כדי להפעיל את התרבות, את כמות E. coli OP50 הוסיף, ואת טמפרטורת הסביבה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף טרי מורעבות ארבע או יותר צלחות טרף עם M9 ולהעביר פתרון תולעת דרך שני מסננים 20 מיקרומטר להסיר את כל בעלי החיים הגדולים וכל ביצים הנותרות לפני האיסוף בתוך שפופרת 15 מיליליטר. רק זחלים קטנים צריכים להישאר הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי צורה כדורית זחל בצנטריפוגה הטרף המסונן ב 377 XG דקות 1. </li><li&gt; פיפטה 3 μl של גלולת תולעת טהורה לצלחת 6 סנטימטרים NGM ללא E. coli OP50 בהווה לחכות לפחות 30 דקות עבור הזחלים להתפזר מספיק כדי ליצור צלחת assay. הערה: 3 μl של גלולת תולעת טהורה על צלחות assay תקן מכיל&gt; זחלים טרפים 3,000. זה מספיק כדי ליצור קשר תכוף בין טורפים ונטרפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נמטודות טורפות מסך עבור מורף הפה הנדרש (פרוטוקול 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בטכניקות לקטוף תולעת סטנדרטית סטראו אור 19, להעביר טורפים מסווגים כראוי על צלחת assay. תשמור על עצמך כדי להעביר חיידקי OP50 כמה שפחות לצלחת assay בעת העברת טורפים כדי למזער זיהום חיידקים. חכה 15 דקות כדי לאפשר את התולעת להתאושש מן הלחץ של מועברים ולבדוק להתנהגות ניע wild-type כדי להבטיח תולעים לא ניזוקו מההעברה. הערה: אין צורך להרעיב פ pacificus, כפי שהם מאוד טורפים יעילים של זחלים נמטודות אחרים גם כאשר מוזן היטב על חיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאוששות, להתבונן הטורף באמצעות סטראו אור במשך 10 דקות. עם ציוד זה, מלאו אחר ולאפיין אירועי האכלה ברורים, כגון נושך, מאופיין טורף הגבלת התנועה של הטרף; להרוג, שבו על ידי פתיחה לציפורן הטרף מזוהה; והאכלה, מסווג על ידי צריכת נצפה של הקרביים טרף (איור 2 א, ב &#39;ו-סרט 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על assay ידי הקרנת והתבוננות מינימום של 10 נמטודות טורפות הפרט כדי להבטיח דיוק. </li></ol> Assay Corpse 3. הערה: מבחני Corpse להקל על כימות מהיר יותר של התנהגות טורפים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצמוח ולשמור על תרבויות נמטודות על צלחות תקן NGM ולהאכיל על l בקטריאלימלען של E. coli OP50 19. צור triplicates של צלחות assay כאמור (פרוטוקול 2.1 - 2.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נמטודות טורפות מסך עבור מורף הפה נדרש כמתואר בפרוטוקול 1. שימוש לקטוף טכניקות תולעת רגילה וגם נמטודות טורפות אור סטראו העברת 5 עם מורף הפה נדרש כל צלחת assay. השאר טורפים יחד עם הטרף עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 מסך hr הצלחת assay עבור נוכחות של גופות רוקן (תרשים 2B ו- C). זיהוי גופות מהיעדרם של תנועתיות יחד עם פגמים מורפולוגיים ברורים כולל דולף קרבי או חסר שברי תולעת. </li></ol> 4. ניתוח של בלוע ותנועת Tooth <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצמוח ולשמור על תרבויות נמטודות על צלחות תקן NGM ולהאכיל על הדשא בקטריאלי של E. coli OP50 19. צור צלחות assay כאמור (פרוטוקול 2.1 - 2.5). אם 6 ס&quot;מ סטנדרטיצלחות NGM לא מתאימים בין המטרה לבין הבמה מיקרוסקופ, השתמש במכסה של בצלחות פטרי קטן 35 מ&quot;מ המכיל 2 מ&quot;ל NGM כחלופה מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נמטודות טורפות מסך עבור מורף הפה נדרש כמתואר בפרוטוקול 1. באמצעות תולעת תקן לקטוף טכניקות סטראו אור, להעביר טורף יחיד מסווג בצורה נכונה על צלחת assay. חכה 15 דקות כדי לאפשר את התולעת להתאושש מן הלחץ של העברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תצפיות על בעלי חיים טורפים על מיקרוסקופ ב 40 - 63X Normaski, עם מצלמה במהירות גבוהה (סרטים 2 ו -3). שאיבה בלוע להקליט השן תנועה למעלה מ -15 שניות, בתדר 50 הרץ ב 20 חיות לפחות על מנת להבטיח כימות מדויק. Replay רשמה סרטים במהירות הרצויה כדי לספור משאבות בודדות ואירועי שן. הערה: שאיבה הוא ציינה הקורפוס, הממוקם באמצע של הלוע, בעוד תנועת שן ניתן לזהות בפתיחת הפה והוא ob רקמוגש בין השן הגבה. </li></ol>

<ol><li>Wilecki, M., Lightfoot, J. W., Susoy, V., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predatory+feeding+behaviour+in+Pristionchus+nematodes+is+dependent+on+phenotypic+plasticity+and+induced+by+serotonin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Predatory feeding behaviour in Pristionchus nematodes is dependent on phenotypic plasticity and induced by serotonin.</a> J Exp Biol. 218 (Pt 9), 1306-1313 (2015).</li>
<li>Ragsdale, E. J., Muller, M. R., Rodelsperger, C., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Developmental+Switch+Coupled+to+the+Evolution+of+Plasticity+Acts+through+a+Sulfatase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Developmental Switch Coupled to the Evolution of Plasticity Acts through a Sulfatase.</a> Cell. 155 (4), 922-933 (2013).</li>
<li>Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation.</a> WormBook. , 1-14 (2006).</li>
<li>Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode+behavior%3A+the+taste+of+success%2C+the+smell+of+danger%21%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nematode behavior: the taste of success, the smell of danger!</a> Curr Biol. 16 (3), R89-R91 (2006).</li>
<li>Beverly, M., Anbil, S., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneracy+and+neuromodulation+among+thermosensory+neurons+contribute+to+robust+thermosensory+behaviors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Degeneracy and neuromodulation among thermosensory neurons contribute to robust thermosensory behaviors in Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 31 (32), 11718-11727 (2011).</li>
<li>Kimata, T., Sasakura, H., Ohnishi, N., Nishio, N., Mori, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermotaxis+of+C.+elegans+as+a+model+for+temperature+perception%2C+neural+information+processing+and+neural+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Worm%22%5BJournal%5D)">Thermotaxis of C. elegans as a model for temperature perception, neural information processing and neural plasticity.</a> Worm. 1 (1), 31-41 (2012).</li>
<li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Chute, C. D., Srinivasan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mating+cues+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical mating cues in C. elegans.</a> Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).</li>
<li>Sherlekar, A. L., Lints, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode+Tango+Milonguero+-+the+C.+elegans+male%27s+search+for+the+hermaphrodite+vulva%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Nematode Tango Milonguero - the C. elegans male's search for the hermaphrodite vulva.</a> Semin Cell Dev Biol. 33, 34-41 (2014).</li>
<li>Sasakura, H., Mori, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+plasticity%2C+learning%2C+and+memory+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Behavioral plasticity, learning, and memory in C. elegans.</a> Curr Opin Neurobiol. 23 (1), 92-99 (2013).</li>
<li>Avery, L., You, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">C. elegans feeding.</a> WormBook. , 1-23 (2012).</li>
<li>Bumbarger, D. J., Riebesell, M., Rodelsperger, C., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+Rewiring+Underlies+Behavioral+Differences+in+Predatory+and+Bacterial-Feeding+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">System-wide Rewiring Underlies Behavioral Differences in Predatory and Bacterial-Feeding Nematodes.</a> Cell. 152 (1-2), 109-119 (2013).</li>
<li>Dieterich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pristionchus+pacificus+genome+provides+a+unique+perspective+on+nematode+lifestyle+and+parasitism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Pristionchus pacificus genome provides a unique perspective on nematode lifestyle and parasitism.</a> Nature Genetics. 40 (10), 1193-1198 (2008).</li>
<li>Schlager, B., Wang, X. Y., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Cloning+of+a+Dominant+Roller+Mutant+and+Establishment+of+DNA-Mediated+Transformation+in+the+Nematode+Pristionchus+pacificus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Molecular Cloning of a Dominant Roller Mutant and Establishment of DNA-Mediated Transformation in the Nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47 (5), 300-304 (2009).</li>
<li>Witte, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+inactivation+using+the+CRISPR%2FCas9+system+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Gene inactivation using the CRISPR/Cas9 system in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Dev Genes Evol. 225 (1), 55-62 (2015).</li>
<li>Lo, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+and+Heritable+Genome+Editing+in+Evolutionarily+Diverse+Nematodes+Using+TALENs+and+CRISPR%2FCas9+to+Engineer+Insertions+and+Deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Precise and Heritable Genome Editing in Evolutionarily Diverse Nematodes Using TALENs and CRISPR/Cas9 to Engineer Insertions and Deletions.</a> Genetics. 195 (2), 331-348 (2013).</li>
<li>Sommer, R. J., McGaughran, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nematode+Pristionchus+pacificus+as+a+model+system+for+integrative+studies+in+evolutionary+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">The nematode Pristionchus pacificus as a model system for integrative studies in evolutionary biology.</a> Molecular Ecology. 22 (9), 2380-2393 (2013).</li>
<li>Herrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nematode+Pristionchus+pacificus+%28Nematoda+%3A+Diplogastridae%29+is+associated+with+the+oriental+beetle+Exomala+orientalis+%28Coleoptera%3AScarabaeidae%29+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Science%22%5BJournal%5D)">The nematode Pristionchus pacificus (Nematoda : Diplogastridae) is associated with the oriental beetle Exomala orientalis (Coleoptera:Scarabaeidae) in Japan.</a> Zoological Science. 24 (9), 883-889 (2007).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Worm+Lab%3A+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Serobyan, V., Ragsdale, E. J., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+value+of+a+predatory+mouth-form+in+a+dimorphic+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Adaptive value of a predatory mouth-form in a dimorphic nematode.</a> Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 281, 20141334(2014).</li>
<li>Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+behavioral+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+in+precise+spatiotemporal+chemical+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments.</a> Nat Methods. 8 (7), 599-605 (2011).</li>
<li>Yeminin, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nat Methods. 9 (10), 877-879 (2013).</li>
<li>Raizen, D. M., Lee, R. Y. N., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interacting+Genes+Required+for+Pharyngeal+Excitation+by+Motor+Neuron+MC+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Interacting Genes Required for Pharyngeal Excitation by Motor Neuron MC in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 141 (4), 1365-1382 (1995).</li>
</ol>

המחברים אינם מצהירים על אינטרסים פיננסיים או מתחרים.

נמטודות לספק מערכת רב עוצמה להבנת לנוירוביולוגיה והתנהגות עם ג elegans עד כה להיות הכלי העיקרי. עם זאת, מינים רבים, כולל נמטודות פ התנהגויות תצוגה פקיפיקוס, אשר נעדרות או להשתנות מורכבות מן ג אורגניזם המודל elegans ולכן להעלות שאלות מרתקות לגבי האבולוציה ורגולציה של התנהגויות אלו. אחת התנהגויות נוספות כגון נמצאו במינים נמטודות רבים אחרים, כוללים פ פקיפיקוס הוא היכולת להשלים את תזונת החיידקים שלהם על ידי עוסקי האכלת טורפי 1, 20. יש אפוא פתחנו ותארנו פרוטוקול מפורט לאפיון קל ומהיר של התנהגויות טורפים לא מוסברות בעבר אלה נמטודות. ראשית, ספקנו שיטות למסך וריאציות האכלת מנגנון בתוך הפה נמטודות. זיהוי של סוג הפה הנכון הוא של חיוני ראשוןTEP עבור מבחני טריפה מוצלחים כמו, לפחות בתוך סוג Pristionchus רק חיות eurystomatous מסוגלות האכלה טורפת. עדיף לזהות פי morphs עם &quot;phenotyping פה המהיר&quot; הפרוטוקול המתואר בפרוטוקול 1.2 כמו שיטה זו היא הרבה פחות פולשני ולכן זה פחות סביר כי התנהגויות טורפים עשויות להיות מוטרדות. עם זאת, מומלץ להכיר הראשונה עם המבנים ושפה ידי הזדהות עם חיות הרדימו על רפידות אגרו (פרוטוקול 1.1). בעקבות זיהוי של מורף הפה הרצוי, שתארנו שני מבחנים לכימות האכלה טורפת. אלה הם &quot;assay גופה&quot; מהיר, גבוהה תפוקה (פרוטוקול 3) וכן זמן רב יותר אבל יותר מעמיק ניתוח התנהגות הדרך &quot;assay הביס&quot; (פרוטוקול 2). שני פרוטוקולים אלה הם מאוד גמישים המאפשרים מספר שינויים כדי לייעל את מבחני תלוי experimenדרישות טל. עבור מבחני ביס באמצעות פ טורפים פקיפיקוס על ג elegans טרף, תצפיות של אינטראקציות התנהגותיות טורפות עבור חלון זמן של 10 דקות היו די כדי לכמת כמות משמעותית של עקיצות יחד עם אירועי האכלה אחרים. עבור &quot;מבחני גופה&quot; שוב ניצול פ טורפים פקיפיקוס על ג elegans טרף, 5 טורפים עבור שעה 2 מיוצר מספרי גופה לכימות ועקביים בקלות המאפשר ניתוח התנהגות מהיר. עם זאת, יש לציין מינים שונים של מהלך נמטודות טורף במהירויות שונות, לאכול בשיעורים שונים ובאופן כללי להפגין מגוון גדול בהתנהגויות אחרות 1. בנוסף, מיני טרף שונים ניתן לאכול גם בשיעורים שונים מסיבות דומות. לכן מומלץ לבצע אופטימיזציה של המבחנים מבוססים על המינים נמטודות נבדקים הם טורפים ונטרפים, וכן לכל הבדלים בתנאים סביבתיים. במהלך שני &quot;ביס&quot; ו &quot;חילמבחני דואר &quot;זה קריטי, כי הן טרף טורפים הם בריאים, כפי הדגיש או טורפים פצועים לא יהרגו ביעילות. בנוסף, צלחות assay טריות חיוניות כמו צלחות מבוגרים יכול להיות התייבשו אשר משפיעה לרעה על הבריאות של נמטודות המובילה שגוי מבחנים. כמו כן יש לקוות כי שיפורים עתידיים מבחני טורפים אלה יוכלו לנצל את השיפורים האחרונים בטכנולוגיה כדי להפוך את מרבית הניתוח כמו הושג על חקירת התנהגויות רבות שנצפו C. elegans 21, 22. נכון לעכשיו בעיות צפויות להתעורר נמטודות כגון פ פקיפיקוס כפי שהם מופיעים הרבה יותר רגישים כדי ליצור קשר, מה שהופך בידוד וקיבוע בתאי microfluidic עשויים לבטל האכלה טורפת. התגברות זו עשויה להוכיח מאתגר אבל תקל נמטודות פרט שיוקרה עבור מתוחכם טורפים התנהגויות. לבסוף, יש לנו גם בתנאי שיטות FOr בחינת מנגנון האכלה נמטודות עצמה לסייע להשוואה בין טורפים חיידקי מצבי האכלה על ידי כימות קינטיקה השן השאיבה בלוע באמצעות מצלמה במהירות גבוהה (פרוטוקול 4). כימות של שיעורי השאיבה בלוע ב C. elegans נוצל כדי לפקח האכלה במשך שנים רבות 23, לעומת זאת, ג elegans חסר כל צורה של הפה denticle וגם חסר התנהגויות טורפות. באמצעות שילוב של כימות של בלוע שאיבה עם זה של פעילות שן, כל עצבוב של השיניים ספציפיות טריפה ניתן לצפות גם. בשל ההגדלה הנדרשת כדי להתבונן בתנועת שן החיות לעתים קרובות לעזוב את מישור המוקד, ולכן הוא בדרך כלל רק ניתן לראות את השן עבור חלונות זמן קצרה. בנוסף, שלא כמו ג elegans, הלוע של פ פקיפיקוס לא לשאוב ברציפות, אלא עוסק לחשים של שאיבה והאכלה. לכן, עבור pum בלוע מדויקשיעורי פינג בזמן ההאכלה שייקבעו, חשוב להקליט 15 שניות של האכלה רציפה. שיטות אלה שהוצגו כאן ולכן מספקות את המסגרת הראשונה על חקירת התנהגויות טורפות במערכות נמטודות. יתר על כן, הם יכולים גם להיות בעל יכולת הסתגלות לשימוש בחקירת אינטראקציות אחרות בתוך המערכת האקולוגית נמטודות כוללת השפעת אורגניזמים רלוונטי גם מבחינה אקולוגית על טריפה כולל מיקרואורגניזמים, פטריות קרדית . לכן הם מספקים אמצעי לנתח כיצד התנהגויות טורפים אלה מוסדרות, וכיצד הם עשויים התפתחו גם המשמעות האקולוגית שלהם.

נמטודות עם מערכות העצבים הקטנות אך מורכבות שלהם הוכיחה כלים רבים עצמה להבנת היבטים רבים של לנוירוביולוגיה כולל התנהגות. הרבה של מחקר זה התמקד אורגניזם המודל Caenorhabditis elegans שבו שפע של התנהגויות שונות כבר גזור בהצלחה ונותח. אלה כוללים mechanosensory 3, 4 chemotactic, thermotactic 5,6 ו magnetotactic 7 משפיעי הזדווגות 8,9, למידת 10 והאכלת התנהגויות 11. עם זאת, אחרים יותר מינים נמטודות קרובים רחוקים להציג התנהגויות שאינן שנצפתה rhabditid ג elegans או לחילופין להראות רמות נוספות של מורכבות, מה שמעלה שאלות ענייניות לגבי האבולוציה והרגולציה שלהם. מקרה אחד כזה זה יכול להיות שנצפה נמטודות diplogastrid קרוב רחוק Pristionchus פקיפיקוס, המציג הרבה יותר מורכב האכלה להיותhaviors ומקצבים מאשר הם נצפו ב C. elegans 1. זאת למרות שני המינים שיתוף נוירונים בלוע הומולוגי 12. בד בבד עם הרגלי תזונה נוספים הללו, פ פקיפיקוס מציג גם מגוון תזונתי מורחב, כפי שהם טורפים נלהבים, מסוגלים להשלים דיאטת החיידקים שלהם על ידי ההאכלה גם על הזחלים של נמטודות אחרות. למרבה המזל, פ פקיפיקוס פותח כמודל ביולוגיה האבולוציונית השוואתית ואינטגרטיבית ולכן הרבה כלים מולקולריים וגנטיים זמינים כעת. אלה כוללים הגנום רצף ובהערות מלאים 13, כלים מולקולריים וגנטיים כולל transgenes 14 ו CRISPR / Cas9 15,16 וכן תולדות גזע מפורטות המבואר גם 17 עם מעל 25 מינים קרובים כולל מיני האחות שהתגלו שלה. בנוסף, האקולוגיה של מינים רבים Pristionchus כולל פ פקיפיקוס היא שאנחנוll מוגדר עם מינים רבים ועכשיו לאחר תואר שיתוף עמותה necromenic עם חיפושיות חיפושית, שורה הם חולקים לעתים קרובות עם מינים אחרים נמטודות 18. פ פקיפיקוס ולכן מספק מערכת מודל מצוינת כדי לנתח את ההתפתחות של התנהגויות רומן והמשמעות האקולוגית שלהם. על מנת לנתח את הרגלי התזונה הם טורפים במינים נמטודות כגון פ פקיפיקוס פתחו מספר מבחני התנהגות חדשניים התבוננות קלה וכימות של פעולות טורפים. כפי P. פקיפיקוס מציג מבנה פה דימורפית, המשפיע התנהגות טורפים מאוד, זיהוי של morphotype הנכונה הוא 1,2 חיונית. מורף stenostomatous פה הצר מכיל שן גב בוטה יחיד ואינו לעסוק בכל האכלה טורפת. לחלופין, מורף eurystomatous הרחב פה כולל שן גב הרבה יותר גדול בצורת טפר נוסף מנוגדותשן תת-גחון, אשר מפעיל יחדיו כדי לפתוח את לציפורן של טרפם ביעילות. היחס בין eurystomatous טורף לטופס stenostomatous שאינו הטורפים משתנה בין מיני Pristionchus וגם בתוך פ פקיפיקוס, לעומת זאת, אחוז מהפה eurystomatous מורף ב פ סוג זן פראי פקיפיקוס (PS312) הוא בדרך כלל 70 - 90% 2. בנוסף, יחסי טופס פה עשויים להשתנות בהתאם שונה והשפעות סביבתיות (הן ידועות, כוללים הרעבה וכמה מולקולה קטנה איתות כמו גם גורמים לא ידועים), ובכך זיהוי נכון ובידוד של טופס פי eurystomatous טורפים חיוני מבחני טורפים מוצלחים. לצד התיאור של טופס הפה הטורף פתחנו &quot;assay ביס&quot; להתבוננות ישירה וכימות של התנהגויות טורפים כולל נושך, הרג האכלת אירועים. הנה נמטודות טרף מבודדת באמצעות מסנןing של תרבויות מורעבות חדש נחשף פ מבוגר טורפים פקיפיקוס, אשר הם נצפו יחד במהלך פרק זמן קצר. בנוסף, אנו גם פתחנו &quot;assay גופה&quot; גבוהה תפוקה כדי להקל לסינון מהיר של התנהגות טורפים באמצעות תצפית עקיפה של אירועים טורפים. זו מנצלת את הנוכחות של גופות זחל ככלי למסך הטריפה. מבחני שניהם מספקים שיטות קלות דיר ביותר עבור צפייה למדידת התנהגות טורפים במינים נמטודות כגון פ פקיפיקוס.

<table><tbody><tr><td>מסנני רשת ניילון (20 & # 181; m)</td> <td>Merck Millipore Ltd</td><td>NY2004700</td><td>משמש לסינון תולעים רק משאיר זחלים לשימוש כטרף.</td></tr><tr><td>משפך PP למסנן (54 מ"מ)</td><td>דוראן</td><td>292215003</td><td>משמש לסינון תולעים רק משאיר זחלים לשימוש כטרף.</td></tr><tr><td>צלחת פטרי קטנה (35/10 מ"מ)</td><td>גריינר ביו-וואן&nbsp;</td><td>627102</td><td>להדמיה במצלמה במהירות גבוהה</td></tr><tr><td>Zeiss SteREO Discovery V12</td><td></td><td></td><td>לזיהוי צורת הפה</td></tr><tr><td>Axio-Imager A1</td><td></td><td></td><td>לזיהוי צורת הפה</td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית</td><td>Roth</td><td>H869</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי מחליק</td><td>Roth</td><td>657</td><td></td></tr><tr><td>Motion Scope M3 מצלמה במהירות גבוהה</td><td>IDT</td><td></td><td>מצלמה במהירות גבוהה</td></tr><tr><td>זום וידאו 44 ENG 1/2 אינץ' 0.5X עד 2.4X</td><td>Zeis</td><td>452984-0000-000</td><td>זום מצלמה במהירות גבוהה</td></tr><tr><td>מדיום גידול נמטודה (NGM) מרכיבים:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>אגר</td><td>רוט</td><td>5210.2</td><td>CAS-Nr. 9002-18-0</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>רוט</td><td>3957</td><td>CAS-Nr. 7647-14-5</td></tr><tr><td>בקטו טריפטון</td><td>BD</td><td>211699</td><td>לוט 4316614</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט (CaCl<תת>2)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C3306</td><td>CAS-Nr. 10035-04-8</td></tr><tr><td>כולסטרול מלנולין</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' F 26732 00050</td><td>CAS-Nr. 57-88-5</td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט הפטהידרט (MgSO4)</td><td>Merck</td><td>1,058,861,000</td><td>CAS-Nr. 10034-99-8</td></tr><tr><td>אשלגן דימימן פוספט (KH2PO4</ תת>)</td><td>ACROS organics</td><td>271080025</td><td>CAS-Nr. 7778-77-0</td></tr><tr><td>6 ס"מ צלחת פטרי</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>3.5 ס"מ צלחת פטרי</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>M9 רכיבים:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אשלגן דימימן פוספט (KH<תת>2PO4)</td><td>ACROS organics</td><td>271080025</td><td>CAS-Nr. 7778-77-0</td></tr><tr><td>נתרן מימן פוספט הפטאהידראט (NaHPO<תת>4)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9390-500G-D</td><td>CAS-NR. 7782-85-6</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>רוט</td><td>3957</td><td>CAS-Nr. 7647-14-5</td></tr></tbody></table>

assaying הרגלי התזונה הם טורפים ב<em&gt; pristionchus</em&gt; נמטודות אחרים

Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

פרוטוקול זה מספק שיטות מרובות לניתוח וכימות של התנהגויות האכלה טורפות בנמטודות. מינים רבים של נמטודות כולל Pristionchus pacificus מציגים התנהגויות מורכבות, שהבולטת שבהן היא טריפה של זחלי נמטודות אחרות. עם זאת, מכיוון שהתנהגויות אלה נעדרות באורגניזם המודל Caenorhabditis elegans, הן תוארו עד כה בפירוט רק לאחרונה יחד עם פיתוח מבחנים התנהגותיים אמינים 1. התנהגויות טורפות אלה תלויות בצורות פה פלסטיות אך קבועות פנוטיפיות, מה שהופך את הזיהוי והסיווג הנכונים של בעלי חיים אלה לחיוניים. ב-P. pacificus ישנם שני סוגי פה, ה-stenostomatous וה-eurystomatous morphs 2, כאשר רק ה-eurystomatous בעל הפה הרחב מכיל שן נוספת ומסוגל להרוג זחלי נמטודות אחרים. באמצעות בידוד של שפע של זחלי טרף תואמים בגודל וחשיפה לאחר מכן לנמטודות טורפות, בדיקות הכוללות הן "מבחני גופה" והן "מבחני נשיכה" על נמטודות שינוי פה שזוהו כהלכה אפשריות. בדיקות אלו מספקות אמצעי לכימות מהיר של שיעורי הצלחת הטריפה ומספקות ניתוח התנהגותי מפורט של נמטודות בודדות העוסקות בפעילויות האכלה טורפות. בנוסף, באמצעות מצלמה מהירה מתאפשרת גם הדמיה של שינויים בפעילות הלוע כולל דינמיקת שיניים ושאיבה.

<html> בעקבות זיהוי מוצלח של מורף הפה המתאים פ פקיפיקוס, הבדלים ברורים בין חיות eurystomatous ו stenostomatous ניתן לאתר (איור 3) עם חי eurystomatous רק העוסקות בהעברת התנהגות. אצל בעלי חיים stenostomatous שההתנהגות הזאת להיות מורחק לחלוטין. יתר על כן, הבדלי שאיבת פעילות בלוע שן של חיות eurystomatous על חיידקי טרף (איור 4 וסרטים 2 ו -3) ניכרים גם. בעוד האכלה טורפת, את קצב השאיבה מצטמצם מתחת לזה שנצפה במהלך האכלת חיידקים ותנועת שן הוא זוהה אחד יחס אחד עם שאיבת הבלוע. זה מעיד באופן פוטנציאלי של מנגנוני ויסות מפתח ויסות תגובה התנהגותית כדי שונות דיאטה. s / ftp_upload / 54,404 / 54404fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1. פ יש פקיפיקוס פה dimorphism המשפיע האכלה התנהגות. (א) טופס הפה eurystomatous מסוגל טריפה ויש לו פתיחת פה רחבה עם שן הגבי גדול בצורת טפר (שקר בצבע אדום) ו- (ב) שן תת-גחון בצורת וו יריב גדול (שקר בצבע כחול). (ג) טופס הפה stenostomatous הוא מסוגל רק כדי להאכיל על חיידקים ויש לו פתיחת פה צרה עם שן גב בצורת צור (שווא בצבע אדום) ו- (ד) לא שן תת-גחון (*). תמונות Normaski הן 63X וברי מידה מייצגת 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig1large.jpg" target="_blank">לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54404/54404fig2.jpg" /> <strאונג&gt; איור 2. מבחני טריפה. (א) פ פקיפיקוס נושך והורג את הזחלים של נמטודות אחרות כגון ג elegans. (ב) מבחני נושך, מספר bitesby טורפים (*) ניתן לצפות באמצעות סטראו אור והרג מוצלח האכלת אירועים גם מוקלטים. גופות הן גם נראו בבירור (עיגולים). (ג) עבור מבחני גופה, פגרי זחל (חיצים) ניתן בקלות זיהו לעומת חי זחלים. סרגל קנה מידה מייצג 1 מ&quot;מ B ​​ו- 150 מיקרומטר ב C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54404/54404fig3.jpg" /> איור 3. תוצאות של נשיכה מבחני Corpse על ג elegans טרף. (א) התנהגות לנשוך רק ניכר<html> בצורת הפה eurystomatous עם התנהגות זו אינה מוצגת בחיות stenostomatous. שגיאת עמודה מייצגת סטיית התקן של 10 חזרות. (ב) בד בבד עם שום התנהגות נשכנית ניכרה מבעלי חי stenostomatous, מבחני גופה חושפים גם פגרים רק על צלחות assay של חיות eurystomatous. שגיאת עמודה מייצגת סטיית התקן של 5 חזרות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54404/54404fig4.jpg" /> איור 4. Eurystomatous לשואב דרג שן תנועה במשך טורפי האכלה. תנועת שן הוא ציין רק בעוד חיות eurystomatous עוסקות האכלה טורפת. זה גם עולה בקנה אחד עם ירידת שאיבת בלוע. שגיאת עמודה מייצגת סטיית התקן של 10 חזרות.<html> יעד href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig4large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="סרט 1" src="/files/ftp_upload/54404/54404movie1.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/Movie_1_Killing_behaviour.mp4">סרט 1. תצפית של הריגת התנהגות עבור Assay תנשך באמצעות אור סטראו. (קליק ימני להוריד).</a> <img alt="סרט 2" src="/files/ftp_upload/54404/54404movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/Movie_2_HS_Camera_Killing.mp4">סרט מצלמה מהירה סרט 2. של פ פקיפיקוס הרג ג elegans זחלים. (קליק ימני להוריד).</a> המודעה / 54,404 / 54404movie3.jpg &quot;/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/Movie_3_HS_pumping_and_tooth.mp4">סרט 3. גדלת המצלמה המהירה של תנועת שן במהלך הטריפה. (קליק ימני להוריד).</a>

בדיקות התנהגותיות מספקות כלים רבי עוצמה להבנת תפקוד עצבי. כאן אנו מציגים מספר פרוטוקולים לכימות התנהגות האכלה טורפת שנמצאו בנמטודת המודל Pristionchus pacificus וקרובי משפחתה. בנוסף, אנו מספקים שיטות לניתוח התאמות האכלה טורפות כולל מבני פה ושיניים.

Assaying הרגלי התזונה הם טורפים ב<em&gt; Pristionchus</em&gt; נמטודות אחרים

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including ...

המטרה הכוללת של הליכים אלו היא לנתח באופן מהימן התנהגויות האכלה מורכבות בנמטודות טורפות באמצעות מספר בדיקות (assays) חדשניות. שיטות אלו יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה ההתנהגותית, כגון ויסות של התנהגויות מורכבות חדשות, ואף לאבולוציה שלהן. היתרונות העיקריים של טכניקות אלו הם שהן מספקות שיטות מהירות וניתנות לחזרה קלה, במטרה לתצפת על התנהגויות האכלה טורפות בנמטודות ולכמת אותן, כולל באורגניזם המודל Pristionchus pacificus.על מנת להדמיא את מבני הפה של הנמטודות, יש להשבית תחילה את התולעים באמצעות טיפול באלחשון עדין על גבי פד agarose בריכוז 2% שהוכן טרי. להכנת הפד, יש להוסיף בזהירות 10 µL של תמיסת sodium azide בריכוז 10% לשלושה מיליליטר של agarose מומס ולערבב היטב. sodium azide הוא חומר ריאקטיבי ורעיל, לכן יש לנקוט באמצעי זהירות מתאימים.לאחר מכן, טפטפו לפחות 300 µL מהתערובת למרכזו של סלייד זכוכית סטנדרטי למיקרוסקופ והשתמשו בסלייד נוסף כדי להשטיח את האגרוזה. השאירו את הסלייד העליון במקומו עד לרגע השימוש בפד. כדי להכין את הפד לשימוש, הסירו את הסלייד העליון והוסיפו טיפה של M9. לאחר מכן, בחרו שניים או שלושה תולעים, הניחו אותם בתוך הטיפה והניחו בזהירות זכוכית כיסוי.הבחנו בתולעים באמצעות אופטיקת Nomarski בפיגור של 63x כדי לסווג את זהותן המורפולוגית. שן גבית מוגדלת, שן סוב-ונטרלית נוספת או פתח פה רחב ומוגדל הם כולם מאפיינים של בעל חיים eurystomatous. לעומת זאת, שן גבית בודדת ופתח פה צר יותר מעידים על בעל חיים stenostomatous.בתוך חמש דקות, הוצא את הנמטודות מרפיד ההרדמה. החלק בעדינות את כיסוי הזכוכית והעבר אותן לצלחת MGM רעננה. המתן עד שהן יפגינו התנהגות ניידת לפני ביצוע ניתוחים נוספים.עם ניסיון רב יותר, ניתן לבחון את המורף ללא טיפול באלחוש. העבירו 10 עד 20 נמטודות מלוח תרבית סטנדרטי ללוח טרי שזריעתו היא שכבת חיידקי OP50, לצורך טיפוס פנוטיפי מהיר של צורת הפה באמצעות מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה גבוהה. לאחר מכן, זהו הבדלים בגודל וברוחב הפה.בהגדלה זו לא ניתן להבחין במבנים דמויי שיניים, לכן יש לזהות מורפולוגיות של פה על סמך רוחבן. כך ניתן להבדיל בין פה רחב לפה צר. הכינו את פלטות הבדיקה על ידי גידול של כמות גדולה של זחלי נמטודות טרף נבחרים, כגון זחלי *C. elegans* או טרף רלוונטי מבחינה אקולוגית.הרעיבו ארבעה מוחות או יותר של מין הטרף כדי לאסוף את ה larvae בשלב L1. לאחר מכן, שטפו את המוחות ב-M9 והעבירו את התוצר דרך שני מסננים של 20 micron. רק ה larvae הקטנים אמורים להישאר בתמיסה.שקעו את הזחלים ב-377 g למשך דקה אחת. הסירו את עליית ה-M9 לכלי איסוף פסולת וקחו מנה של 3 µL של משקע תולעים טהור. הניחו את התולעים במרכז פלטת MGM של 6 ס"מ ללא E.coli והניחו להן להתפשט למשך כחצי שעה.בהמשך, השתמשו בזחלים עבור בדיקת הנשיכה. העבירו את הטורפים לצלחת הבדיקה עם כמה שפחות מחיידקי OP50. עבור P.pacificus, הוסיפו חמישה טורפים לצלחת.המתינו 15 דקות כדי לאפשר לבעלי החיים שהועברו להתאושש מהלחץ. לאחר 15 דקות, התולעים אמורות לנוע באופן רגיל, אחרת ייתכן שהן נפגעו. כעת צפו ורשמו אירועים מובחנים של אחד מהטורפים במשך 10 דקות.נשיכה מאופיינת על ידי הגבלת תנועת הטרף על ידי הטורף. ההריגה מתרחשת כאשר הקוטיקולה של הטרף נפתחת. האכלה מאופיינת בצריכה נראית עיניי של פנים הטרף.יש לתבחן לפחות 10 נמטודות טורפות בודדות כדי להבטיח דיוק. ניתן לצפות בשאיבה הלועית (Pharyngeal pumping) ובתנועת השיניים תחת אופטיקת Nomarski בהגדלה של 40 עד 63x, ולהקליט באמצעות מצלמה במהירות גבוהה בתדר של 50 hertz. לאחר הקלטת קטעים של 15 שניות עבור לפחות 20 בעלי חיים, ניתן לנתח את הסרטונים באופן מהימן.ניתן להבחין בפעולת שאיבה בקוורפוס (corpus), הממוקם במרכז הלוע. תנועת שיניים ניתנת לזיהוי בפתיחת הפה ונצפית רק מהשן הגבית. לאחר שעתיים של טריפה, סרקו את הצלחת כדי לאתר גוויות ריקות.זהו את הגופות לפי היעדר תנועה ופגמים מורפולוגיים ברורים, כולל דליפה של איברים פנימיים או חסרונם של מקטעי תולעת. לאחר זיהוי מוצלח של מורפולוגיית הפה המתאימה ב-P.pacificus, נצפו הבדלים ברורים בין בעלי פה רחב (eurystomatous) לבין בעלי פה צר (stenostomatous). רק בעלי פה רחב הפגינו התנהגות של הריגה.יתרה מכך, ניכרות הבדלים בפעילות השיניים ובשאיבה הלועית של בעלי eurystoma בעת התזינות מבקטריות לעומת טרף. במהלך הזנה טורפת, קצב השאיבה פוחת בהשוואה לזה שנצפה במהלך הזנה מבקטריות, ותנועת השיניים מסונכרנת עם השאיבה הלועית. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה לגבי השילוב של בדיקות שונות אלו במטרה לאפיין התנהגויות הזנה טורפיות מורכבות בנמטודות, כולל באורגניזם המודל Pristionchus pacificus.

assaying-predatory-feeding-behaviors-pristionchus-other

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

סרטון זה מציג כימוטקסיס בנמטודה C. elegans ומציג פרוטוקול לדוגמה הבודק סלידה כימוטקטית מנחושת גופרתית.

ג. אלגנס בדיקת כימוטקסיס: שיטה לבדיקת כימוסנסציה בתולעים

סרטון זה מתאר בדיקת הימנעות אוסמוטית לבחינת התנהגות כימו-הימנעותית במודל תולעת טרנסגנית. התנהגות הימנעות נבדקת בצלחת בנוכחות מחסום אוסמוטי גבוה ו chemoattractant. התולעים עם אובדן תפקודי של נוירונים נמשכות על ידי הכימואטרקנט, חוצות את המחסום האוסמוטי הגבוה והופכות משותקות באזור המלכודת בגלל תמיסת ההרדמה.

לבחון התנהגות כימו-הימנעותית בתולעים טרנסגניות באמצעות בדיקת הימנעות אוסמוטית

נמטודות Entomopathogenic הן תולעים עגולות המאכלסת-אדמה שparasitize מגוון רחב של חרקים. אנו מדגימים שיטות דגימה המשמשות לבידוד של נמטודות אלו מהאדמה באמצעות שתי טכניקות: מתגרה חרקים והמלכודת לבנה שונה, להחלמתם של נמטודות מדגימות קרקע וגופות חרקים נגועות, בהתאמה.

דגימת קרקע ובידוד של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

מוצג פרוטוקול לחקירת התנהגות ההזדווגות של נמטודת עץ האורן, Bursaphelenchus xylophilus. מאפיינים התנהגותיים של B. xylophilus מתוארים בתהליך ההזדווגות.

תצפית כימות התנהגות החיזור של נמטודות פיינווד, Bursaphelenchus xylophilus

כאן, אנו מציגים assay Caenorhabditis elegans- Specific שנועד להעריך שינויים התנהגות הנטייה נחושת ואת היכולת לאתר מקור מזון משותף, כמו האורגניזם מתקדמת ממצב תזונה רעב עד כדי רעב.

א<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; מצב תזונתיים מבוססי Assay Assersion

אנו מציגים התנהגות הקלטה הקלטה ופרוטוקול המאפשר ניתוח אוטומטי של נמטודות, Caenorhabditis elegans 'העדפת תרכובות מסיסות באסאי מבוסס האוכלוסייה. מאמר זה מתאר את הבנייה של תא התנהגות, פרוטוקול assay התנהגותי, וניתוח וידאו השימוש בתוכנה.

ניתוח אוטומטי של אוכלוסיה מבוססת נמטודות מבוססי Assay העדפה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לחילוץ יעיל של נמטודות חיות ממצעים טבעיים בשטח.

בידוד מהיר של נמטודות פראיות על ידי משפך ברמן

פרוטוקול זה יכול לשמש לביצוע סקרים אקולוגיים בקנה מידה גדול של נמטודות Caenorhabditis עצמית. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא ארגון יעיל וניתוח של נתונים אקולוגיים ומולקולריים הקשורים לנמטודות שנאספו מהטבע.

גישה מדרגית מאוד לביצוע סקרים אקולוגיים של נמטודות קאנורהבדיטיס Selfing

Caenorhabditis elegans הוא אחד ממיני המודל העיקריים בביולוגיה, אך כמעט כל המחקר מתבצע בהיעדר מיקרובים הקשורים אליו באופן טבעי. השיטות המתוארות כאן יסייעו לשפר את הבנתנו את מגוון המיקרובים הקשורים כבסיס למחקר פונקציונלי עתידי של C. elegans.

בידוד ואפיון המיקרוביוטה הטבעית של מודל נמטודה Caenorhabditis elegans

כאן, מדווח על מערכת לחקר התנהגויות קולקטיביות של נמטודות על ידי טיפוחן בכמויות גדולות באמצעות מדיום אגר מזון לכלבים. מערכת זו מאפשרת לחוקרים להפיץ מספר גדול של תולעי דאואר וניתן ליישם אותה על Caenorhabditis elegans ומינים קרובים אחרים.

טיפוח בקנה מידה גדול של נמטודות כדי ללמוד את ההתנהגויות הקולקטיביות שלהם

מחקר זה העריך את הפעילות הביולוגית של תמציות Tithonia diversifolia באמצעות שיטות מבוססות רדיקלים ובדיקת בקיעת ביצים במבחנה (EHA) כדי להעריך את השפעותיהן על נמטודות במערכת העיכול במעלי גירה קטנים. המתודולוגיה והממצאים העיקריים מתוארים, ומדגישים את הפוטנציאל של תמציות אלה להדברת טפילים.

הערכת תכונות נוגדות חמצון ואנטלמינטיות של תמציות Tithonia diversifolia כנגד ביצי נמטודות במערכת העיכול באמצעות מבחני מבחנה

למדו לנתח התנהגויות טריפה מורכבות בנמטודות Pristionchus pacificus באמצעות שיטות חדשניות לדימות מבני הפה ומעקב אחרי נשיכות וצריכת טרף. השיטות מאפשרות כימות מהיר ואמין של התאמות אכילה טורפניות.

Assaying הרגלי התזונה הם טורפים ב

גלה סרטונים נוספים