Name: איתור תיוג זיקה של אנדוגני רצפטורים מעוברים דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: למד את שיטת AFLIP לזיהוי קולטנים בדג הזברה באמצעות תיוג זיקה ואימונופרסיפיטציה. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור רמות ביטוי של קולטני גורמי צמיחה בעוברים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לז'ילברטו מוראלס על הטיפול בדגים ותחזוקתם, ולד"ר קלאודיה ריברה ולד"ר הקטור מלגון (מתקן בעלי חיים IFC-UNAM) על עזרתם בחיסון ארנבות. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-CONACYT 131226 ו-PAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916.

כל הניסויים שבוצעו בחיות אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים במעבדה ושימוש של האוניברסיטה הלאומית האוטונומית של מקסיקו (UNAM), תחת מספר CICUAL-Protocol: FLC40-14. (CICUAL: &quot;פסקה Comité Institucional אל Cuidado y שימוש עכשווי de los Animales דה Laboratorio del Instituto de Celular Fisiologìa, México Universidad de הלאומית האוטונומית&quot;). 1. הכנת תמצית חלבון העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף 100 - 200 עובריים עבור כל תנאים להשוות (morphants לעומת סוג בר) בשלב רצוי עבור שלאחר הפריה למשל 72 שעות (hpf). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברת מקום צלחות פטרי המכילות מי דגים (ראה טבלה 1) באופן ידני dechorionate עובר באמצעות קנס שקצו מלקחיים. הימנע משימוש pronase במהלך שלב זה (או כל פרוטאז אחר ברחבי לפרוטוקול) כפי שהוא עשוי לעכל את הקולטן הממוקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים מקום בתוך שפופרת 1.5 מ&quot;ל microfuge ולשטוף עוברים twקרח עם פתרון חיץ פוספט 1x (PBS) (ראו טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של חיץ deyolk (ראה טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר ביותר של חלמון ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה (כ -30 - 40 פעמים) את העוברים בתמיסה. במשך 72 hpf ו -48 עובר hpf להשתמש טיפי פיפטה כחולים וצהובים, בהתאמה. טיפים צהובים ייתכן שיהיו צורך לחתוך מעט כדי למנוע השמדה עוברת. מהדורת החלמון המוצלחת יכולה להיבדק על ידי התבוננות עוברים תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עוברים על ידי צנטריפוגה ב 600 XG במשך 15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant בזהירות באמצעות pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עוברים פעמיים עם 500 חיץ כביסה μl (ראה טבלה 1) על ידי vortexing בעדינות במהירות הנמוכה ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עוברים על ידי צנטריפוגה ב 600 XG במשך 15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מכאן, להמשיך את ההליך ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant בזהירות באמצעות pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים Resuspend ב 350 μl של חיץ תמוגה (ראה טבלה 1) ו homogenize באמצעות עלי פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עוברים lysed 30 דקות עם תסיסה על כיסא נדנדה מבחנה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysed העוברת על 11,000 XG במשך 15 דקות על מנת להסיר שאריות מסיסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת פינת supernatant באמצעות pipet לצינור טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע חלבון הכולל ידי השיטה ברדפורד 4, או הליך מתאים אחר. אם assay ברדפורד משמש, לבצע את עקומת הכיול בנוכחות ריכוזים המקבילים של המתנות דטרגנטים במאגר תמוגה, כפי שהן גורמות הערכה נמוכה מדי של החלבון 4 הסטנדרטי. </li></ol> 2. איתור של חלבון קולטן אנדוגני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיקה סימון Immunoprecipitation (כל השלבים הבאים ב 4 מעלות צלסיוס) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 400 - 500 מיקרוגרם של חלבון העובר סך צינור 1.5 מ&quot;ל microfuge לדלל עד 1 מיקרוגרם / μl עם חיץ 1 (ראה טבלה 1). הערה: על מנת לקבל 500 מיקרוגרם של חלבון העובר בסך הכל, כ 100 - 200 עוברים חייבים להיות מעובד בתחילה. 72 hpf עוברים באופן שגרתי להניב ~ 5 מיקרוגרם של חלבון העובר הכולל, וזה מספיק לגילוי betaglycan. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח מספיק של מניות TGF-β2 שכותרתו להגיע לריכוז סופי של 150 בערב, דגירה עם תסיסה על hr נדנדה 2 מבחנה ב 4 מעלות צלזיוס. חייב להיות מתויג TGF-β2 לפני AFLIP הוא התחיל, עם 125 ואני בשיטת T chloramine כפי שתואר על ידי Cheifetz et al. 5. זהירות: השתמש מגן כדי לצמצם את החשיפה תוך טיפול 125 ואני שכותרתו ליגנד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח מספיק של נוגדן חי נגד הקולטן של עניין על מנת להגיע דילול 1: 100 ולהמשיך דגירה של עוד 2 שעות ב 4 ° C (דגירה יכולה להיות O / N). זהו דילול אופטימלי של antiserum # 31, ששימשו במחקר זה מתואר במקומות אחרים 3, אבל תלוי באיכות שלtibody, דילול גדול יותר או קטן יותר עשוי להיות אופטימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של חרוזים מחייבים אימונוגלובולינים מתאימים (למשל, G- חלבון-Sepharose, אשר היה equilibrated בעבר TNTE ו resuspended 1: 5 של נפח המקורי TNTE) דגירה במשך 50 דקות עם תסיסה על כיסא נדנדת מבחנה ב 4 ° ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את החרוזים על ידי microcentrifugation ב 11,000 XG במשך 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant במיכל אשפה רדיואקטיבית המתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים-חרוזים IP עם 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף IP (ראו טבלה 1), על ידי vortexing ו microcentrifugation ב 11,000 XG במשך 20 שניות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend IP-החרוזים 250 μl של חיץ לשטוף IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 μl של disuccinimidyl suberate (DSS, מומס DMSO ב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל). הכן את פתרון DSS רק לפני השימוש בו בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C עם תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להרוות את התגובה crosslinking, להוסיף 500 μl of IP לשטוף חיץ, השלימו עם מספיק טריס-Cl-pH 7.4 המניה להגיע 25 מ&quot;מ טריס-Cl. הקבוצות אמינו חופשיות ב טריס ללכוד DSS unreacted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 11,000 XG במשך 20 שניות כדי לאסוף IP-חרוזים להשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend IP-החרוזים 30 μl של צמצום מאגר Laemmli. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיח דגימות 5 דקות ב 94 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לנתח דגימות דלפק גמא באמצעות הפרוטוקול של היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות בכפוף denaturing SDS-PAGE. השתמש polyacrylamide על האחוז המתאים המסה של הקולט ולהפעיל ג&#39;ל תחת הליך רגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול ג&#39;ל בתמיסה מקבעת (ראה טבלה 1) במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ג&#39;ל עם מים distillated במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ג&#39;ל בנייר מסנן hydrated בעבר ומכסים בניילון נצמד הסרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ל ניקוי על 80 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף ג&#39;ל על scre phosphorimager לבןen ב RT O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק מסך חשוף באמצעות phosphorimager באמצעות הפרוטוקול של היצרן. </li></ol></li></ol>

<ol><li>López-Casillas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+the+membrane+proteoglycan+betaglycan%2C+a+component+of+the+TGF-%CE%B2+receptor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system.</a> Cell. 67 (4), 785-795 (1991).</li>
<li>Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transforming+growth+factor-beta+receptor+type+III+is+a+membrane+proteoglycan.+Domain+structure+of+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor.</a> J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).</li>
<li>Kamaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+knock-down+causes+embryonic+angiogenesis+defects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish.</a> Genesis. 53, 583-603 (2015).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Sensitive+Method+for+the+Quantitation+of+Microgram+Quantities+of+Protein+Utilizing+the+Principle+of+Protein-Dye+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Cheifetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+transforming+growth+factor-b+receptor+subsets+as+determinants+of+cellular+responsiveness+to+three+TGF-b+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms.</a> J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).</li>
<li>López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+presents+ligand+to+the+TGF%CE%B2+signaling+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor.</a> Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Maccari, F., Volpi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+specific+recognition+of+glycosaminoglycans+by+antibodies+after+their+separation+by+agarose+gel+electrophoresis+and+blotting+on+cetylpyridinium+chloride-treated+nitrocellulose+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes.</a> Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).</li>
<li>Volpi, N., Maccari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosaminoglycan+blotting+and+detection+after+electrophoresis+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).</li>
<li>Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+avidin-biotin+interaction+in+immunoenzymatic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques.</a> J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).</li>
<li>Bratthauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avidin-biotin+complex+%28ABC%29+method+and+other+avidin-biotin+binding+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).</li>
<li>Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+by+125I-cationized+cytochrome+c+of+proteoglycans+and+glycosaminoglycans+immobilized+on+unmodified+and+on+positively+charged+Nylon+66%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66.</a> Anal. Biochem. 165 (2), 448-455 (1987).</li>
<li>Das, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+radiolabeling+of+a+cell+surface+receptor+for+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor.</a> PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).</li>
<li>Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nerve+growth+factor+receptor+protein+in+sympathetic+ganglia+membranes+by+affinity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling.</a> J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).</li>
<li>Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+resolution+of+three+major+insulin+receptor+structures+with+unique+subunit+stoichiometries%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries.</a> PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).</li>
<li>Hoosein, N. M., Gurd, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Glucagon+Receptors+in+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain.</a> PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השימוש כתם המערבי עם נוגדן ספציפי נגד חלבון של עניין הוא כלי רב ערך כדי ללמוד את ביטוייה 7 במהלך embryogenesis. עם זאת, immunoblotting של חלבונים הפערים glycosylated לא היה מוצלח מאוד בשל העברתם יעיל מחייב חלש ממברנות nitrocellulose או PVDF 8,9. Proteoglycans הם דוגמה טובה של חיסרון זה, בגלל שרשראות גליקוז המצורפים שלהם קוולנטית (GAG) כי הם טעונים שלילית ואינם נקשרים היטב משני משטחי קלקר או ...

זיהוי ספציפי של חלבונים המתבטאים במהלך ההתפתחות העוברית נדרש כדי לאמת פרופילי ביטוי המתקבלים על ידי מדידת ה-mRNA הקוגנטיים שלהם עם RT-PCR או הכלאה במקום (ISH). זה מושג בדרך כלל על ידי כתם מערבי של תמציות עוברים ואחריו זיהוי עם נוגדנים ספציפיים. עם זאת, קשה ליישם גישה זו על חלבונים הנמצאים בשפע נמוך מאוד, או שיש להם תכונות המעכבות את העברתם הכמותית במהלך הכתמתם. בטאגליקן, הידוע גם כקולטן β גורם גדילה טרנספורמטיבי מסוג III (TGF-β) (TGFBR3), הוא דוגמה לקשיים אלה. TGFBR3 הוא פרוטאוגליקן ממברנה במשרה חלקית הקושר TGF-β דרך חלבון הליבה שלו1, עם זיקה גבוהה יותר באופן משמעותי לאיזופורם TGF-β2, תכונה המבדילה אותו מכל חלבון קושר TGF-βאחר 2. TGFBR3 בדג הזברה מתבטא מ-8 hpf ואילך, ומגיע למקסימום של 72 hpf, כפי שזוהה על ידי RT-PCR של ה-mRNA3 שלו. 
עם זאת, למרות זמינותו של נוגדן ספציפי מאוד3, כל ניסיון לזהות את התוצר המתורגם שלו על ידי Western Blot לא צלח. מתוך התחשבות באופי הפרוטאוגליקני של TGFBR3, כמו גם השפע הנמוך המשוער עשויים להיות אחראים לכישלון זה, הומצאה שיטת זיהוי, AFLIP, המנצלת את הזיקה הגבוהה של TGFBR3 ל-TGF-β2. בשיטה זו, תמצית חלבון מעוברים מאוגדים מורשית לקשור באופן ספציפי 125TGF-β2 המסומנים ב-I, וקומפלקסי הקולטן-ליגנד מטוהרים על ידי משקעים חיסוניים ומקושרים לפני ההפרדה על ידי SDS-PAGE. דפוסי הנדידה שנצפו על ידי אוטורדיוגרפיה של הג'לים חשפו את נוכחותם ואופיים של מיני הקולטנים המסומנים. גישה זו משלבת את הספציפיות של ליגנד של תיוג זיקה עם משקעים חיסוניים על ידי נוגדנים ספציפיים, הגדלת טווח הזיהוי, הימנעות מכתמי העברה לא יעילים של TGFBR3. בשל תכונותיו הטבועות, בדיקת AFLIP אינה בדיקה כמותית אך ניתן להשתמש בה כדי לאמוד בביטחון הבדלים ניסויים יחסיים בקולטן המנותח.

<table><tbody><tr><td>Disuccinimidyl suberate (DSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21555</td><td></td></tr><tr><td>חלבון G Sepharose 4 זרימה מהירה</td><td>GE Healthcare מדעי החיים</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>מייבש ג'ל דגם 583&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651745</td><td></td></tr><tr><td>טייפון 9400</td><td>GE Healthcare מדעי החיים</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr><tr><td>קוברה II מונה גמא אוטומטי</td><td>קלטת חשיפה פקארד</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>דינמיקה מולקולרית</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>Na2</ תת>HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3828</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246</td><td></td></tr><tr><td>CH3OH</td><td>J.T. Baker</td><td>9070</td><td></td></tr><tr><td>CH3COOH</td><td>J.T. Baker</td><td>9508</td><td></td></tr><tr><td>HCHO</td><td>J.T. Baker</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Sea Marine Mix</td><td>Marine Enterprises International</td><td>http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix</td><td></td></tr></tbody></table>

איתור תיוג זיקה של אנדוגני רצפטורים מעוברים דג הזברה

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

על ידי שילוב הכוחות של Affinity Labeling ו-Immunoprecipitation (AFLIP), יושמה טכניקה לזיהוי קולטנים בשפע נמוך בעוברי דג הזברה. טכניקה זו מנצלת את הסלקטיביות והרגישות המוענקות על ידי תיוג זיקה של קולטן נתון על ידי הליגנד שלו עם הספציפיות של המשקעים החיסוניים. השתמשנו ב-AFLIP כדי לזהות את קולטן TGF-β מסוג III (TGFBR3), הידוע גם בשם בטאגליקן, במהלך התפתחות מוקדמת של דג הזברה. AFLIP היה חיוני באימות היעילות של פנוטיפ דג זברה מורפנט TGFBR3. בשלב הראשון מכינים תמציות חלבון עוברי ומשמשות ליצירת 125קומפלקסים I-TGF-β2-TGFBR3 המטוהרים על ידי משקעים חיסוניים. מאוחר יותר, קומפלקסים אלה מקושרים קוולנטית ונחשפים באמצעות הפרדת SDS-PAGE וזיהוי אוטורדיוגרפיה. טכניקה זו דורשת זמינות של ליגנד מסומן עבור הקולטן ונוגדן ספציפי כנגדו, והיא תותאם בקלות לזיהוי כל גורם גדילה או קולטן ציטוקינים העומד בדרישות אלה.

איור 1 מציג תוצאה נציג שהושג עם AFLIP. אותות ליין 1 באים 125 ליגנד קשרו קוולנטית או חלבון ליבת betaglycan דג הזברה (ליבת BG, מתחת 150 בסמן KDA) או בליבתו BG כי תעובד לצורת proteoglycan שלה על ידי התקשרות של glycosaminoglycans (GAG, למרוח החל 170 kDa לחלק העליון של הג&#39;ל). דפוס זה של הגירה, חלבון ליבה חד בתוספת proteoglycan מרווחת (בשל ההטרוגניות אורך שרשרות GAG), הוא מאפיין של TGFBR3 2. מאז DSS אינו לקשר קו...

מתוארת טכניקה חדשה לאיתור קולטנים אנדוגניים בשפע נמוך הקיימים בעוברי דג הזברה. קראנו לו AFLIP מכיוון שהוא מורכב מתיוג זיקה של הקולטן על ידי הליגנד שלו המקושר למשקעים חיסוניים.

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות רצפטורים לגורמי גדילה בשכיחות נמוכה בעוברים של דגי זברה, באמצעות שילוב של הסלקטיביות והרגישות של סימון זיקה (affinity labeling) של הרצפטור הנבחר על ידי הליגנד הרדיואקטיבי שלו. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות בתחומי הביולוגיה ההתפתחותית, כגון רמות ביטוי של רצפטורים ותכונותיהם הביוכימיות. שיטה זו, לה כינינו AFLIP, מרחיבה את התכונות התיאוריות העוצמתיות של סימון זיקה, טכניקה מבוססת בביולוגיה של התא, למחקרי התפתחות של דגי זברה.כדי להתחיל בנוהל זה, אספו 100 עד 200 עוברים עבור כל תנאי וסמנו אותם בצלחות פטרי המכילות מי דגים. לאחר מכן, בצעו דה-כוריאציה (הסרת מעטפת) ידנית של העוברים באמצעות פינצטה בעלת חוד דק, והימנעו משימוש ב-pronase או בכל פרוטאז אחר לאורך הפרוטוקול, שכן אלה עלולים לעכל את הרצפטורים המיועדים. לאחר מכן, העבירו את העוברים לפ menutup של מיקרופוגה בנפח 1.5-milliliter ושטפו אותם פעמיים עם 1X PBS.לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של תמיסת הסרת חלמון (deyolking buffer). שחררו את רוב החלמון על ידי פיפטינג עדין של העוברים בתוך התמיסס למעלה ולמטה כ-30 עד 40 פעמים. עבור עוברים בני 72 HPF ו-48 HPF, השתמשו בקצות פיפטה כחולות וצהובות בהתאמה.ייתכן שיהיה צורך לקצץ מעט את הקצוות הצהובים כדי למנוע פגיעה בעוברי. ניתן לוודא כי שחרור החלמון הצליח על ידי תצפית על העוברים תחת המיקרוסקופ. הסרת החלמון חייבת להיות מלאה ככל האפשר, שכן ליפידים וחלבונים מהחלמון עלולים להפריע לשלבים הבאים של קישור ליגנדים או נוגדנים.לאחר מכן, אספו את העוברים באמצעות צנטריפוגה ב-600 x g למשך 15 שניות. השליכו בזהירות את הנוזל העליון באמצעות פיפטה. לאחר מכן, שטפו את העוברים פעמיים עם 500 microliters של בופר שטיפה על ידי ערבוב עדין ב-vortex במהירות הנמוכה ביותר.לאחר מכן, אספו את העוברים על ידי סנטריפוגציה ב-600 x g למשך 15 שניות. מעתה ואילך, המשיכו בביצוע הפרוטוקול בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הנוזל העליון בזהירות בעזרת פיפטה.לאחר מכן, נתלה את העוברים ב-350 µL של לביז בופר (lysis buffer) ונבצע הומוגנציה באמצעות פסטל פלסטיק. לאחר מכן, נדגיר את העוברים המולyses למשך 30 דקות עם טלטול על גבי רוקר למבחנות בטמפרטורה של 4 °C. לבסוף, נסחרב את העוברים המולyses ב-11,000 x g למשך 15 דקות כדי להסיר את השאריות הבלתי ממיסות.לאחר מכן, העבירו את העילאי המצנח לנבובית נקייה. קבעו את כמות החלבון הכוללת באמצעות בדיקת חלבון בשיטת Bradford והכמירו עקומה לכיול. בשלב זה, הכניסו 400 עד 500 micrograms של חלבון עובר כולל לנבובית מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter ודללו אותו לריכוז של one microgram ל-microliter באמצעות באפר 1.בשלב הבא, הוסיפו מלאי של TGF-beta II המסומן ב-Iodine-125 כדי להגיע לריכוז סופי של 150 picomolar, והדגירו עם ערבול על מכשיר נדנדה למבחנות למשך שעתיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו נוגדן לא דלול כנגד הרצפטור הרלוונטי כדי להגיע לדילול של 1:100. לאחר מכן, המשיכו את הדגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים נוספות או למשך הלילה.לאחר הדגירה, הוסף 50 µL של חרוזי קישור לאימונוגלובולין המתאימים והדגר למשך 50 דקות תוך써 ערבוב על נענעת מבחנות (test tube rocker) בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, השג את החרוזים באמצעות מיקרוצנטריפוגה ב-11,000 x g למשך 20 שניות והסר את supernatant לתוך מכל פסולת רדיואקטיבית מתאים. לאחר מכן, שטוף את חרוזי ה-IP שלוש פעמים עם 1 mL של בופר שטיפה ל-IP על ידי vortexing ומיקרוצנטריפוגה ב-11,000 x g למשך 20 שניות בכל פעם.לאחר מכן, השביה מחדש את חרוזי ה-IP ב-250 µL של חוצץ שטיפה ל-IP. הכן תמיסת DSS טרייה והוסף 1.5 µL ממנה לדגימה. לאחר מכן, דגור את הדגימה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C עם ערבוב.כדי לעצור את תגובת הקישור הצולב, יש להוסיף 500 µL של IP wash buffer מועשר במלאי של tris chloride ב-pH 7.4 עד להגעה לריכוז של 25 mM tris chloride. לאחר מכן, יש לצנטריפוג ב-11,000 ×g למשך 20 שניות כדי לאסוף את ה-IP beads. לאחר מכן, יש להשליך את העילוי ולסספנדור מחדש את ה-IP beads ב-30 µL של reducing laemmli buffer.בשלב הבא, הרתיחו את הדגימה בטמפרטורה של 94 °C למשך חמש דקות לפני ביצוע electrophoresis של ג'ל SDS-PAGE, ולאחר מכן נתחו את הג'לים המיובשים בפוספורומטר או באמצעות autoradiography קונבנציונלית. דמות זו מציגה תוצאות מייצגות שהתקבלו באמצעות AFLIP. חלבון כולל שהוצא מהעוברים ב-72 hpf וב-48 hpf עבר סימון זיקה של Iodine-125 TGF-beta II, ולאחריו IP עם rabbit anti-zebrafish BG או rabbit anti-rat BG כביקורת.בבדיקת האוטורדיוגרפיה, ניתן לזהות את BG ללא GAG או כ-BG המשונה על ידי גליקוזאמינוגליקן. איור זה מדגים כיצד ניתן להשתמש ב-AFLIP כדי להעריך את רמות הביטוי של רצפטור מסוים בעוברים שהוכפפו למניפולציה ניסויית, ובמקרה זה, הפחתה של betaglycan באמצעות הזרקת מורפולינו. נתיב אחד מראה את הרמה של TGF beta receptor III בעובר מסוג wild-type בגיל 72 hpf, בעוד שנתיב שני מראה את ההשפעה של מתן שבעה ננוגרמים של מורפולינו המכוון לגבול שבין exon 2 ל-intron 2 של התמליל הראשוני של ZFPG. שימו לב כי ה-downregulation של BG שהתקבל עם מורפולינו זה אינו מופיע בביקורת ה-mismatched שלו.תוצאות אלו אישרו כי הפנוטיפ שהתקבל באמצעות מורפולינו זה היה ספציפי להשתקה (knockdown) של TGF beta receptor III כפי שתואר בעבר. ההצלחה של AFLIP לזיהוי קולטני גורמי גדילה או ציטוקינים תלויה בזמינותו של ליגנד מסומן רדיואקטיבית, שביכולתו להיקשר ולהצלב (cross-link) עם הקולטן שלו. כמו כן, נדרש נוגדן איכותי לצורך immunoprecipitation.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי. מכיוון ש-AFLIP נמנעת משלב ההעברה של ה-western blot, היא מאפשרת זיהוי משופר של קולטנים בעלי גליקוזילציה גבוהה. ראינו זאת כאן עבור הפרוטאוגליקן betaglycan, אשר העברתו ב-western blot אינה יעילה כלל. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון עיכול אנזימטי, כדי לתאר מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות נוספות, כל עוד הן ניתנות לגילוי באמצעות טכניקות אלקטרופורזיות.לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה לגבי האופן שבו AFLIP יכול לסייע לכם בזיהוי רספטורים בריכוז נמוך במספר עוברים של דגים, באמצעות סימון זיקה המשולב עם שיקוע חיסוני (immunoprecipitation). לבסוף, אל תשכחו כי עבודה עם Iodine-125 חייבת להתבצע בזהירות ובמיגון הולם. בהצלחה בניסוייכם.

affinity-labeling-detection-endogenous-receptors-from-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך המעצבים את העובר המוקדם הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. אנו מתארים כאן טכניקה תיוג תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים עוברי דג הזברה שלם עם חלבון הממברנה ממוקד, פלורסנט ירוק.

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

פרוטוקול זה מתווה דרך התווית להתחקות אחר גורלו של קבוצות קטנות של דג הזברה עוברים התאים באמצעות UV-משחררות רפרוף של והעמסת בכלוב, ואחריו הר שלם immunolabeling כדי להגביר את האות והעמסת את שברחה מכלוב.

Lineage תיוג של תאים דג הזברה עם לייזר Uncagable והעמסת dextran

השיטה מתוארת על photoactivate תאים בודדים המכיל חלבון פלואורסצנטי בכלוב באמצעות שני פוטונים קליטה מתוך טי: לייזר ספיר מתנד femtosecond. כדי למפות גורל התא photoactivated, אימונוהיסטוכימיה משמשת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לכל סוג תא.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

סרטון זה מדגים בדיקת ספיגת נוגדנים לאיתות Notch/DeltaD באבות גליה רדיאלית של דגי זברה. היא כוללת הרכבה של עוברי דגי זברה דכוריוניים משובצים באגרוז, הזרקת תמיסת צבע המכוונת לליגנדות DeltaD על RGPs, והדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחלוקת תאים אסימטרית המאשרת את הפעלת האיתות Notch/DeltaD.

בדיקת ספיגת נוגדנים לאיתות חריץ הדמיה / DeltaD באבות גליה רדיאלית של דגי זברה

שתואר כאן הוא פרוטוקול להדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה.

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות דג הזברה עובר.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

פיתוח cilia חיוני organogenesis נכונה. פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה תווית, דמיינו תאים ciliated של דג זברה.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

פרוטוקול זה ממחיש החיסונית רציפים של האנטי ואימונוהיסטוכימיה על קריודורים מן השלב המוקדם של העוברים ומאפשרים לניתוחי לוקליזציה מדויקים באוכלוסיות תאים ספציפיות.

מרפאוולוגיה רציפה ואימונוהיסטוכימיה על קריוסינות עוברי דג

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תמונות על ידי שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה של חלקים עובריים של דגי זברה. הכלאה באתרו בוצעה לפני הקפאה, ואחריה הכתמת נוגדנים. כדאי לזהות את דפוסי הביטוי של שני גנים בדגי זברה אם יש מיעוט נוגדנים.

ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned

עבודה זו מפתחת בדיקת ספיגת נוגדנים להדמיית איתות תוך שושלת Notch/DeltaD בחלוקת אבות גליה רדיאלית במוח דג הזברה העוברי.

בדיקת ספיגת נוגדנים למעקב אחר אנדוציטוזה מסוג חריץ / דלתא במהלך החלוקה הא-סימטרית של אבות גליה רדיאלית של דגי זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימון חלבונים עם תג חלבון פלואורסצנטי בזחלי דג הזברה, מערכת in vivo שפותחה לאחרונה ושונתה שימושית במיוחד להדמיית חלבונים בשפע נמוך בדג הזברה.

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

למד את שיטת AFLIP לזיהוי קולטנים בדג הזברה באמצעות תיוג זיקה ואימונופרסיפיטציה. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור רמות ביטוי של קולטני גורמי צמיחה בעוברים.

איתור תיוג זיקה של אנדוגני רצפטורים מעוברים דג הזברה

גלה סרטונים נוספים