איתור תיוג זיקה של אנדוגני רצפטורים מעוברים דג הזברה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות קולטנים של גורם גדילה בשפע נמוך בעוברי דג הזברה על ידי שילוב הסלקטיביות והרגישות של תיוג הזיקה של הקולטן הנבחר על ידי הליגנד הרדיואקטיבי שלו. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בתחומי ביולוגיה התפתחותית כגון רמות ביטוי קולטנים ותכונותיהם הביוכימיות. שיטה זו שכינינו AFLIP מרחיבה איכויות תיאוריות עוצמתיות של תיוג זיקה, טכניקה מבוססת היטב של ביולוגיה של התא למחקרים התפתחותיים של דג הזברה.

כדי להתחיל בהליך זה, אספו 100 עד 200 עוברים לכל מצב והניחו אותם בצלחות פטרי המכילות מי דגים. לאחר מכן יש לפרק ידנית את העוברים באמצעות מלקחיים עדינים ולהימנע משימוש בפרונאז או בכל פרוטאז אחר לאורך הפרוטוקול מכיוון שהוא עלול לעכל את הקולטנים הממוקדים. לאחר מכן, הניחו את העוברים בצינור מיקרופוגה של 1.5 מיליליטר ושטפו אותם פעמיים עם 1X PBS.

לאחר מכן מוסיפים 500 מיקרוליטר של מאגר חלמון. שחררו את רוב החלמון על ידי פיפטינג עדין של העוברים בתמיסה למעלה ולמטה כ-30 עד 40 פעמים. עבור 72 עוברי HPF ו-48 HPF, השתמש בקצות פיפטה כחולות וצהובות בהתאמה.

ייתכן שיהיה צורך לחתוך מעט את הקצוות הצהובים כדי למנוע הרס העוברים. ניתן לבדוק שחרור חלמון מוצלח על ידי התבוננות בעוברים במיקרוסקופ. הסרת החלמון חייבת להיות מלאה ככל האפשר מכיוון ששומנים וחלבונים של חלמון עלולים להפריע לשלבי קשירת הליגנד או הנוגדנים הבאים.

לאחר מכן, אספו את העוברים בצנטריפוגה בטמפרטורה של 600 x גרם למשך 15 שניות. השליכו בזהירות את הסופרנטנט בעזרת פיפטה. לאחר מכן, שטפו את העוברים פעמיים עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה על ידי מערבולת עדינה שלהם במהירות הנמוכה ביותר.

לאחר מכן אסוף את העוברים על ידי צנטריפוגה ב-600 x גרם למשך 15 שניות. מכאן ואילך יש להמשיך בהליך בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט בזהירות בעזרת פיפטה.

לאחר מכן, אנו משעים את העוברים ב-350 מיקרוליטר של מאגר ליזה והופכים אותם להומוגניזציה באמצעות עלי פלסטיק. לאחר מכן דגרו על העוברים הליזים למשך 30 דקות עם תסיסה על נדנדה במבחנה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צנטריפוגה של העוברים הליזים ב-11,000 x גרם למשך 15 דקות על מנת להסיר את הפסולת הבלתי מסיסה.

לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט הנקי לצינור טרי. קבע את החלבון הכולל על ידי בדיקת חלבון ברדפורד ועקומת כיול העלילה. בשלב זה, הניחו 400 עד 500 מיקרוגרם של חלבון עוברי כולל בצינור מיקרופוגה של 1.5 מיליליטר ודללו אותו למיקרוגרם אחד למיקרוליטר עם בופר 1.

לאחר מכן, הוסף מלאי יוד-125 תווית TGF-beta II כדי להגיע לריכוז סופי של 150 פיקומולר ולדגור בתסיסה על נדנדה של מבחנה למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף נוגדן לא מדולל כנגד קולטן הריבית על מנת להגיע לדילול של 1:100. לאחר מכן המשיכו את הדגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים נוספות או למשך הלילה.

לאחר הדגירה יש להוסיף 50 מיקרוליטר של חרוזי קשירת אימונוגלובולין מתאימים ולדגור למשך 50 דקות בתסיסה על נדנדה של מבחנה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שחזרו את החרוזים על ידי מיקרו-צנטריפוגה ב-11,000 x גרם למשך 20 שניות והשליכו את הסופרנטנט למיכל אשפה רדיואקטיבי מתאים. לאחר מכן, שטפו את חרוזי ה-IP שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מאגר שטיפת IP על ידי מערבולת במיקרו-צנטריפוגה ב-11,000 x גרם למשך 20 שניות בכל פעם.

לאחר מכן השעו מחדש את חרוזי ה- IP ב -250 מיקרוליטר של מאגר שטיפת IP. הכן תמיסת DSS טרייה והוסף 1.5 מיקרוליטר ממנה לדגימה. לאחר מכן, דגרו את הדגימה למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה.

על מנת להרוות את תגובת הקישור הצולב, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר שטיפת IP בתוספת מלאי כלוריד טריסט מספיק ב-pH 7.4 כדי להגיע ל-25 מילי-מולארי טריסט כלוריד. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 11, 00 x g למשך 20 שניות לאיסוף חרוזי IP. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את חרוזי ה-IP ב-30 מיקרוליטר של מאגר לאמלי מפחית.

לאחר מכן, הרתיחו את הדגימה ב-94 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות לפני אלקטרופורזה של ג'ל SDS-PAGE ולאחר מכן נתחו את הג'לים המיובשים במד זרחן או על ידי אוטורדיוגרפיה קונבנציונלית. איור זה מציג את התוצאות המייצגות שהתקבלו באמצעות AFLIP. סך החלבון שהופק מהעוברים ב-72 hpf ו-48 hpf היה נתון לתיוג זיקה של יוד-125 TGF-beta II ואחריו IP עם ארנב נגד דג זברה BG או ארנב נגד חולדות BG כביקורת.

באוטורדיוגרפיה, ניתן לזהות סוכר ללא GAG או כסוכר מהונדס על ידי גליקוזאמינוגליקן. איור זה מראה כיצד ניתן להשתמש ב-AFLIP כדי לאמוד את רמות הביטוי של קולטן נתון בעוברים הנתונים למניפולציה ניסיונית, במקרה זה, הירידה של בטאגליקן להזרקת המורפולינו. נתיב אחד מראה את רמת קולטן TGF בטא III בעובר מסוג בר של 72 hpf, בעוד נתיב שני מראה את ההשפעה של מתן שבעה ננוגרם של מורפולינו המכוון לגבול האקסון 2-אינטרון 2 של התעתיק הראשוני של ZFPG. שימו לב שהפחתת ה-BG המתקבלת עם מורפולינו זה אינה משוכפלת על ידי הבקרה הלא תואמת שלו.

תוצאות אלו אישרו כי הפנוטיפ שהתקבל עם מורפולינו זה היה ספציפי להפלת קולטן TGF beta III כפי שתואר קודם לכן. ההצלחה של AFLIP לאיתור גורם גדילה או קולטני ציטוקינים תלויה בזמינות של ליגנד עם תווית רדיו שניתן לקשור ולקשר לקולטן שלו. נדרש גם נוגדן טוב למשקעים חיסוניים.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי. מכיוון ש-AFLIP נמנע משלב ההעברה של הכתם המערבי, הוא מאפשר זיהוי משופר של קולטנים מסוכררים בכבדות. וראינו כאן עבור הבטאגליקן הפרוטאוגליקני אשר עובר בצורה מאוד לא יעילה בכתם המערבי בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו עיכול אנזימטי על מנת לתאר שינויים נוספים לאחר התרגום כל עוד הם מתגלים על ידי טכניקות אלקטרופורטיות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד AFLIP יכול לעזור לך לזהות קולטנים בשפע נמוך במספר עוברי דגים על ידי תיוג זיקה הקשור למשקעים חיסוניים. לבסוף, אל תשכח שעבודה עם יוד-125 חייבת להיעשות בזהירות ובהגנה נאותה. בהצלחה בניסויים שלך.