Name: הכנת דוגמאות MALDI אחידה עבור יישומים כמותי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: למדו שיטת הכנה מתקדמת לדוגמאות MALDI אחידות באמצעות שליטה בטמפרטורת הרצפה ובזרימות הידרודינמיות. הטכניקה מפחיתה הטרוגניות מרחבית באותות יונים ומשפרת את אמינות תוצאות הספקטרומטריה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי המרכז לחקר הגנומיקה, האקדמיה הסינית ומשרד המדע והטכנולוגיה של טייוואן, הרפובליקה של סין (חוזה מס' 104-2119-M-001-014).

הערה: פרוטוקול זה מפותח להפחתת ההטרוגניות המרחבית של שבר maltotriose ו ברדיקינין (1-7) מוכן עם שיטת רביב היבש. הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים, כולל הכנה נפשית מראש, בתצהיר מדגם וייבוש, וניתוח נתונים ספקטרומטריית מסה. הנהלים מתוארים ותיאר בפירוט רב יותר בהמשך: הכנת אכשור קד 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי פלייט לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להשתמש בכפפות ניטריל ויד-לשטוף את הצלחת מדגם בעדינות עם חומר ניקוי ומים deionized מזוקקים (DDW). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הצלחת המדגם עם מתנול (MeOH) ו DDW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צלחת מדגם בכוס 600 מ&quot;ל ולמלא עם DDW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate צלחת מדגם DDW במשך 15 דקות באמבטיה קולית (200 ואט, 40 קילוהרץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר DDW מן הקנקן כשמילא את הכוס MeOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate הצלחת מדגם MeOH במשך 15 דקות באמבטיה קולי (200 וואט, 40 קילוהרץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפוצץ את טיפות ממס על צלחת עם גז חנקן לשמור על צלחת מדגם יבש לפני בתצהיר מדגם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ויסות טמפרטורת הייבוש הערה:. תא ייבוש הוא 35 x 20 x 45 ס&quot;מ 3 (ר x ע x ג) תא אקריליק איור 1 מציג את התמונה של מערכת ייבוש זה. החדר הוא מטוהר עם גז חנקן בטמפרטורת חדר באמצעות מד זרימת גז בקצב זרימה מתמיד כדי לשמור על מצב לחות יחסי נמוך פיקוח על ידי היגרומטר מכויל המותקן בתוך חדר הייבוש. זינוק בסיס נחושת בתא הייבוש מצויד circulator מים בטמפרטורה קבוע מתוכנת משמש כדי להתאים צלחות מדגם נירוסטה. בלוק הבסיס נחושת הוא מסוגל לווסת את טמפרטורת צלחת המדגם בין 5 ל -25 מעלות צלזיוס. הטמפרטורות של אוויר, לחסום בסיס נחושת, ואת צלחת המדגם מנוטרות על ידי צמדים מסוג K. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הדלת במהירות לשים את צלחת המדגם על הנחושתבלוק בסיס וסוגר את הדלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני את מד זרימת הגז לקבוע את קצב זרימת החנקן עד 10 רגל מעוקב סטנדרטיים לשעה (SCFH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על הלחות היחסית בתא הייבוש על ידי מד הלחות ו לכוונן את מד זרימת הגז על מנת להבטיח את הלחות היחסית היא תמיד מתחת ל -25%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטר את הטמפרטורה של צלחת מדגם ידי צמדים מסוג K ולהתאים את הטמפרטורה circulator מים ידני עד שהצלחת מדגם מגיע 5 מעלות צלזיוס במשך הניסוי או בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) במשך שליטה. הערה: כדי לייצב את צלחת המדגם בטמפרטורה מתוכננת, טמפרטורת circulator המים מוגדרת, בדרך כלל 0 עד 5 מעלות צלזיוס נמוך יותר לדוגמה שנועד. לדוגמא, כדי לשמור על 5 מעלות צלזיוס על צלחת המדגם, הגדרת הטמפרטורה של circulator המים היא בטווח של 0 עד 2 מעלות צלזיוס; כדי לשמור על צלחת המדגם ב 25 מעלות צלזיוס, הגדרת הטמפרטורה של circulator המים היא בטווח של C 23 עד 25 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא הטמפרטורות הנדרשות ואת הלחות היחסית הם הגיעו (טבלה 1) לפני בתצהיר מדגם. הערה: כל הפרמטרים כמו גם ערכי ההגדרה שלהם לתהליכי הייבוש עם טמפרטורות צלחת מדגם שונות מוצגים בלוח 1. הערה: בטמפרטורת צלחת נמוכה מדגם, עיבוי מים על צלחת המדגם עלול להתרחש אם את דלת החדר פתוחה במשך זמן רב. אם מי עיבוי מתרחש, לסגור את הדלת ואל להפקיד כל מדגם עליו עד עיבוי המים התייבש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרונות מטריקס אנליטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרונות מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 0.1 פתרון M Thap עם 50% אצטוניטריל (ACN): 50% בתמיסה מימית DDW. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת analytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 10 -4 פתרון M maltotriose עם DDW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 10 -5 שבר ברדיקינין M (1-7) פתרון אצטוניטריל 50%(ACN): 50% בתמיסה מימית DDW. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. הפקדה לדוגמא ייבוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Premix 0.25 μl של פתרון 0.1 M Thap ו 0.25 μl של 10 -4 M maltotriose או 10 -5 M שבר ברדיקינין (1-7) פתרונות בתוך שפופרת microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון וורטקס המעורב במשך 3 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה פתרון מעורב למשך 2 שניות (2,000 XG) לאסוף את הפתרון בתחתית הצינור צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הדלת של חדר הייבוש, בזהירות להפקיד 0.1 μl של הפתרון על צלחת המדגם עם פיפטה ולסגור את הדלת מייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה אגל המדגם להתייבש. . הערה: פעמי הייבוש נצפו בדרך כלל עם טמפרטורות צלחת מדגם שונות מפורטות בטבלת 1 עבור טמפרטורת צלחת מדגם של 5 מעלות צלזיוס, זמן הייבוש הממוצע הוא 800 עד 1,000 שניות; עבור טמפרטורת צלחת מדגם של 25 ° C, זמן הייבוש הממוצע הוא 100 עד 150 sEC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייבוש, פתח את הדלת של חדר הייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הטמפרטורה circulator מים בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס). הערה: דלג על שלב זה אם הצלחת מדגם נשמרת כל הזמן בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) במהלך תהליך הייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תשואות טמפרטורת צלחת המדגם לטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס), להסיר את צלחת המדגם מאולם הייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את מורפולוגיה הדגימה תחת סטראו 5X ולקחת תמונה בהיר שדה תמונת מצב. הערה: אם מורפולוגיה קריסטל לא צפויות כמו, יש צורך להכין מדגם חדש עם אותו ההליך. מורפולוגיה גביש אופייניות מוצגות הלוחות העליונים של איור 2. הערה: במקרים עם טמפרטורות צלחת מדגם נמוכות, כגון 5 מעלות צלזיוס, חשוב לחמם את צלחת המדגם לטמפרטורת חדר לפני שלקחת אותו מתוך חדר הייבוש. בעת הפקדת דגימות, אין להחזיק את solutio premixedn ב קצה פיפטה מעל 10 שניות. אין להשתמש פתרון premixed שוב לאחר הפקדת הדגימות. הפנלים העליונים של איור 2 מציגים תמונות בהיר שדה של דגימות מוכנות עם טמפרטורות צלחת מדגם שונות. </li></ol> 3. ניתוח נתונים ספקטרומטריית מסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליטת נתונים ספקטרומטריית מסה הערה: לאחר הכנה, המדגם ניתן לנתח באמצעות הדמיה ספקטרומטריית מסה. במחקר הנוכחי, ניסויי MS ההדמיה נערכים באמצעות TOF כפול קוטביות מסונכרנת בנוי מעבדה (DP-TOF) ספקטרומטר מסת הדמיה. 15 ספקטרומטרים המוני מסחרי MALDI-TOF עם יכולת הדמיה מתאים גם ניסויים כאלה. ספקטרומטר מסה מופעל החילוץ לינארית מצבי יון חיובי עם עיכובים החילוץ מותאם. האנרגיה הקינטית של יונים היא 20 קילו. גודל קרן הליזר הוא 35 מיקרומטר קוטר על פני השטח המדגמים, והספקטרום של כל נקודה הוא aveזעם של 5 יריות לייזר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צלחת מדגם לתוך ספקטרומטר מסה MALDI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמית ניתוח ספקטרומטריית מסה על המדגם המוכן בצעדים 2.1-2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר לשיא מסת מאפיין מהרשימה המוני מוצגת בחלון התוצאה ולחץ &quot;2D&quot; לתכנן תמונת יון דו ממדים. הערה: לקבלת maltotriose מעורבב עם Thap, פסגות מאפיין הם sodiated maltotriose, Thap protonated, ו sodiated Thap. עבור שבר ברדיקינין (1-7) מעורבב עם Thap, פסגות מאפיין כוללות protonated שבר ברדיקינין (1-7), protonated Thap, ו sodiated Thap. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצני התאמה בחלון הקופץ כדי לקבוע את הגבולות העליונים ותחתונים של עוצמת האות ולוחץ על &quot;שמור תמונה&quot;. הגדרה זו קובעת את הניגוד של תמונות יון. הערה: בכל סט יחיד של נתונים, האזורים הסדוקים כתמי null מראים בהירות נמוכה בוטלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים ולהשוות את היוןתמונה עם התמונה בהיר השדה שנלקחה בשלב 2.9. הערה: הדמיה ספקטרומטריית מסה ובניית תמונות של יונים מסוימים יכולה להיות מושגת באמצעות מכשירים מסחריים. בשל המגוון של רכישת נתונים וניתוח תוכנה, המשתמשים צריכים לפעול בהתאם להנחיות תוכנה המסופקות על ידי ספק המכשיר כדי לקבל תמונות באיכות גבוהות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתונים הערה: ההטרוגניות של דגימות מנותחת כמותית. בהפגנה זו, כל מדגם מחולק לאזורי קונצנטריים מרובים על ידי תוכנות שפותחו באופן עצמי לנתח את הפריסה המרחבית של היונים. ניתוח המידע יכול גם להתבצע באמצעות תוכנת ניתוח נתונים עצמאית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכתמים בטל האזורים הסדוקים בתמונת היון מוצגת בחלון התוצאה להסיר אזורים בלתי חשובים. הערה: נוהל זה מגדיר את השטח החיוני של תמונת יון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;למצוא קצה&quot; על מנת למצוא את שכבת קצוני של תמונת היון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ &quot;לנכות&quot; כדי לשמור את מידע שפע יון של שכבת קצוני במסד נתונים ולהסיר שכבה זו מתמונת היון בו זמנית. תיבת סימון מייצג שכבה קצוני זה תופיע ברשימת &quot;נתוני תפוקה&quot; של חלון התוצאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.2.2 ו 3.2.3 עד מרכז התמונה יון מוגדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ ובחר את כל תיבות הסימון ברשימה &quot;נתוני תפוקה&quot; ולחץ על &quot;יצוא&quot; כדי לייצא את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הנתונים המיוצאים באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני כדי לחשב את שפע יון הממוצע של כל השכבה כדי להשיג את המידע הפריסה המרחבית של יונים. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Desorption+Ionization+of+Proteins+with+Molecular+Masses+Exceeding+10000+Daltons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons.</a> Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).</li>
<li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Velocity+Distributions+of+Intact+High+Mass+Polypeptide+Molecule+Ions+Produced+by+Matrix+Assisted+Laser+Desorption%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Velocity Distributions of Intact High Mass Polypeptide Molecule Ions Produced by Matrix Assisted Laser Desorption.</a> Chem. Phys. Lett. 181, 479-484 (1991).</li>
<li>Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic+Acid+as+a+Matrix+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Mass-Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry.</a> Org. Mass Spectrom. 27, 156-158 (1992).</li>
<li>Ehring, H., Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Photoionization+and+Photochemistry+in+Ionization+Processes+of+Organic-Molecules+and+Relevance+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+Mass-Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry.</a> Org. Mass Spectrom. 27, 472-480 (1992).</li>
<li>Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C5-Dihydroxybenzoic+Acid+-+a+New+Matrix+for+Laser+Desorption+Ionization+Mass-Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom.+Ion+Process%22%5BJournal%5D)">2,5-Dihydroxybenzoic Acid - a New Matrix for Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry.</a> Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 111, 89-102 (1991).</li>
<li>Hu, H., Larson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaporation+of+a+Sessile+Droplet+on+a+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Evaporation of a Sessile Droplet on a Substrate.</a> J. Phys. Chem. B. 106, 1334-1344 (2002).</li>
<li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+Flow+as+the+Cause+of+Ring+Stains+from+Dried+Liquid+Drops%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary Flow as the Cause of Ring Stains from Dried Liquid Drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li>
<li>Hu, J. -B., Chen, Y. -C., Urban, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coffee-Ring+Effects+in+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Coffee-Ring Effects in Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chim. Acta. 766, 77-82 (2013).</li>
<li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Tissue+Analysis+Using+Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry%3A+Practical+Aspects+of+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct Tissue Analysis Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: Practical Aspects of Sample Preparation.</a> J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).</li>
<li>Hu, H., Larson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marangoni+Effect+Reverses+Coffee-Ring+Depositions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Marangoni Effect Reverses Coffee-Ring Depositions.</a> J. Phys. Chem. B. 110, 7090-7094 (2006).</li>
<li>Bhardwaj, R., Fang, X., Attinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+Formation+During+the+Evaporation+of+a+Colloidal+Nanoliter+Drop%3A+A+Numerical+and+Experimental+Study%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Pattern Formation During the Evaporation of a Colloidal Nanoliter Drop: A Numerical and Experimental Study.</a> New J. Phys. 11, 075020(2009).</li>
<li>Savino, R., Paterna, D., Favaloro, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buoyancy+and+Marangoni+Effects+in+an+Evaporating+Drop%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thermophys+Heat+Tr%22%5BJournal%5D)">Buoyancy and Marangoni Effects in an Evaporating Drop.</a> J Thermophys Heat Tr. 16, 562-574 (2002).</li>
<li>Probstein, R. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aProbstein%2C+RF+%22Surface+Tension.+in+Physicochemical+Hydrodynamics+%3A+An+Introduction%22">Surface Tension. in Physicochemical Hydrodynamics : An Introduction</a>. , John Wiley & Sons. Ch. 10 305-361 (1994).</li>
<li>Lai, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Spatial+Heterogeneity+of+MALDI+Samples+with+Marangoni+Flows+During+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27, 1314-1321 (2016).</li>
<li>Hsiao, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Molecular+Imaging+of+Photolabile+Surface+Samples+with+Synchronized+Dual-Polarity+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).</li>
<li>Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Resolution+and+Very+High-Sensitivity+in+MALDI+TOF+of+Matrix+Surfaces+Made+by+Fast+Evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation.</a> Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).</li>
<li>Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Segregation+as+the+Major+Cause+for+Sample+Inhomogeneity+in+MALDI+Dried+Droplet+Spots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).</li>
<li>Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Evaporating+Complex+Fluids+through+Electrowetting%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting.</a> Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

בהתבסס על תחזיות תיאורטיות קודמות, תזרים הידרודינמית מושרה טמפרטורה בתוך טיפות יכול להתגבר החוצה תזרים נימי מושרה על ידי אידוי ממס. היעילות של סחרור פנימי כזה של מולקולות מוגברות כאשר הטמפרטורה הדרגתית בתוך עליית רביב. על פי התוצאות ניבא, כאשר שמירה על טמפרטורת צלחת מדגם מתחת לגיל 5 מעלות צלזיוס תוך שמירה וסביבתה בטמפרטורת הסביבה, המהירות הממוצעת של תזרימי סחרור בתוך רביב הוא בערך 4 פעמים מהר יותר מזו של תזרימי נימי כלפי חוץ. אם טמפרטורת צלחת מדגם זהה הסביבה, המהירות הממוצעת של תז...

ספקטרומטריית מסה (MS) היא אחת הטכניקות האנליטיות החשובות ביותר לניתוח ההרכבים המולקולריים של דגימות מורכבות. מבין כל שיטות היינון המשמשות בטרשת נפוצה, ספיגה/יינון לייזר בעזרת מטריצה (MALDI) היא השיטה הרגישה והנפוצה ביותר ביישומים ביואנליטיים. 1 בהשוואה לטכניקות יינון אחרות, ל-MALDI יש את הרגישות הגבוהה ביותר וסובלנות גבוהה למזהמי מלח. תכונות אנליטיות כאלה הופכות את MALDI לבחירה הראשונה לניתוח פחמימות ויישומי פרוטאומיקה רבים. עם זאת, הכנת דגימה היא שלב מכריע להשגת נתונים באיכות גבוהה ב-MALDI-MS.
שיטת הכנת הדגימה הנפוצה ביותר עבור MALDI-MS היא שיטת הטיפות המיובשות, שבה טיפות דגימה מופקדות על משטח ומייבשות בתנאי הסביבה. שיטת ייבוש זו פשוטה ויעילה בדרך כלל. 2-5 עם זאת, בעיה נפוצה בשיטת הטיפות המיובשות היא שגבישי האנליט/מטריצה המתקבלים בדרך כלל מתפזרים באופן לא סדיר. במקרים רבים, הגבישים מצטברים בשולי אזורי הדגימה, וכתוצאה מכך נוצרת מה שנקרא היווצרות כתם טבעת. 6-8 מורפולוגיות הגביש ההטרוגניות משפיעות על ההתפלגות המרחבית של מולקולות האנליטים, מה שמביא לתנודות חמורות באות היונים על פני אזורי הדגימה. תנודות אות חמורות כאלה ושחזור נתונים גרוע ידועים כבעיית "הנקודה המתוקה" ב-MALDI-MS. 9 לפיכך, יש צורך גדול בהפחתת הטרוגניות מרחבית ביישומי טיפות מיובשות של MALDI-MS.
זרימות הידרודינמיות בטיפות הדגימה ממלאות תפקיד חשוב בקביעת ההתפלגות המרחבית של דגימות שהוכנו בשיטת הטיפות המיובשות. 10-12 נמצא כי אידוי הממס גורם לזרימות נימיות כלפי חוץ בתוך טיפות, האחראיות להיווצרות כתם הטבעת. 7,10 לעומת זאת, זרימות מחזור הנגרמות על ידי שיפועי מתח פנים משיקים עשויות לאזן את הזרימות הנימים כלפי חוץ. 13 אם מהירויות זרימת המחזור גבוהות מזו של הזרימות הנימים כלפי חוץ, ניתן לחלק מחדש את הדגימות ביעילות כדי להפחית את בעיית ההטרוגניות. 14
בעבודה זו, אנו מדגימים פרוטוקול מפורט להכנת דגימות עם תא ייבוש פשוט כדי לגרום לזרימות מחזור יעילות במהלך תהליכי ייבוש טיפות. תנאי ייבוש הטיפות נשלטים במדויק, כולל הטמפרטורות של לוחית הדגימה וסביבתה, והלחות היחסית בתוך החדר. אנליטי המודל כוללים מלטוטריוז ושרשרת ברדיקינין (1-7). המטריצה המשמשת להדגמה היא 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP). הדגימות נבדקות עם טרשת נפוצה של זמן טיסה (TOF), והנתונים מנותחים כמותית כדי להראות את הפחתת ההטרוגניות.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנט</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אבקת דטרגנט</td><td>אלקונוקס</td><td>242985</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Merck</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>Merck</td><td>100003</td><td></td></tr><tr><td>2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T64602&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>שבר ברדיקינין (1-7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1651</td><td></td></tr><tr><td>Maltotriose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47884</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה</td><td>מטלר טולדו</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q טיהור מים מערכת</td><td>Millipore</td><td>ZMQS6VFT1</td><td></td></tr><tr><td>כפפות ניטריל ללא אבקה</td><td>Microflex</td><td>SU-690</td><td></td></tr><tr><td>600 מ"ל</td><td>דוראן</td><td>2110648</td><td></td></tr><tr><td>מנקה אולטרסאונד</td><td>דלתא</td><td>DC300H</td><td></td></tr><tr><td>מד לחות</td><td>Wisewind</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>מד זרימת גז חנקן</td><td>Dwyer</td><td>RMA-6-SSV</td><td></td></tr><tr><td>K-type צמדים תרמיים</td><td>Digitron</td><td>311-1670</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Select BioProducts</td><td>Force Mini&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה</td><td></td><td>Rainin pipet-lite XLS</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>תא ייבוש הניתן לשליטה בטמפרטורה</td><td>מעבדה</td><td></td><td></td>זו</tr><tr><td>ספקטרומטר מסה הדמיה של זמן טיסה דו-קוטביות מסונכרנת (DP-TOF IMS)</td> <td>מעבדה</td><td></td><td></td>זו</tr><tr><td>MALDI-TOF דגימת נירוסטה מכוונת למעבדה</td><td></td><td></td> <td>זו</td></tr></tbody></table>

הכנת דוגמאות maldi אחידה עבור יישומים כמותי

Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications

פרוטוקול זה מדגים הכנת דגימה פשוטה להפחתת הטרוגניות מרחבית באותות יונים במהלך ספקטרומטריית מסה של ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI). ההטרוגניות של אותות יונים היא בעיה חמורה ב-MALDI, מה שמביא לשחזור נתונים גרוע והופך את MALDI לבלתי מתאים לניתוח כמותני. על ידי ויסות טמפרטורת לוחית הדגימה במהלך הכנת הדגימה, זרימות הידרודינמיות הנגרמות תרמית בתוך טיפות של תמיסת הדגימה מסוגלות להפחית את בעיית ההטרוגניות. תא הכנת דגימות בטמפרטורת החדר המצויד בבלוק בסיס נחושת מווסת טמפרטורה המכיל לוחות דגימה של MALDI מאפשר שליטה מדויקת על מצב ייבוש הדגימה. לאחר ייבוש טיפות הדגימה, הטמפרטורה של לוחות הדגימה מוחזרת לטמפרטורת החדר ומוסרת מהתא לניתוח ספקטרומטרי מסה לאחר מכן. אזורי הדגימות נבדקים באמצעות ספקטרומטריית מסה של הדמיית MALDI כדי לקבל את ההתפלגות המרחבית של כל הרכיבים בדגימה. בהשוואה לשיטת הטיפות המיובשות הקונבנציונלית המכינה דגימות בתנאי סביבה ללא בקרת טמפרטורה, הדגימות שהוכנו בשיטה המודגמת כאן מראות פיזור מרחבי ועוצמת אות טובים יותר באופן משמעותי. על פי תצפיות המשתמשות בדגימות פחמימות ופפטידים, הפחתת טמפרטורת המצע תוך שמירה על הסביבה בטמפרטורת הסביבה במהלך תהליך הייבוש יכולה להפחית ביעילות את ההטרוגניות של אותות היונים. שיטה זו ישימה בדרך כלל לשילובים שונים של דגימות ומטריצות.

<html> התמונות בהיר השדה כמו גם תמונות MS של שבר maltotriose ו ברדיקינין (1-7) מוכן עם טמפרטורת צלחת מדגם של 5 ו -25 ° C מוצגות באיור 1. במקרה של maltotriose sodiated, אות היון בעיקר מאכלס בשולי שטח המדגם כאשר הוא מוכן עם טמפרטורת צלחת מדגם של 25 מעלות צלזיוס. ובאמצעות קטנה הצליחה טמפרטורה המדגמת עד 5 מעלות צלזיוס, האות מאכלס בצורה הומוגנית על פני שטח המדגם. החסרון הבולט היחיד בעת הכנת דגימות תחת 5 מעלות צלזיוס הם שיש יותר סדקים מאש...

פרוטוקול להפחתת heterogeneities המרחבי של אותות יון ספקטרומטריית MALDI ההמונית על ידי ויסות טמפרטורת מצע במהלך תהליכי ייבוש מדגם מודגם.

הכנת דוגמאות MALDI אחידה עבור יישומים כמותי

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization ...

המטרה הכללית של שיטה זו להכנת דגימות עבור MALDI MS היא להפחית את ההטרוגניות המרחבית של אותי היונים במהלך ה-MALDI MS. סביבת ייבוש מבוקרת היטב הוקמה כדי למטב את שיטת טיפות הייבוש (dried-droplet) הקונבנציונלית, באמצעות מניפולציה של הזרימות ההידרודינמיות בתוך טיפת הדגימה במהלך תהליך הייבוש. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להפחית ביעילות את ההטרוגניות המרחבית של אותי היונים עבור דגימות שהוכנו בשיטת טיפות הייבוש הממוטבת. שיטה זו יכולה לספק דגימות הומוגניות עבור מערכת המדדים של THAP.ניתן ליישם זאת גם על מערכות מדדיות אחרות, כגון alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid. באופן כללי, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו התקשו בתהליך, מכיוון ששליטה בתנאי הייבוש אינה פשוטה. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, פתח את דלת תא הייבוש והנח באופן מיידי פלטת דגימות שנוקתה מראש על גבי הבלוק המבוסס נחושת.לאחר מכן, סגרו את הדלת. כוון ידנית את מד זרימת הגז כדי לקבוע את קצב זרימת החנקן ל-10 standard cubic feet per hour. לאחר מכן, בצעו כיוון עדין של מד זרימת הגז כדי להבטיח שהלחות היחסית בתא הייבוש תהיה תמיד מתחת ל-25%, כפי שנמדד על ידי היגרומטר.השתמשו בתרמוקופלים מסוג K כדי לנטר את הטמפרטורה, וכווןו ידנית את טמפרטורת sרסיקולטור המים עד שפלטת הדגימות תגיע ל-5 °C עבור הניסוי. ודאו כי הטמפרטורות הנדרשות והלחות היחסית הושגו לפני השקעת הדגימה. ערבבו 0.25 µL של תמיסת THAP בריכוז 0.1 M ו-0.25 µL של האנליט הרצוי בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה.ערבבו את הדגימה במערבל Vortex למשך שלוש שניות. לאחר מכן, סובבו את הדגימה בצנטריפוגה למשך שניות שתיים כדי לרכז את התמיסה בתחתית מבחורת המיקרו-צנטריפוגה. לאחר הצנטריפוגה, פתחו את דלת תא הייבוש והניחו בזהירות 0.1 µL מהתמיסה על לוחית הדגימה באמצעות פיפטה.סגרו את הדלת באופן מיידי והמתינו להתייבשות טיפת הדגימה. כאשר טמפרטורת פלטת הדגימה נשמרת נמוכה מזו של סביבתה, מהירות הממוצעת של זרימות רסיקולציה בתוך הטיפה עולה משמעותית כדי להפיץ מחדש את המולקולות. השקיעת הדגימה היא השלב הקריטי ביותר הקובע את איכות הנתונים ואת השחזוריות שלהם.יש להניח את תמיסת הדגימה המעורבבת מראש באופן מיידי על לוחית הדגימה כדי להבטיח שהדגימה תתגבש תחת תנאים מבוקרים. לאחר הייבוש, פתח את דלת תא הייבוש.לאחר מכן, הגדירו את טמפרטורת סירקולטור המים ל-25 °C. ברגע שטמפרטורת פלטת הדגימות תחזור ל-25 °C, הוציאו את פלטת הדגימות מתא הייבוש. בחנו את מורפולוגיית הדגימות תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה של פי 5, וצלמו תמונת שדה בהיר (brightfield).בשלב זה, הכניסו את פלטת הדגימה למספקטרומטר מסות MALDI. לאחר מכן, בצעו ניתוח ספקטרומטריית מסות לדימוי (imaging mass spectrometry). בחרו שיא מסה (mass peak) מאפייני מרשימת המסות המוצגת בחלון התוצאות, ולחצו על 2D כדי להפיק תמונת יונים דו-ממדית.בשלב הבא, לחצו על כפתורי הכיוון בחלון הפופ-אפ כדי לקבוע את הגבולות העליונים והתחתונים של עוצמת האות, להגביר את רזולוציית התמונה, ולחצו על שמירת תמונה. צפו והשוות את תמונת היונים עם תמונת השדה המואר (brightfield) שנרכשה קודם לכן כדי לאתר את אזור הדגימה החיוני. כעת, לחצו על נקודות ריקות ועל אזורים סדוקים בתמונת היונים המוצגת בחלון התוצאות כדי לבצע כיוון עדין של האזור המיועד לניתוח.לחצו על כפתור find edge כדי למצוא את השכבה החיצונית ביותר של תמונת היונים. לאחר מכן, לחצו על deduct כדי לשמור את מידע שפעות היונים של השכבה החיצונית ביותר במסד נתונים, ולהסיר שכבה זו מתמונת היונים בו-זמנית. לאחר חזרה על השלבים הקודמים עד להגדרת מרכז תמונת היונים, לחצו ובחרו בכל תיבות הסימון ברשימת נתוני הפלט ולחצו על export כדי לייצא את הנתונים.לבסוף, פתחו את הנתונים המיוצאים באמצעות תוכנה לגיליונות אלקטרוניים כדי לחשב את שכיות היונים הממוצעת של כל שכבה, כדי לקבל את המידע על ההתפלגות המרחבית של היונים. בתמונות השדה המואר (brightfield) ו-MALDI של maltotriose, אות היונים של הצורה הנתרנתית מרוכז בעיקר בפריפריה של אזור הדגימה, כאשר הדגימה הוכנה בטמפרטורת פלטת דגימה של 25 °C. על ידי הפחתת הטמפרטורה ל-5 °C, האות מתפלג באופן הומוגני על פני כל אזור הדגימה, מה שמעיד על כך שהכנת דגימות בטמפרטורת פלטת דגימה נמוכה יותר יכולה לשנות באופן משמעותי את התפלגות המולקולות ולהפחית את ההטרוגניות.תמונת יוני הפagment של ברדיקינין פרוטוני מראה מגמה דומה למאלטוטריוז נתרנתי. ניתוחים סטטיסטיים מראים כי ההטרוגניות של אותות היונים שהתקבלו בטמפרטורת פלטת דגימה של 5 degrees Celsius פוחתת ב-60 עד 80 אחוזים, ביחס לזו שנמדדה ב-25 degrees Celsius. במקרה של מאלטוטריוז נתרנתי, בטמפרטורת פלטת דגימה של 25 degrees Celsius, עוצמות האות במרכזים נמוכות בהרבה מאלו שנמדדו בטמפרטורה של 5 degrees Celsius.מקטע הברדיקינין הפרוטוני מראה שונות פחותה כאשר מורידים את טמפרטורת פלטת הדגימה מ-25 ל-5 מעלות צלזיוס. בעת ניסיון יישום שיטת ייבוש זו, יש להקפיד על בקרה וניטור מדויקים של הטמפרטורות והלחות היחסית בתא הייבוש. לאחר רכישת מיומנות בשיטה, ניתן להכין דגימה בטכניקה זו בתוך 30 דקות, במידה והיא מבוצעת כראוי.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום ה-MALDI MS לבחון אנליזה כמותית של דגימות טיפה מיובשת. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן הכנת דגימות טיפה מיובשת הומוגניות לצורך אנליזת MALDI MS.

preparation-of-homogeneous-maldi-samples-for-quantitative-applications

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

וידאו זה מדגים את הכנת שכבת מטריצה ​​/ אנליטי דקים לניתוח פפטידים וחלבונים על ידי מטריקס בסיוע לייזר desorption Ionization המוניים ספקטרומטריית (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

פיתחנו טכנולוגיה המבוססת על הסרט סיליקה mesoporous דק להתאוששות סלקטיבית של חלבונים נמוך משקל מולקולרי ופפטידים מ בסרום אדם. פיסיקלי כימי את המאפיינים של שבבי mesoporous שלנו היו מכוון היטב כדי לספק שליטה משמעותית להעשרת פפטיד ולכן פרופיל proteome סרום למטרות אבחון.

חלבון נמוך מולקולרית משקל העשרה על סרטים סיליקה mesoporous דק גילוי סמן ביולוגי

מדידת מסה מדויקת מייצגת צעד חשוב במהלך החקירה של חלבונים. desorption / יינון בסיוע מטריקס לייזר (MALDI) ספקטרומטריית מסה (MS) יכולה לשמש לקביעה כאמור והיתרון המרכזי שלו הוא הסובלנות למלחים, חומרי ניקוי וחומרים מזהמים. כאן אנו מדגימים גישה נגישה לניתוח חלבונים גדולים יותר מאשר על ידי MALDI-MS 100 kDa.

מטריקס בסיוע לייזר Desorption / יינון זמן של טיסה (MALDI-TOF) Mass ניתוח Spectrometric של חלבונים שלמים גדול מ100 kDa

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בספקטרומטריית מסה של תאים שלמים MALDI-TOF על תאים אוקריוטיים. כאן, אנו מדגימים את הדיוק של הטכניקה הזו על ידי ניתוח מצבי ההפעלה המרובים של מקרופאגים בתגובה למיקרו-סביבה שלהם.

ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF של תא שלם היא שיטה מדויקת ומהירה לניתוח מצבים שונים של הפעלת מקרופאגים

ההדמיה ספקטרומטריה (MSI) היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בם כדי לגלות ולזהות תרכובות כימיות שונות ברקמות שלמות, שמירה על התרכובות בסביבות האם שלהם, אשר יכול לספק תובנות חדשות על תהליכים ביולוגיים. להלן שיטת MSI פיתחה לניתוח של מולקולות קטנות, הוא תאר.

ההדמיה MALDI-Mass Spectrometric לחקירת במטבוליטים<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; רוט גושים

Size exclusion chromatography עם פלזמה מצומדת אינדוקטיבית - ספקטרומטריית מסה (ICP-MS) היא כלי רב עוצמה למדידת שינויים בשפע של מטאלופרוטאינים ישירות מדגימות ביולוגיות. כאן אנו מתארים קבוצה של תקני מטאלופרוטאין המשמשים להערכת המסה המולקולרית וכמות המתכת הקשורה לחלבונים לא ידועים.

התקנים עבור כמותי Metalloproteomic ניתוח באמצעות גודל הרחקת ICP-MS

פרוטוקול עבור כימות חלבון בנוזלים ביולוגיים מורכבים באמצעות טכנולוגיית חיסונית אוטומטית-MALDI (iMALDI) מוצג.

פפטיד, חלבון כימות באמצעות כלים אוטומטיים חיסונית-MALDI (iMALDI)

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשחזור אמין עבור הכנת פורמלין קבוע רקמות המיועדים ספקטרומטר מסה דימות מבוסס-סובלימציה.

הכנה אופטימלית של פורמלין קבוע דוגמאות עבור פפטיד מבוסס מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה זרימות עבודה

פרוטוקול לשיפור אותות יון פחמימות ספקטרומטריית MALDI על ידי מבנים גבישיים רפורמה במהלך תהליכי הכנה מדגם הוא הפגין.

שיטת הכנה מדגם יעיל לשיפור אותות יון פחמימות לייזר בסיוע מטריקס Desorption/יינון ספקטרומטריית

מטרת פרוטוקול זה היא לספק הדרכה מפורטת על הכנת המדגם בעת תכנון ניסויים באמצעות MALDI MSI כדי למקסם זיהוי מטבולי ומולקולרי בדגימות ביולוגיות.

הכנה לדוגמה ליצירת פרופיל מטבולי באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה MALDI

למדו שיטת הכנה מתקדמת לדוגמאות MALDI אחידות באמצעות שליטה בטמפרטורת הרצפה ובזרימות הידרודינמיות. הטכניקה מפחיתה הטרוגניות מרחבית באותות יונים ומשפרת את אמינות תוצאות הספקטרומטריה.

הכנת דוגמאות MALDI אחידה עבור יישומים כמותי

גלה סרטונים נוספים