הכנת דוגמאות MALDI אחידה עבור יישומים כמותי

המטרה הכללית של שיטה זו להכנת דגימות עבור MALDI MS היא להפחית את ההטרוגניות המרחבית של אותי היונים במהלך ה-MALDI MS. סביבת ייבוש מבוקרת היטב הוקמה כדי למטב את שיטת טיפות הייבוש (dried-droplet) הקונבנציונלית, באמצעות מניפולציה של הזרימות ההידרודינמיות בתוך טיפת הדגימה במהלך תהליך הייבוש. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להפחית ביעילות את ההטרוגניות המרחבית של אותי היונים עבור דגימות שהוכנו בשיטת טיפות הייבוש הממוטבת. שיטה זו יכולה לספק דגימות הומוגניות עבור מערכת המדדים של THAP.

ניתן ליישם זאת גם על מערכות מדדיות אחרות, כגון alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid. באופן כללי, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו התקשו בתהליך, מכיוון ששליטה בתנאי הייבוש אינה פשוטה. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, פתח את דלת תא הייבוש והנח באופן מיידי פלטת דגימות שנוקתה מראש על גבי הבלוק המבוסס נחושת.

לאחר מכן, סגרו את הדלת. כוון ידנית את מד זרימת הגז כדי לקבוע את קצב זרימת החנקן ל-10 standard cubic feet per hour. לאחר מכן, בצעו כיוון עדין של מד זרימת הגז כדי להבטיח שהלחות היחסית בתא הייבוש תהיה תמיד מתחת ל-25%, כפי שנמדד על ידי היגרומטר.

השתמשו בתרמוקופלים מסוג K כדי לנטר את הטמפרטורה, וכווןו ידנית את טמפרטורת sרסיקולטור המים עד שפלטת הדגימות תגיע ל-5 °C עבור הניסוי. ודאו כי הטמפרטורות הנדרשות והלחות היחסית הושגו לפני השקעת הדגימה. ערבבו 0.25 µL של תמיסת THAP בריכוז 0.1 M ו-0.25 µL של האנליט הרצוי בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה.

ערבבו את הדגימה במערבל Vortex למשך שלוש שניות. לאחר מכן, סובבו את הדגימה בצנטריפוגה למשך שניות שתיים כדי לרכז את התמיסה בתחתית מבחורת המיקרו-צנטריפוגה. לאחר הצנטריפוגה, פתחו את דלת תא הייבוש והניחו בזהירות 0.1 µL מהתמיסה על לוחית הדגימה באמצעות פיפטה.

סגרו את הדלת באופן מיידי והמתינו להתייבשות טיפת הדגימה. כאשר טמפרטורת פלטת הדגימה נשמרת נמוכה מזו של סביבתה, מהירות הממוצעת של זרימות רסיקולציה בתוך הטיפה עולה משמעותית כדי להפיץ מחדש את המולקולות. השקיעת הדגימה היא השלב הקריטי ביותר הקובע את איכות הנתונים ואת השחזוריות שלהם.

יש להניח את תמיסת הדגימה המעורבבת מראש באופן מיידי על לוחית הדגימה כדי להבטיח שהדגימה תתגבש תחת תנאים מבוקרים. לאחר הייבוש, פתח את דלת תא הייבוש.

לאחר מכן, הגדירו את טמפרטורת סירקולטור המים ל-25 °C. ברגע שטמפרטורת פלטת הדגימות תחזור ל-25 °C, הוציאו את פלטת הדגימות מתא הייבוש. בחנו את מורפולוגיית הדגימות תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה של פי 5, וצלמו תמונת שדה בהיר (brightfield).

בשלב זה, הכניסו את פלטת הדגימה למספקטרומטר מסות MALDI. לאחר מכן, בצעו ניתוח ספקטרומטריית מסות לדימוי (imaging mass spectrometry). בחרו שיא מסה (mass peak) מאפייני מרשימת המסות המוצגת בחלון התוצאות, ולחצו על 2D כדי להפיק תמונת יונים דו-ממדית.

בשלב הבא, לחצו על כפתורי הכיוון בחלון הפופ-אפ כדי לקבוע את הגבולות העליונים והתחתונים של עוצמת האות, להגביר את רזולוציית התמונה, ולחצו על שמירת תמונה. צפו והשוות את תמונת היונים עם תמונת השדה המואר (brightfield) שנרכשה קודם לכן כדי לאתר את אזור הדגימה החיוני. כעת, לחצו על נקודות ריקות ועל אזורים סדוקים בתמונת היונים המוצגת בחלון התוצאות כדי לבצע כיוון עדין של האזור המיועד לניתוח.

לחצו על כפתור find edge כדי למצוא את השכבה החיצונית ביותר של תמונת היונים. לאחר מכן, לחצו על deduct כדי לשמור את מידע שפעות היונים של השכבה החיצונית ביותר במסד נתונים, ולהסיר שכבה זו מתמונת היונים בו-זמנית. לאחר חזרה על השלבים הקודמים עד להגדרת מרכז תמונת היונים, לחצו ובחרו בכל תיבות הסימון ברשימת נתוני הפלט ולחצו על export כדי לייצא את הנתונים.

לבסוף, פתחו את הנתונים המיוצאים באמצעות תוכנה לגיליונות אלקטרוניים כדי לחשב את שכיות היונים הממוצעת של כל שכבה, כדי לקבל את המידע על ההתפלגות המרחבית של היונים. בתמונות השדה המואר (brightfield) ו-MALDI של maltotriose, אות היונים של הצורה הנתרנתית מרוכז בעיקר בפריפריה של אזור הדגימה, כאשר הדגימה הוכנה בטמפרטורת פלטת דגימה של 25 °C. על ידי הפחתת הטמפרטורה ל-5 °C, האות מתפלג באופן הומוגני על פני כל אזור הדגימה, מה שמעיד על כך שהכנת דגימות בטמפרטורת פלטת דגימה נמוכה יותר יכולה לשנות באופן משמעותי את התפלגות המולקולות ולהפחית את ההטרוגניות.

תמונת יוני הפagment של ברדיקינין פרוטוני מראה מגמה דומה למאלטוטריוז נתרנתי. ניתוחים סטטיסטיים מראים כי ההטרוגניות של אותות היונים שהתקבלו בטמפרטורת פלטת דגימה של 5 degrees Celsius פוחתת ב-60 עד 80 אחוזים, ביחס לזו שנמדדה ב-25 degrees Celsius. במקרה של מאלטוטריוז נתרנתי, בטמפרטורת פלטת דגימה של 25 degrees Celsius, עוצמות האות במרכזים נמוכות בהרבה מאלו שנמדדו בטמפרטורה של 5 degrees Celsius.

מקטע הברדיקינין הפרוטוני מראה שונות פחותה כאשר מורידים את טמפרטורת פלטת הדגימה מ-25 ל-5 מעלות צלזיוס. בעת ניסיון יישום שיטת ייבוש זו, יש להקפיד על בקרה וניטור מדויקים של הטמפרטורות והלחות היחסית בתא הייבוש. לאחר רכישת מיומנות בשיטה, ניתן להכין דגימה בטכניקה זו בתוך 30 דקות, במידה והיא מבוצעת כראוי.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום ה-MALDI MS לבחון אנליזה כמותית של דגימות טיפה מיובשת. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן הכנת דגימות טיפה מיובשת הומוגניות לצורך אנליזת MALDI MS.