קונספט טרואר לפרש דרך הענבים הברים Metabolomics ו transcriptomics

המטרה הכללית של הליאות ניסיוניות אלו היא לבחון את חתימות הטרור (terroir) השונות במטבולום ובטרנסקריפטום של גרגירי הענבים מזן Corvina. מקרה הבוחן המתואר כאן כלל איסוף וניתוח של דגימות בשלוש שלבי הבשלה משבעה כרמים בשלושה מקרו-אזורים לאורך שלוש עונות גידול. הטכניקות המתוארות חושפות את השפעת הבשלה השלטית בבציר על המטבולום של הגרגרים.

בגרגירים בשלים זוהו גם חתימות כימיות ספציפיות וברורות המייצגות את שלושת המאקרו-אזורים. חתימת הטרואר ברמת המאקרו-אזור נחשפה באמצעות טכניקות סטטיסטיות מתאימות כגון PCA, שהיא ניתוח רכיבים ראשיים, ו-auto BLSDA, שהיא ניתוח תפקודי של הקרנה אורתוגונלית דו-כיוונית למבנים מובילים, לצורך ניתוח מטריצות הנתונים של התסריפטומיקה והמטבאלומיקה. מנגד, ההבדלים בין כרמים בודדים הם עדינים יותר, ודורשים גישות סטטיסטיות מורכבות ורגישות יותר.

התחילו את הניסוי בפיתוח תוכנית דגימה מתאימה. ודאו כי תוכנית הדגימה מגדירה את מקומות הדגימה, הזמנים ואת הליך הדגימה המדויק. לאחר קציר של 30 אשכולות ממיקומים שונים לאורך שתי שורות גפנים, בחרו שלושה גרגירי ענב באופן אקראי מכל אשכול, תוך הימנעות מאלו עם נזק נראה לעין ו/או סימני זיהום.

חזור על תהליך זה כדי להשיג שלושה מאגרי דגימות (pools) בלתי תלויים לכל שלב הבשלה. הסר את הגרעינים מהגרגירים, והקפא את הפריקרפ (pericarp) באופן מיידי בחנקן נוזלי. כרס את כל הגרגירים הקפואים מכל מאגר באמצעות מטחנה אוטומטית.

חלקו כל דגימה מאבקה לשני חלקים שווים, אחד עבור אנליזה טרנסקריפטומית והשני עבור אנליזה מטבולומית. לאחר מכן, סגרו והסירו את המעכה, ואחסנו את האבקות בטמפרטורה של minus 80 degrees celsius. הכינו את התמציות המטבוליות של דגימות הגרית בטמפרטורת החדר בשלושה נפחים של methanol, מוחמץ עם 0.1% formic acid, באמבט אולטרסוני בתדר של 40 kilohertz למשך 15 דקות.

סבבו את התמציות בצנטריפוגה ב-16,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C. דללו את הנוזל העליון בשני נפחים של מים דה-יוניים, והעבירו דרך מסנן של 0.2 מיקרון. הגדירו את מערכת הכרומטוגרפיה נוזלית בעוצמה גבוהה (HPLC), המחוברת לספקטרומטריית מסות, באמצעות מקור יינון בריסוס אלקטרוסטטי (ESI) או מערכת HPLC-ESI-MS, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

בצע את הפרדת ה-HPLC באמצעות גרדיאנט לינארי של ממסים A ו-B בקצב זרימה קבוע של 0.2 milliliters per minute, עם נפח הזרקת דגימה של 30 microliters. רכוש ספקטרא של מסות במצבי יינון שלילי וחיובי לסירוגין, לפי הפרמטרים המפורטים בפרוטוקול הטקסט. לעיבוד נתוני ה-LCMS, בצע את הליכי זיהוי והצמדת הפסגות (peak detection alignment), מילוי פערים (gap-filling) וסינון פסגות באמצעות תוכנה מתאימה, כגון התוכנה בקוד פתוח M Zeta Mine, גרסה 2.14.

ייבא את קבצי הטקסט שהתקבלו לגיליון אלקטרוני. פעולה זו יוצרת מטריצת נתונים שבה כל המטבוליטים שזוהו, המזוהים על ידי מספר זיהוי, ערך יחס מסה-למטען וזמן שימור, מכומתים בכל הדגימות במונחים של ערכי שטח הפסגה שלהם. הכן את מערך ההיברידיזציה בהתאם למפרטי פורמט של ארבעה מארזים, על ידי הוספת 1.65 micrograms של RNA משלים המסומן בציאנין, בנפח סופי של 41.8 microliters של מים דה-יוניים נקיים מ-RNAse.

הוסיפו 11 µL של חומר חסימה (blocking agent) בריכוז 10X, ו-2.2 µL של בופר פרגמנטציה (fragmentation buffer) בריכוז 25X. דגרו בבן-מריא בטמפרטורה של 60 °C למשך 30 דקות, כדי לפרגמנט את ה-RNA. לאחר 30 דקות, קררו מיד על קרח למשך דקה אחת.

לבסוף, הוסיפו 55 µL של תמיסת חיברוש (hybridization buffer) בריכוז 2X, וערבבו היטב באמצעות פיפטינג. לאחר סחרור למשך דקה אחת ב-15,500 ×g בטמפרטורת החדר, הניחו מיד את מבחורת המיקרו-צנטריפוגה על קרח. כדי להטעין את המיקרו-מערך (micro-array) המותאם אישית, הכניסו שקף עם אטם (gasket slide), כאשר התווית פונה כלפי מעלה, לבסיס של תא החיברוש.

העמיסו באיטיות 100 µL של דגימת היברידיזציה לכל באר של האטם, תוך הפצת הנוזל בעזרת קצה של פפית, תוך הימנעות מיצירת בועות. הניחו באיטיות את המיקרו-מערך המותאם אישית, כשהוא פונה כלפי מטה, וודאו שהברקוד המספרי פונה כלפי מעלה. וודאו שזוג ה"סנדוויץ'" מיושר כראוי.

לבסוף, הנח את מכסה תא ההיברידיזציה על השקופיות המודבקות, והדק ביד את התפס על התא. סובב את התא המורכב כדי להעריך את ניידותן של בועות האוויר. הנח את תא השקופיות המורכב ברוטסריה מאוזנת, בתוך תנור היברידיזציה המכוון ל-65 °C.

כוון את המערבל לסיבוב במהירות של 10 RPM. אפשר לתהליך ההיברידיזציה להימשך במשך 17 שעות. כדי להמשיך לשטיפת שקף המיקרו-מערך, הכן שלושה תבלילי צביעה לשקפים ומלא אותם בבתומי השטיפה המתאימים.

מלאו שתי צלחניות בבופר שטיפה 1 בטמפרטורת החדר, וצלחנית אחת בבופר שטיפה 2 שחומם מראש. פרקו את תא ההיברידיזציה והוציאו את ה"סנדוויץ'". כאשר הברקוד המספרי של שקופית המיקרו-מערך פונה כלפי מעלה, טבלו את הסנדוויץ' לתוך צלחנית צביעת השקופיות הראשונה המלאה בבופר שטיפה 1 בטמפרטורת החדר, ובעזרת פינצטה נקייה, הפרידו את האטם מהשקופית של המיקרו-מערך.

העבירו במהירות את שקופית המיקרו-מערך למגש שקופיות, והניחו אותה בכלי צביעת שקופיות השני המלא ב-wash buffer one בטמפרטורת החדר. הניחו את כלי צביעת השקופיות על בוחש מגנטי, ושטפו למשך דקה אחת תוך כדי ערבוב מתון. העבירו במהירות את מגש השקופיות לכלי צביעת השקופיות השלישי, המלא ב-wash buffer two שחומם מראש, ושטפו למשך דקה אחת תוך כדי ערבוב מתון.

הוצאו באיטיות את הרשת מכלי הצביעה של השקופיות, והוציאו בזהירות את השקופית מהרשת, תוך הימנעות מירידה של טיפות. הניחו את שקופית המיקרו-מערך (micro-array) בסורק מתאים, וסרקו כל מערך באמצעות הגדרות הפרמטרים המומלצות במדריך ההוראות של יצרן המיקרו-מערך. כדי להכין את התוכנה לניתוח סטטיסטי, ייבאו תחילה את נתוני המטבולומיקה והטרנסקריפטומיקה.

עברו אל File, New Regular Project, New Regular Project, כדי לייבא את מטריצת הנתונים שהתקבלה. לאחר מכן לחצו על Edit. בצעו טרנספוזיציה למטריצה כולה, home, והקצו את המזהים (ID) הראשוניים והמשניים המתאימים. לסיום, לחצו על finish.

כדי לבצע את הניתוח הסטטיסטי הרב-משתני, נווט לחלון ה-Workset, בחר PCAX כסוג המודל ולחץ על AutoFit. בחר Scores ואז Scatter, כדי לראות את התרשים המציג את הקיבוץ האפשרי של הדגימות. בחן את תרשים ה-PCA score.

אם התקבל מודל טוב, השתמש באותן מחלקות של דגימות כדי לבנות מודל ניתוח מבדיל O2PLS. כדי לבנות שני מודלים של ניתוח מבדיל O2PLS באמצעות הדגימות שסווגו על ידי MacroZone, הקצב את המחלקות על ידי מעבר לחלון Home, לאחר מכן New As, M1, ו-Observations. הגדר את המחלקות הרצויות.

לאחר מכן, שנו את סוג המודל מ-PCAX לניתוח מבחין מסוג O2PLS. לחצו על Autofit. המשיכו לבחור את M2 בחלון הפרויקט, לחצו על Scores ולאחר מכן על Scatter, כדי לראות את התרשים ואת מיקומם של מחלקות הדגימות.

עברו ל-Select Data Type, ובחרו ב-Observations and Loadings. לאחר מכן לחצו על Add Series, ובחרו בפריטים PQ correlation one, ו-PQ correlation two, או ברכיבים נוספים במידה והם קיימים. לחיצה ימנית בעזרת העכבר על הגרף, בחירה ב-Property, לאחר מכן בחירה ב-Color, ובסוף בחירה ב-By Terms, כדי להבחין בין סמלי הגרף של המולקולות והסוגים השונים.

עברו ל-Layout, затем Format Plot, ואחריו Access and or Styles, כדי לשנות את הגרף למאפיינים הרצויים. כדי לבחון אילו מטבוליטים מאפיינים מחלקה אחת או יותר, עברו ל-Plot List, ולאחר מכן ל-Scatter. ניתוח גילויים של כל מטריצת הנתונים באמצעות PCA הראה כי הדגימות התקבצו לפי שלב ההבשלה, כולל veraison, הבשלה בינונית ובשלות, לאורך הרכיבים הראשיים הראשון והשני.

הדגימות התקבצו בהתאם לעונת הגידול לאורך הרכיב הראשי השלישי. ניתוח מבחין מסוג O2PLS של גרגירי ענב בשלים מאפשר זיהוי של חתימות טרואר ספציפיות, המייצגות את שלושת המקרו-אזורים: Valpolicella, אגם Garda ו-Soave. תרשימי העמסה (loading plots) של מודלים אלה מבוטאים כמתאם PQ, שהוא המתאם בין P, קבוצת הדגימות, לבין Q, המטבוליטים.

בגרפי העמסה (loading plots), הריבועים האדומים מייצגים את קבוצת הדגימות או את המקרו-אזורים, והמשולשים הצבעוניים מייצגים את המטבוליטים הבודדים. המטבוליטים מקודדים בצבעים לפי הסיווג הכימי שלהם, והמרחק בין המטבוליטים לדגימות משקף את הקשרים ביניהם. המקרו-אזור של Lake Garda אופיין בסטילבנים (stilbenes), בעוד ש-Soave ו-Valpolicella התאפיינו בפלבונואידים.

מבין האנתוציאנינים, הפאונידין ונגזרותיו היו נפוצים יותר במקרו-אזור של Lake Garda, בעוד ששאר האנתוציאנינים היו נפוצים יותר במקרו-אזור של Valpolicella. יתרה מכך, אנתוציאנין three-O-glucosides היו נפוצים יותר במקרו-אזור של Valpolicella, בעוד שנגזרות מאצילציה וקומרולציה היו נפוצים יותר במקרו-אזור של Soave. שיטות של טרנסקריפטומיקה, RA ו-RNA sig, מאפשרות ניטור סימולטני של אלפי תמלילי שעתוק של גפני ענבים.

מערך זעיר (micro-array) מותאם אישית חדש תוכנן לאחרונה ומייצג מספר רב עוד יותר של גששים, המייצגים סוגים נוספים שגוליים לאחרונה של גפנים. בהינתן ההתיישנות המהירה של פלטפורמות טרנסקריפטומיות, תארנו הליך חלופי המשתמש בפלטפורמה חדשה המכילה גששים רבים יותר מהקודמת, כולל 249 תמלילי peno חזויים נוספים, עבור 1392 לוקוסי peno שזוהו מחדש, ו-179 גנים של corvina prava. ניתוח מטבוליקה באמצעות HPLC-ESI-MS רגיש מספיק כדי לזהות מספר רב של מטבוליטים בו-זמנית.

היכולת ליצור מישור דגימה היא קריטית. הבחירה ב clones בודד כדי למזער הבדלים גנטיים, ומשך הדגימה הממושך, אפשרו זיהוי של ההבדלים הממשיים בין הטרואים (terroirs). יהיה מעניין להשוות את אותו הזן הגדל באזורים פחות אופטימליים, אך למרבה הצער, כרמים אלו לא היו זמינים.