Name: פיתוח Immunoassay רוק נוגדן Multiplex כדי לאמוד את חשיפת אדם לפתוגנים הסביבה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: למד לפתח immunoassay רוק מבוסס חרוזים לזיהוי נוגדנים IGG נגד פתוגנים סביבתיים רבים בו-זמנית. שיטה זו מאפשרת מדידה מהירה וחסכונית של חשיפה אנושית למזון, מים ואוויר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

קלריסה קוריוזו נתמכה באמצעות מינוי לתוכנית ההשתתפות במחקר בסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב המנוהלת על ידי מכון אוק רידג' למדע וחינוך באמצעות הסכם בין-סוכנותי בין משרד האנרגיה האמריקאי ל-EPA האמריקאי.

התקבל אישור הדירקטוריון סקירה מוסדיים (IRB # 08-1844, אוניברסיטת צפון קרוליינה, צ&#39;אפל היל, צפון קרוליינה, ארה&quot;ב) לאיסוף דגימות רוק crevicular מגורה מ beachgoers בחוף Boqueron, פורטו ריקו, כחלק ארצות הברית הסוכנות להגנת הסביבה (USEPA) הלאומי אפידמיולוגיים הערכה סביבתית של פנאי (NEEAR) מים לימוד 23 להעריך הקשורים שחייה חשיפות ומחלות. משתתפי המחקר סיפקו הסכמה מדעת הונחו על השימוש בהתקן אוסף הרוק ידי קבלנים USEPA מאומן. דגימות הרוק נשלחו על קרח, עם קבלה, הם היו centrifuged ומאוחסנים ב -80 ° C כמתואר 4. 1. הפעלת חרוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניות סט חרוז גלולה ידי vortexing ו sonicating במשך 20 שניות ולהעביר כ 5.0 x 10 6 של חרוזים המניות (400 μl) צינורות microcentrifuge. הערה: Tהוא החרוזים מסופקים בריכוז של 12.5 x 10 6 חרוזים / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת חרוזי המניות על ידי צנטריפוגה ב XG 10,000 במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים pelleted ב 100 μl מים מזוקקים (DH 2 O) על ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות. חזור על שלב 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend חרוזים שטף ב -80 μl של 100 monobasic נתרן פוספט מ&quot;מ, pH 6.2 ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני השימוש, להכין 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל N -hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) הפתרון על ידי הוספת 200 μl DH 2 O ל aliquot 10 מ&quot;ג sulfo-NHS. מערבבים על ידי מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​sulfo-NHS על חרוזים. מערבבים על ידי מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני השימוש, להכין 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל 1-ethyl- [3dimethylaminopropyl] hydrochloride carbodiimide (EDC) הפתרון על ידי הוספת 200 μl מים מזוקקים (DH 2 O) אל aliquot 10 מ&quot;ג EDC. מערבבים על ידי מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של 50מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון EDC אל חרוזים. מערבבים על ידי מערבולת. דגירה חרוזים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך, עם ערבוב ידי מערבולת ב 10 מרווחי דקות. גלולת החרוזים מופעלים על ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים 250 μl של 50 מ&quot;מ 2 [N -Morpholino] חומצה ethanesulfonic (MES), pH 5.0 ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת החרוזים מופעלים על ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.9 ו 1.10. הערה: זה מספק סך של שני שוטף עם 50 מ&quot;מ MES, pH 5.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים 100 μl של 50 MES מ&quot;מ, pH 5.0 ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות. </li></ol> 2. חרוז זיווגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוג אנטיגנים על הסטים החרוזים באמצעות הריכוזים שניתן לראות בטבלת 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כל אנטיגן כדי חרוזים מופעל ולהביא את הנפח הכולל עד 500 μl ב 50 מ&quot;מ MES, pH 5.0. מערבבים את האנטיגניםחרוזי ד ידי מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אנטיגנים וחרוזים עבור שעה 2 עם ערבוב על ידי סיבוב (~ 15 סל&quot;ד) בטמפרטורת החדר בחושך. גלולת החרוזים מצמידים ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים 500 μl של בופר פוספט (PBS) אלבומין -bovine (BSA) monolaurate -polyoxyethylenesorbitan (Tween-20) -sodium אזיד (PBS-TBN) pH 7.4 ידי מערבולת sonication. גלולה חרוזים על ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות ולהסיר את supernatant. זהירות: אזיד הנתרן הוא כימיקל רעיל בחריפות. זה קטלני אם בלע או מקבל במגע עם העור. לא לנשום אבק / קטר / גז / ערפל / אדים או תרסיס. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE של) בעת טיפול ולהיפטר בהתאם לחוקים המתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים 1 מ&quot;ל של PBS-TBN ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה חרוזים על ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">חזור על שלבים 2.5 ו -2.6. הערה: זה מספק סך של שני שוטף עם PBS-TBN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend החרוזים מצמידים ורחץ ב 1 מ&quot;ל של PBS, 1% BSA, 0.05% אזיד, pH 7.4. אחסן את החרוזים מצמידים במקרר 2-8 מעלות צלזיוס בחושך. </li></ol> 3. ספירת חרוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1:10 דילול של החרוזים בשילוב במים או חיץ PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 10 μl של דילול חרוז גבי hemocytometer בנקודת מבוא המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזן חרוז ראה באחד הרשתות בפינה 4 x 4. חשב את המספר הכולל של חרוזים מצמידים באמצעות הנוסחה הבאה: הרוזן (1 בפינת 4 x 4 רשת) x (1 x 10 4) x (גורם לדילול) x resuspension נפח מ&quot;ל. </li></ol> 4. אישור של Antigen זיווגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את תערובת המניות של חרוזי מצמידי אנטיגנים של עניין על ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת חרוז עובד על ידי דילול מניות חרוז מצמידים את סופיריכוז של 100 חרוזים / μl של כל חרוז ייחודי להגדיר במאגר PBS-1% BSA (PBS-1% BSA, pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לפחות 7 שני דילולי סדרה של מינים אנטי נוגדני IgG עיקריים על פי המלצות היצרן בצלחת תחתונה 96-גם עגולה עם חיץ BSA% PBS-1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום להרטיב טור 8-גם נפרד (8 שורות) של צלחת 96-גם מסנן תחתונה עבור כל בדיקת אישור צימוד אנטיגן עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. הוסף 50 μl של עובד תערובת חרוז (חרוזי מצמידי אנטיגן) אל הבארות טרום הרטובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של דילולים נוגדנים שורות 1-7 של כל עמודה של צלחת מסנן 96-היטב 50 μl של חיץ PBS-1% BSA לחתור 8 במקום נוגדן מדולל לשמש בארות רקע. מערבבים עם פיפטור רב ערוצית על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. בצע אותו התהליך עבור כל סט חרוז מצמידי אנטיגן כדי להיות מאושר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפ &#39;החדרerature עבור שעה 1 על שייקר microplate ב 500 סל&quot;ד. הסר supernatant ידי ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור 1x. Resuspend את החרוזים 50 μl של BSA% PBS-1 עם פיפטור רב ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל biotinylated אנטי-מינים ספציפיים נוגדן זיהוי משני IgG ל -16 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​BSA% PBS-1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של נוגדנים משני מדולל היטב כל על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים בצלחת מסנן ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר צלחת. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים 50 μl של BSA% PBS-1 עם פיפטור רב ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל הכתב streptavidin-R-Phycoerythrin (SAPE) עד 24 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ב BSA% PBS-1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של כתב היטב כל ומערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cמעל צלחת מסנן ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר צלחת. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Resuspend ב 100 μl של BSA% PBS-1 ולנתח 50 μl באמצעות מנתח 29. הערה: תוצאות של immunoassay זמנית מבוסס החרוז נמדדות בעוצמת קרינת חציון (MFI). תמיד מתייחס לגרסה האחרונה של מדריך התוכנה, אם היא זמינה, כדי למנוע טעויות. </li></ol> 5. הרוק Multiplex Immunoassay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר רוק מהמקפיא -80 ° C ולאפשר להפשיר בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend אנטיגן מצמיד מניות חרוז ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת חרוז עובד על ידי דילול מניות חרוז מצמידים לריכוז סופי של 100 חרוזים / μl של כל קבוצה חרוז ייחודי חיץ BSA% PBS-1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול 1: 4 של הרוק wה- i-PBS 1% חיץ BSA בתוך 96 באר, צלחת באר עמוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מסנן טרום רטוב עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של תערובת חרוז עבודת נפח שווה של רוק מדולל ל 95 בארות של 96 הצלחות המסננות גם עבור דילול 1: סופי 8. מערבב תגובות עם פיפטור רב ערוצים. הפיקוח אחד היטב, מוסיפים 50 חרוזים μl מצמידים אנטיגן פלוס 50 μl של חיץ PBS-1% BSA (כתחליף הרוק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 על שייקר microplate ב 500 סל&quot;ד. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Resuspend ב 50 μl של BSA% PBS-1 עם פיפטור רב ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נוגדן זיהוי משני אנטי אנושי עז biotinylated IgG ל -16 מ&quot;ל מיקרוגרם / ב BSA% PBS-1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl מדולל נוגדנים משני זה טוב ומערבבים תוכן עםפיפטור רב ערוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים בצלחת מסנן ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר צלחת. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Resuspend ב 50 μl של BSA% PBS-1 עם פיפטור רב ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל הכתב streptavidin-R-Phycoerythrin (SAPE) עד 24 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ב BSA% PBS-1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl כתב היטב כל ומערבבים עם פיפטור רב ערוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים בצלחת מסנן ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר צלחת. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Resuspend ב 100 μl של BSA% PBS-1 ולנתח 50 μl באמצעות מנתח 29. הערה: תוצאות של immunoassay זמנית נמדדות Intensity חציון הקרינה (MFI) יחידות. תמיד מתייחסיםאת הגרסה האחרונה של מדריך התוכנה, אם היא זמינה, כדי למנוע טעויות. </li></ol>

<ol><li>Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPr%C3%BCss-%C3%9Cst%C3%BCn%2C+A+%22Safer+water%2C+better+health%3A+costs%2C+benefits+and+sustainability+of+interventions+to+protect+and+promote+health%22">Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health</a>. , World Health Organization. Geneva. (2008).</li>
<li>Augustine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+approaches+to+developing+a+multiplex+immunoassay+for+determining+human+exposure+to+environmental+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens.</a> J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).</li>
<li>Griffin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+salivary+antibody+immunoassays+for+the+detection+of+incident+infections+with+Norwalk+virus+in+a+group+of+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers.</a> J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).</li>
<li>Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+multiplex+microsphere+immunoassay+for+the+quantitation+of+salivary+antibody+responses+to+selected+waterborne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens.</a> J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).</li>
<li>Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+diagnostic+uses+of+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Current diagnostic uses of saliva.</a> J Dent Res. 66, 420-424 (1987).</li>
<li>Mandel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnostic+uses+of+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Pathol+Med%22%5BJournal%5D)">The diagnostic uses of saliva.</a> J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).</li>
<li>Malamud, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva+as+a+Diagnostic+Fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+Med+J%22%5BJournal%5D)">Saliva as a Diagnostic Fluid.</a> Brit Med J. 305, 207-208 (1992).</li>
<li>Ballam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting+is+useful+in+the+salivary+diagnosis+of+Helicobacter+pylori+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection.</a> J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).</li>
<li>Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+saliva+as+a+source+of+anti-malarial+antibodies+to+examine+population+exposure+to+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum.</a> Malar J. 10, 104(2011).</li>
<li>Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+invasive+amebiasis+by+enzyme-linked+immunosorbent+assay+of+saliva+to+detect+amebic+lectin+antigen+and+anti-lectin+immunoglobulin+G+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies.</a> J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).</li>
<li>Toyoguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+reactivity+to+Cryptosporidium+parvum+in+saliva+of+calves+after+experimental+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection.</a> J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).</li>
<li>Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+and+booster+salivary+antibody+responses+to+a+7-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+infants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants.</a> J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).</li>
<li>Tourinho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+cutoff+ratio+for+detecting+antibodies+against+hepatitis+A+virus+in+oral+fluids+by+enzyme+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay.</a> J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).</li>
<li>Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+saliva+as+an+alternative+to+plasma+for+the+detection+of+hepatitis+C+virus+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies.</a> Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).</li>
<li>Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+norwalk+virus+infection+by+indirect+enzyme+immunoassay+detection+of+salivary+antibodies+to+recombinant+norwalk+virus+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).</li>
<li>Yap, G., Sil, B., Ng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+saliva+for+early+dengue+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Use of saliva for early dengue diagnosis.</a> PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046(2011).</li>
<li>Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+saliva-based+test+for+detecting+antibodies+to+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).</li>
<li>Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+saliva+for+antibodies+to+the+LPS+of+Escherichia+coli+O157+in+patients+with+serum+antibodies+to+E.+coli+O157+LPS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS.</a> J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).</li>
<li>Ashbolt, N., Bruno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+and+refinement+of+the+WHO+risk+framework+for+recreational+waters+in+Sydney%2C+Australia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia.</a> J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).</li>
<li>Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QMRA+%28quantitative+microbial+risk+assessment%29+and+HACCP+%28hazard+analysis+and+critical+control+points%29+for+management+of+pathogens+in+wastewater+and+sewage+sludge+treatment+and+reuse%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse.</a> Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).</li>
<li>Ashbolt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+contamination+of+drinking+water+and+disease+outcomes+in+developing+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions.</a> Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).</li>
<li>Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+model+to+assess+microbial+health+risks+associated+with+beneficial+uses+of+biosolids%5BTitle%5D)+AND+%22Risk+Anal%22%5BJournal%5D)">A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids.</a> Risk Anal. 24, 221-236 (2004).</li>
<li>Wade, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWade%2C+TJ+%22Report+on+2009+National+Epidemiologic+and+Environmental+Assessment+of+Recreational+Water+Epidemiology+Studies%2C+US+EPA.+US+EPA+Report+Number%3A+EPA%2F600%2FR-10%2F168%3A+US+EPA2011%22">Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011</a>. , (2011).</li>
<li>Fujii, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+surveillance+development+for+tropical+infectious+diseases+using+simultaneous+microsphere-based+multiplex+assays+and+finite+mixture+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040(2014).</li>
<li>Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measles+serological+survey+in+the+Italian+population%3A+interpretation+of+results+using+mixture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model.</a> Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).</li>
<li>Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+serological+surveys+using+mixture+models%3A+the+seroepidemiology+of+measles%2C+mumps+and+rubella+in+England+and+Wales+at+the+beginning+of+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century.</a> Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).</li>
<li>Baughman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+diagnostic+cutoff+points+for+levels+of+serum+antibodies+to+pertussis+toxin%2C+filamentous+hemagglutinin%2C+and+fimbriae+in+adolescents+and+adults+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).</li>
<li>Clotilde, L., Bernard, C. IV, Hartman, G., Lau, D., Carter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbead-based+immunoassay+for+simultaneous+detection+of+Shiga+toxins+and+isolation+of+Escherichia+coli+O157+in+foods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods.</a> J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Luminex+User+Software+Manual+%28RUO%29+xPONENT+3.1+Rev.+2%22">Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2</a>. 3, 6-102 (2014).</li>
<li>Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+non-specific+binding+in+serological+Luminex+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays.</a> J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).</li>
</ol>

הסוכנות להגנת הסביבה בארצות הברית באמצעות אופיס של מחקר ופיתוח במימון וניהל את המחקר המתואר כאן. זה כבר נתון הביקורת המנהלית של הסוכנות ואושר לפרסום. אזכור של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים אינו מהווה אישור או המלצה לשימוש.

תוצאות אלו מצביעות כי השיטה immunoassay זמנית שימושי להפלות בין דגימות רוק כי הם immunopositive או immunonegative. כדי לקבוע immunopositivity, נקודה אחת חתוכים פותחה על ידי חישוב הממוצע פלוס שלוש סטיות תקן מן תגובות MFI טרנספורמציה יומן של החרוזים המלאים הזוגיים נבדקו עם כל דגימות הרוק. הנקודה החתוכה ספקה את היכולת להעריך את החשיפה ואת immunoprevalence או א פתוגנים בודדים או מרובים. כוח מפלה זה עשוי להיות שימושי מחקרי אוכלוסייה לחקור סיכונים בריאותיים הקשורים עם חשיפה לפתוגנים סבי...

שימונים ושמונה אחוזים של מחלה הקשורים שלשולים ברחבי העולם קשור לחשיפת אדם למים מזוהמים, מזון בטוח, והיגיינה / תברואה הירודה, גרימה כ -1.5 מיליון מקרי מוות, רובם הם ילדים 1. זהו גורם עיקרי לדאגה עבור אנשי בריאות ציבור וקובעי מדיניות. במאמץ לחקור חשיפות ומחלות הקשורות waterborne ופתוגנים סביבתיים אחרים, פיתחנו immunoassay זמנית למדוד נוגדנים בדגימות אדם 2-4. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים אפידמיולוגיים לקבוע חשיפה אנושית פתוגנים אלה עדיף להגדיר זיהומי immunoprevalence ואירוע. רוק טומן בחובו הבטחה ניכרה כחלופת סרום המחקר ביו-מרקר אדם. בין היתרונות של שימוש רוק הם-הפולשנות הלא וקלות אוסף מדגם, בעלות נמוכה, ודוגמאות ניתן לאסוף בקלות מילדים 5-7 &lt;/ Sup&gt;. סרום דגימות רוק נחקרו רבות עבור נוגדנים כנגד H. פילורי 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, דלקת ריאות סטרפטוקוקוס 12, וירוסים הפטיטיס A ו- C 13-14, noroviruses 2-4,15, ט גונדי 2-4, דנגה וירוס 16, וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) 17, ו Escherichia coli O157: H7 18. Immunoassay זמנית מאפשר ניתוח של analytes מרובים בו זמנית בתוך נפח דגימה אחת ותוך מחזור אחד או לרוץ. אנטיגנים Multiplexed מ ג jejuni, ט גונדי, H. pylori, הפטיטיס וירוס, ושני noroviruses שמש למדידת אדם רוק IgG 2-4 ו IgA 3,4 ופלזמת תגובות 2,3 נוגדן IgG לפתוגנים אלה באמצעותחרוז מבוסס ריבוב immunoassay. הפועל בשיתוף עם מחקרים אפידמיולוגיים של חשיפה לחיידקים במים, אדמה ומזון, הסוג של assay המתואר במחקר זה עשוי לספק מידע רב ערך על מנת לשפר את ההבנה של זיהומים הנגרמים על ידי פתוגנים סביבתיים. יתר על כן, נתוני נוגדן רוק שהתקבלו ממחקרים כאלה יכולים לשמש כדי לשפר את המודלים להערכת סיכוני 19-22.

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד ותוכנה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-צנטריפוגה</td><td>תרמו אלקטרונים תאגיד</td><td>75002446</td><td>משמש לדגימות צנטריפוגה</td></tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td>VWR</td><td>G560</td><td>משמש לערבוב דגימות</td></tr><tr><td>סוניקטור (מיני)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>15-337-22</td><td>משמש להפרדת חרוזים</td></tr><tr><td>פיפטורים P10, P20, P100, P1000, 8 ch. </td><td>Capp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שונים המציטומטר (קו בהיר)</td><td>Housser Scientific&nbsp;</td><td>3200</td><td>משמש לספירת חרוזים מצומדים</td></tr><tr><td>Multiscreen Vacuum Manifold</td><td>Millipore</td><td></td><td>MSVMHTS00 משמש בשלבי כביסה להסרת Supernatant</td></tr><tr><td>MicroShaker</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td>משמש לתסיסה של חרוזים במהלך הדגירה</td></tr><tr><td>מתלה צינור (1.5 מ"ל ו-0.5 מ"ל) (מגוון)</td> <td>VWR</td><td>30128-346</td><td></td></tr><tr><td>משקל שקילה</td><td>מטלר או אחר</td><td></td><td>משמש למדידת ריאגנטים לכביסה להכנת מאגרים</td></tr><tr><td>Dynabead Sample Mixer</td><td>Invitrogen</td><td>947-01</td><td>משמש במהלך שלב הדגירה של הצימוד</td></tr><tr><td>MatLab (R2014b)</td> <td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td>משמש לניתוח נתוני תגובת נוגדנים</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2014</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>משמש לניתוח נתוני תגובת נוגדנים</td></tr><tr><td>מנתח Luminex עם תוכנת xPonent 3.1</td><td>Luminex Corporation</td><td>LX200-XPON3.1</td><td>מכשיר ותוכנה המשמשים להפעלת מבחן</td></tr><tr><td><חזק>אנטיגנים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GI.1 וירוס נורווק: p-particle</td><td>Xi ג'יאנג (CCHMC)*</td><td>NA</td><td>*בית החולים לילדים בסינסינטי. קונקציה סופית 5 &micro;g.</td></tr><tr><td>GII.4 נורו-וירוס VA387: חלקיק p</td><td>שי ג'יאנג (CCHMC)*</td><td>NA</td><td>*בית החולים לילדים בסינסינטי. קונקציה סופית 5 &micro;g.</td></tr><tr><td>נגיף הפטיטיס A: תרכיז דרגה II מתרבית תאים</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>8505</td><td>אנטיגן בשילוב 100 ומיקרו; g</td></tr><tr><td>Helicobacter pylori: ליזאט</td><td>מרידיאן מדעי החיים</td><td>R14101</td><td>אנטיגן בשילוב 25 ומיקרו; g</td></tr><tr><td>Toxoplasma gondii: p30 רקומביננטי (SAG1)</td><td>מרידיאן מדעי החיים</td><td>R18426</td><td>אנטיגן בשילוב ב-25 ומיקרו; g</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni: הרג בחום תאים שלמים</td><td>KPL</td><td>50-92-93</td><td>אנטיגן בשילוב 50 ומיקרו; g</td></tr><tr><td>נוגדנים ראשוניים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים נגד נורו-וירוס</td> (<td>CCHMC)*</td><td>NA</td><td>משמש לאישור צימוד</td></tr><tr><td>עכבר נגד הפטיטיס A IgG</td><td>מרידיאן מדעי החיים</td><td>C65885M</td><td>משמש לאישור צימוד</td></tr><tr><td>עכבר נגד הפטיטיס A IgG</td><td>מרידיאן מדעי החיים</td><td>C65885M</td><td>משמש לאישור צימוד</td></tr><tr><td>BacTraceAffinity נוגדן מטוהר ל-Helicobacter pylori</td><td>KPL</td><td>01-93-94</td><td>משמש לאישור צימוד</td></tr><tr><td>עז pAb ל טוקסופלזמה gondii</td><td>Abcam</td><td>Ab23507</td><td>משמש לאישור צימוד</td></tr><tr><td>BacTrace עז אנטי-Campylobacter מין</td><td>KPL</td><td>01-92-93</td><td>משמש לאישור</td></tr> <tr><td>צימוד<חזק>משני&nbsp; נוגדנים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ביוטין-SP-מצומד AffiniPure Donkey נגד עזים IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>705-065-149</td><td>משמש לאישור צימוד</td></tr><tr><td>ארנב ביוטיניל נגד עזים IgG (H+L)</td><td>KPL</td><td>16-13-06</td><td>משמש לאישור צימוד</td></tr><tr><td>עז ביוטיניל נגד עכבר IgG (H+L)</td><td>KPL</td><td>16-18-06</td><td>משמש לאישור</td></tr> <tr><td>צימודנוגדן מטוהר זיקה ביוטין עם תווית עז נגד ארנב IgG (H+L)</td> <td>KPL</td><td>176-1506</td><td>משמש לאישור צימוד</td></tr> <tr><td><חזק>חומרים מתכלים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה קופולימר</td><td>ארה"ב מדעי</td><td>1415-2500</td><td>משמש כצינורות מיקרוצנטריפוגה מחייבים נמוכים</td></tr><tr><td>10 ומיקרו; l מילוי קצה פיפטה</td><td>BioVentures</td><td>5030050C</td><td></td></tr><tr><td>200 ומיקרו; l מילוי קצה פיפטה</td><td>BioVentures</td><td>5030080C</td><td></td></tr><tr><td>1,000 ומיקרו; l מילוי קצה פיפטה</td><td>BioVentures</td><td>5130140C</td><td></td></tr><tr><td>רדיד אלומיניום</td><td>ספקים</td><td></td> שונים <td>המשמשים לשמור חרוזים בחושך במהלך הדגירה</td></tr><tr><td>לוחות באר עמוקה</td><td>VWR</td><td>40002-009</td><td>משמש לדילול דגימות רוק</td></tr><tr><td>לוחות סינון מרובי מסך</td><td>Millipore</td><td>MABVN1250</td><td>משמש להפעלת בדיקות</td></tr> מערכת <tr><td>איסוף רוק של Oracol</td><td>Malvern Medical פיתוחים מוגבלים</td><td></td><td>משמש לאיסוף רוק</td></tr> <tr><td><ריאגנטים חזקים>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוספירות קרבוקסיל (חרוזים)</td><td>תאגיד לומינקס</td><td>תלוי בסט חרוזים</td><td>אנטיגנים מחוברים למיקרוספירות</td></tr><tr><td>EDC (1-אתיל-3-[3-דימתילאמינפרופיל] קרבודימיד הידרוכלוריד)</td><td>פירס</td><td>77149 או 22980</td><td>משמש בהפעלת</td></tr> <tr><td>חרוזיםSulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)Pierce</td><td></td> <td>24510</td><td>משמש בהפעלת חרוזים</td></tr><tr><td>Steptavidin-R-phycoerythrin (1 מ"ג/מ"ל)</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>S-866</td><td>משמש כמדווח</td></tr><tr><td>MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)</td><td>Sigma</td><td>M-2933</td><td>משמש לצימוד</td></tr><tr><td>Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate)</td><td>Sigma</td><td>P-9416</td><td>משמש במאגר כביסה להסרת חוצץ קשירה לא ספציפי</td></tr> <tr><td><חזק>חוצץ חלבון</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>PBS-TBN מאגר חסימה/אחסון (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% אזיד, pH 7.4)</חזק>**מסנן</td><td></td><td></td> <td>לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>P-3813</td><td>138 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-7888</td><td>0.1% (w/v)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P-9416</td><td>0.2% (v/v)</td></tr> <tr><td>נתרן אזיד (0.05% אזיד)**</td><td>סיגמא</td><td>S-8032</td><td>**<חזק>זהירות</חזק>: נתרן אזיד רעיל באופן חריף. יש להימנע ממגע עם העור והעיניים. ללבוש ציוד הגנה אישי מתאים. השלך בהתאם לחוקים החלים.</td></tr><tr><td><חזק>MES/מאגר צימוד (0.05 M MES, pH 5.0)</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES (2-[N-Morpholino] חומצה אתנסולפונית)</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td></td></tr><tr><td>5 N NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td><חזק>מאגר בדיקה (PBS, 1% BSA, pH 7.4)&nbsp; </חזק></td><td></td><td></td><td>מסנן יש לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>PBS, 1% BSA, pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>P-3688</td><td>138 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 1% BSA</td></tr><tr><td><חזק>מאגר הפעלה (0.1 מ' NaH</חזק><תת><חזק>2</חזק></תת><חזק>PO</חזק><תת><חזק>4</חזק></תת><חזק>, pH 6.2)</חזק></td><td></td><td></td><td>מסנן לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>NaH2PO4 (נתרן פוספט, חד מימי)</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td>0.1 M NaH2PO4</td></tr><tr><td>5 N NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td><חזק>מאגר שטיפה (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4)</חזק></td><td></td><td></td><td>מסנן לעקר ולאחסן ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>PBS, 0.05% טווין-20, pH 7.4</td><td>סיגמא</td><td>P-3563</td><td>138 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 0.05% טווין</td></tr></tbody></table>

פיתוח immunoassay רוק נוגדן multiplex כדי לאמוד את חשיפת אדם לפתוגנים הסביבה

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

האטיולוגיה ואת ההשפעות של חשיפה אנושית פתוגנים סביבתיים הם של דאגה גדולה ברחבי העולם, ובכך, את היכולת להעריך באמצעות חשיפה וזיהומים חסכוניות, גישות תפוקה גבוהה תהיה הכרחית. כתב יד זה מתאר את ההתפתחות וניתוח של immunoassay זמנית מבוסס חרוז ליכולת למדוד את הנוכחות של נוגדנים ברוק אדם פתוגנים רב בו זמנית. רוק הוא אטרקטיבי במיוחד ביישום זה בגלל זה אינו פולשני, זול יותר וקל יותר לאסוף מ בסרום. אנטיגנים של פתוגנים סביבתיים היו מצמידים את microspheres carboxylated (חרוזים) ומשמשים למדידת נוגדנים בנפחים קטנים מאוד של דגימות רוק אנושיים באמצעות assay מבוסס חרוז, פתרון פאזיים. חרוזים היו מצמידים עם אנטיגנים מ קמפילובקטר jejuni, הליקובקטר פילורי, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 ו- G II.4) ודלקת כבד נגיפית A וירוס. כדי להבטיח כי אנטיגנים היו מצמידים מספיק כדיהחרוזים, צימוד אושרו באמצעות נוגדני מינים ספציפיים, לכידה עיקרית-מחי, ואחריו דגירה עם נוגדני איתור משני אנטי-מיני biotinylated כתב streptavidin-R-Phycoerythrin (SAPE). כביקורת למדוד הלא ספציפי מחייב, סט חרוז אחד טופל באופן זהה לאחרים אלא שזה לא היה מצמיד את כל אנטיגן. האנטיגן מצמיד ובקרת חרוזי הודגרו אז עם דגימות רוק אנושיות-שנאספו פרוספקטיבית, נמדדו על נתח תפוקה גבוהה על בסיס העקרונות של cytometry זרימה, ואת הנוכחות של נוגדנים לכל אנטיגן נמדדה ביחידות עוצמות קרינה החציונית (MFI) . יש immunoassay זמנית זו מספר יתרונות, כולל נתונים נוספים עם מדגם פחות; עלויות עבודה מופחתות; ואת היכולת להתאים את assay מטרות רבות של עניין. תוצאות מחקר מראים כי immunoassay זמנית הרוק עשויה להיות מסוגל לזהות חשיפות וזיהומים קודמים, אשר יכול להיות especially שימושי במחקרי מעקב המעורבים אוכלוסיות אנושיות גדולות.

סט חרוז ייחודי אחת שמש כביקורת למדוד הלא ספציפי מחייב מדגם לדגום השתנות. חרוזים אלה טופלו באופן זהה חרוזים בשילוב אנטיגן למעט העובדה שהם לא הודגרו עם כל אנטיגן בשלב צימוד. ערכי MFI&gt; 500 מתקבל החרוזים המלאים מודגרות עם כל דגימות הרוק הוצאו עוד מנתח עקב זיהום חשוד בסרום ואת התגובות שנותרו יומן מבוזרות. הרוק יכול להיות מזוהם עם סרום אם החניכיים הם שפשפו גם נמרצות עם הספוג המצורף למכשיר האוסף או אם המשתתף במחקר יש מחלת חניכיימיים. יומן טרנספורמציה נ...

באקלים הנוכחי של משאבים נדירים, צצות טכנולוגיות חדשות המאפשרות לחוקרים לבצע מחקרים זולים יותר, מהירים יותר ומדויקים יותר. כאן אנו מתארים את הפיתוח של בדיקה חיסונית מרובת נוגדנים מבוססי רוק מבוססת חרוזים למדידת חשיפה אנושית למספר פתוגנים סביבתיים בו זמנית.

פיתוח Immunoassay רוק נוגדן Multiplex כדי לאמוד את חשיפת אדם לפתוגנים הסביבה

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

המטרה הכללית של בדיקת אימונו-סורבנט מולטיפלקס מבוססת-חרוזים לנוגדנים ברוק היא לזהות את הגורמים האטיולוגיים האחראים למחלות סימפטומטיות ואסימפטומטיות הקשורות לסביבה, על ידי מדידה בו-זמנית של תגובות נוגדני IGG למספר פתוגנים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום של מדעי החשיפה. לדוגמה, אילו פתוגנים אחראים לגרימת מחלות באוכלוסיות מסוימות.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה למדידה מהירה וחסכונית של נוגדנים למספר אנליטים בו-זמנית, תוך שימוש בנפחים קטנים ופשוטים מאוד. שיטה זו יכולה לספק מידע על גורמים אתיולוגיים ומקורות החשיפה שלהם, כולל נתיבים המועברים במזון, במים ובאוויר. הדגמה רשמית של פרוצדורה זו היא קריטית, שכן אם היא לא תוגדר כראוי, התוצאות עלולות להיות לא אמינות.התחילו בערבוב במערבל Vortex וביצוע סוניקציה לתערובות המלאי של חרוזי הפסבדו המצומדים לאנטיגנים הרלוונטיים למשך 20 שניות בכל פעם, כדי ליצור תרחיפי חרוזים הומוגניים. לאחר מכן, דללו את מלאי החרוזים המצומדים לריכוז סופי של 100 חרוזים למיקרוליטר של כל סט חרוזים ייחודי ב-PBS, בתוספת 1% BSA. לאחר מכן, הכינו לפחות שבעה דילולים סדרתיים של פי שניים של נוגדן ראשוני anti-species IGG, ב-PBS בתוספת BSA, בלוחית בעלת 96 בארות עם תחתית עגולה, בהתאם להמלצות היצרן.הרטיב מראש עמודה של 12 בארות (שמונה עמודות נפרדות) בלוח סינון בעל 96 בארות עבור כל בדיקת אישור צימוד אנטיגן, באמצעות 100 µL של בופר שטיפה, והסר את הנוזל העליון באמצעות ואקום. לאחר מכן, הוסף 50 µL של חרוזי האנטיגן המצומדים לבארות שהורטבו, ו-50 µL של נוגדן בדילול סדרתי לשורות 1 עד 7 בלוח הסינון בעל 96 הבארות, והוסף 50 µL של PBS פלוס BSA לשורה 8 כביקרת רקע לנוגדן המדולל. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי לערבב את התוכן של כל אחת מהבארות באמצעות שאיבה והזרקה חמישה פעמים.לאחר מכן, כסו את הפלטה והדגירו את הנוגדנים עם חרוזי ה-(beads) המשוריים לאנטיגן בחושך בטמפרטורת החדר על ניעור מיקרופלטה במהירות של 500 rpm. לאחר שעה, שאבו את העליון (supernatant) ושטפו את הבארים באמצעות שתי מנות של 100 microliter של תחליל שטיפה.כעת דללו את הנוגדן המשני למשחבי זיהוי ספציפיים למין (anti-species specific IGG) המצומד לביוטין, לריכוז של 16 micrograms per milliliter ב-PBS בתוספת BSA, והוסיפו 50 microliters של הנוגדן המשני המדולל לכל שורה. דגרו את החרוזיים והנוגדים בטמפרטורת החדר, בחושך, למשך 30 דקות על מנעורה של פלטה. בסיום הדגירה, שאבו את העלייה (supernatant), ושטפו את החרוזיים באמצעות שתי מנות של 100 microliter של תמיסת שטיפה.לאחר השטיפה השנייה, השהו מחדש את החרו지를 ב-50 microliters של PBS פלוס BSA, ודללו את דגמי ה-streptavidin r-phycoerythrin לריכוז של 24 micrograms per milliliter ב-PBS פלוס BSA. הוסיפו 50 microliters מהדגמי לכל באר וערבבו באמצעות פיפטור. הדגירו את הפלטה בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על השייקר, ולאחר מכן בצעו שתי שטיפות של 100 microliter בבופר שטיפה כפי שהודגם.לאחר מכן, השביה מחדש את החרוזים ב-100 microliters של PBS פלוס BSA והערך את החרוזים שנקשרו לאנטיגן באנלייזר. לאחר השביה מחדש של מלאי החרוזים שנקשרו לאנטיגן באמצעות וורטקס וסוניקציה למשך 20 שניות, דלל את מלאי החרוזים שנקשרו לריכוז סופי של 100 חרוזים ל-microliter עבור כל סט חרוזים ייחודי ב-PBS פלוס BSA. לאחר מכן, הכן דילול של 1:4 של רוק בטמפרטורת החדר ב-PBS פלוס BSA בתוך פלטת 96 בארות עמוקות (deep well plate).הרטיבו מראש פלטת סינון באמצעות 100 µL של בופר שטיפה ושאבו את הנוזל העליון. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של חרוזים המצומדים לאנטיגן ונפח שווה של רוק מדולל ל-95 בארות של פלטת הסינון בעלת 96 הבארות, עבור דילול סופי של 1 עד 8. במקביל, הוסיפו לבאר הביקורת 50 µL של חרוזים המצומדים לאנטיגן, בתוספת 50 µL של PBS עם BSA בלבד.דגרו את החרוזים בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת על מערער מיקרו-פלייט במהירות של 500 rpm. לאחר מכן, שאבו את העילוי ושטפו את הבארים פעמיים עם 100 µL של בופר שטיפה. לאחר השטיפה השנייה, השעיקו שוב את החרוזים ב-50 µL של PBS פלוס BSA.יש לדלל את הנוגדן המשני ולהוסיף 50 µL ממנו לכל באר. לאחר ערבוב תכולת הבארים באמצעות פיפטה רב-ערוצית, יש להדגיר את הפלטה על שייקר בחשכה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, לאחר מכן לשטוף את הבארים פעמיים עם 100 µL של בופר שטיפה ולשעול שוב את החרו지를 ב-50 µL של PBS טרי בתוספת BSA. כעת יש לדלל את ה-reporter ולהוסיף 50 µL לכל באר.ערבבו ביסודיות באמצעות פניפטה רב-ערוצית. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר על השייקר בחושך, שטפו את הבארות פעמיים כפי שהודגם, ולאחר מכן השביו את החרוזים ב-100 µL של PBS בתוספת BSA ובדקו את הדגימות באנליזר. כדי להבטיח שהחרוזים המצומדים לאנטיגן מסוגלים להגיע לטווח הדינמי של הבדיקה, צימוד תקין מוגדר כעוצמת פלואורסצנציה ממוצעת הגבוהה מ-18,000 או שווה לה.כפי שהוצג באישורי הצמידה מייצגים אלו של האנטיגנים בבדיקה עבור C.jejuni ו-T.gondii. בהתבסס על נקודת החיתוך (cut-off point) שנקבעה, שיעורי השכיחות החיסונית של הדגימות נעו בין כ-2% עבור T.gondii לכמעט 50% עבור Norovirus geno group 1.1, מה שמעיד על כך ששיעור השכיחות החיסונית היה הגבוה ביותר עבור נגיפי Noroviruses, ואחריהם Hepatitis A ו-H.Pylori. בעוד ש-32% מהדגימות היו שליליות חיסונית לכל הפתוגנים בבדיקה, 68% היו חיוביות חיסונית לפתוגן אחד או יותר.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלים הליך זה בכשלוש עד ארבע שעות אם הוא מבוצע כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לשמור על החרוזים בחושך כדי למנוע הבהרה פוטוכימית (photo-bleaching). לאחר ביצוע הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון ELISAs ו-Western Blotting, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לרגישות ולספציפיות.ככן את תגובת-הצלב של הנוגדנים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי האפידמיולוגיה, מדע החשיפה והמיקרוביולוגיה הקלינית, לבחון סיכונים אנושיים הנובעים מחשיפות סביבתיות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה מעמיקה כיצד לפתח, לנתח ולפרש את תוצאותיו של בדיקת אימונו-סבסב (immunoassay) מרובת רכיבים (multiplex), המודדת נוגדנים למספר פתוגנים בו-זמנית.יש לזכור כי עבודה עם נוזלי גוף וסודיום אזייד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע פרוצדורה זו, כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים והסרה נאותה של הריאגנטים.

developing-salivary-antibody-multiplex-immunoassay-to-measure-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שימוש בטכנולוגית microsphere Xmap של Luminex החברה, פתחתי immunoassay Fluorometric Multiplexed (MFIA) לserosurveillance של מיני בעלי חיים שונים במעבדה. MFIA הוא microarray השעיה בי אנטיגן, בקרת רקמה או נוגדנים קשורות קוולנטית לקלקר microspheres צבעים. שיטת בדיקת MFIA כמו גם נושאים שונים לפתרון בעיות מטופלות.

מתודולוגיה multiplexed Fluorometric immunoassay בדיקה ופתרון בעיות

סרטון זה מדגים טכניקת בדיקה חיסונית מרובת חרוזים לזיהוי בו זמנית של נוגדנים לפתוגנים סביבתיים מרובים ברוק האנושי. חרוזים פלואורסצנטיים הוצמדו לאנטיגנים מפתוגנים שונים, שנלכדו באמצעות נוגדנים בדגימת הרוק האנושית. לאחר תיוג הנוגדנים באמצעות כתב פלואורסצנטי, החרוזים נותחו באמצעות ציטומטריית זרימה כדי להעריך את נוכחותם של נוגדנים ספציפיים לפתוגן שונים ברוק.

מולטיפלקס מבוסס חרוזים לזיהוי נוגדנים ספציפיים לפתוגן ברוק

אנו מתארים הליך לאפיון חלבוני רוק באמצעות מערכי נוגדנים מבוססי microsphere מרובבים. נוגדנים חד שבטיים היו קשורים קוולנטית ל4.5 מיקרומטר זעירים מפולימר ניאון בקידוד צבע באמצעות הכימיה carbodiimide. Microspheres שונה הופקד בmicrowells סיבים אופטיים כדי למדוד את רמות חלבון ברוק באמצעות immunoassays כריך הקרינה.

הריבוב פלורסנט Microarray לניתוח חלבוני רוק אדם שימוש מיקרוסכמות פולימרים ואגדים של סיבים אופטיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית עבור הדגימה של נוזל ללא הפרעה של שורות mucosal של דרכי הנשימה העליונות. זה יכול לשמש כדי לבצע כימות של ויוו רמות של חלבונים מתווכים, כגון ציטוקינים, נוגדנים, המקצועות לכל הגילאים.

לא פולשנית דגימה של נוזל שורות Mucosal עבור כימות של In Vivo דרכי הנשימה העליונות החיסון-מגשרת רמות

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לתאר את התפתחות ואימות מולקולה בודדת מערך דיגיטלי אליסה assay, אשר מאפשרת הזיהוי לאולטרה רגישות כל סוגי IFN-α בדגימות אנושי.

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

מאמר זה מציג פרוטוקול לגילוי סרום ספציפי אימונוגלובולין E עם מערכת chemiluminescence המבוסס על מחסנית microfluidic והערכת תועלתו באיבחונים אלרגיה.

יישום של טכנולוגיה Microfluidic ביו-שבב על סרום לזהות אלרגן ספציפיים אימונוגלובולין E (sIgE)

אנו מציגים פרוטוקול לשימוש מיקרוarray חלבון שנבנה על ידי הדפסת אנטיגנים שפעת על ניטרוצלולוזה מצופה שקופיות בו סרום בדיקה עבור נוגדנים מרובים isotypes נגד מעל 250 אנטיגנים מפני זנים וירוסים שונים, ובכך המאפשר מדידה של רוחב של נוגדנים סרום ברחבי תת וירוס.

שימוש של מיקרוarray אנטיגן שפעת כדי למדוד את היקף של נוגדנים סרום ברחבי תת וירוס

מערכת ניתוח זרימה לבדיקות מולטיפלקס מבוססות חרוזים המספקת קריאה של שני עיתונאים שימשה לפיתוח בדיקות נטרול סרולוגיות ונוגדנים מולטיפלקס שיכולות למדוד בו זמנית נוגדני IgG ו- IgM מנטרלים עבור SARS-CoV-2.

בדיקת נטרול מהירה, מולטיפלקס כפולה IgG ו- IgM SARS-CoV-2 עבור מערכת ניתוח זרימה מבוססת חרוזים מרובי קסים

מאמר זה מתאר שיטה נוחה לניטור שינויים דינמיים בטיטרים של נוגדנים עבור שני איזוטיפים של אימונוגלובולינים בו זמנית (IgA, IgM או IgG) הנובעים מתגובה חיסונית לזיהום SARS-CoV-2 או לחיסון. 'פאנל התגובה החיסונית הרב-אנליטית של Covid-19' משתמש בשלושה מבחנים חיסוניים עקיפים הבנויים על מיקרו-ספירות מקודדות הנקראות באמצעות קורא מולטיפלקס מבוסס זרימה עם יכולת 'דו-ערוצית'.

ניטור דינמי של Seroconversion באמצעות בדיקת אימונו-בייד רב-אנליטית לקוביד-19

מערכת ניתוח זרימה פלואורסצנטית דו-ערוצית בעלת שלושה ערוצים שימשה לפיתוח מערכת חיסון מרובת חרוזים המבצעת בו זמנית דגימות סרום עבור IgG ו- IgM שהופקו כנגד אנטיגנים מרובים של מיני בורליה שונים הגורמים לבורליוזיס ליים באירופה ובצפון אמריקה.

זיהוי סימולטני של סוגי נוגדנים שונים בבדיקה סרולוגית מרובת משתתפים

בדיקות אימונולוגיות פלואורסצנטיות מרובות הופכות להתייחסות לבדיקות סרולוגיות. היישום שלהם, לעומת זאת, מוגבל על ידי המורכבות ותהליכי הצימוד הגוזלים זמן. דוח זה מציג פרוטוקול צימוד חרוזים מיקרוספירה מרובה אוטומטי למחצה הניתן לשחזור הניתן לשחזור הניתן לשחזור הניתן להשוואה לשיטה הסטנדרטית תוך קיצור משמעותי של זמן התוצאות.

בדיקה סרולוגית מולטיפלקס לאיתור תגובות נוגדנים לארבו-וירוסים

למד לפתח immunoassay רוק מבוסס חרוזים לזיהוי נוגדנים IGG נגד פתוגנים סביבתיים רבים בו-זמנית. שיטה זו מאפשרת מדידה מהירה וחסכונית של חשיפה אנושית למזון, מים ואוויר.

פיתוח Immunoassay רוק נוגדן Multiplex כדי לאמוד את חשיפת אדם לפתוגנים הסביבה

גלה סרטונים נוספים