סינתזה מבוקרת מעקב הקרינה של פולי אחיד מאוד ( N -isopropylacrylamide) Microgels
8 בספטמבר 2016
פילמור ממטרים ללא עוררה מספק גישה אבי טיפוס ודגמים, לשחזור לסינתזה של פולי גירויים רגיש (-isopropylacrylamide N) microgels של התפלגות גודל הצרה. בסינתזה בפרוטוקול זה, אפיון פיזור אור ומעקב קרינת חלקיק בודד של microgels אלה או בהתקנה של מיקרוסקופיה רחב בתחום הם הפגינו.
המטרה הכוללת של עבודה זו היא לחקור את ההתנהגות הדינמית והאינטראקציה של חלקיקים קולואידים רכים בפיזור של צפיפויות חלקיקים שונות בקרבת מעבר זכוכית. מיקרוג'ל הם חפצים רכים שיכולים להתאים את גודלם, צורתם וניידותם בהתאם לסביבתם. בניגוד לחלקיקים קולואידים קשיחים, ישנן שאלות פתוחות רבות הנוגעות להתנהגותם של מיקרוג'לים רכים.
היתרון העיקרי של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה רחב הוא האפשרות למקם מיקרוג'לים בודדים בדיוק גבוה, לעקוב ישירות אחר תנועתם ב- C2 ולנתח את כמויות הדיפוזיה. כדי לחקור את הדינמיקה של מיקרוג'לים בודדים במערכות צפופות, יש לסמן רק מספר קטן של מיקרוג'לים פלואורסצנטיים. פילמור משקעים ללא ערבוב מאפשר סינתזה מקבילה של מיקרוג'ל עם תנאי תגובה משתנים כדי להתאים בנוחות לגודל המיקרוג'לים המסומנים והלא מסומנים.
פיזור אור דינמי מספק את הרדיוסים ההידרודינמיים הממוצעים של המיקרוג'לים בדיוק של כמה ננומטרים. ממיסים 1.8 גרם NIPAM ו -24 מיליגרם BIS ב -245 מיליליטר מים מזוקקים כפולים מסוננים בבקבוק תחתון עגול של 500 מיליליטר, בעל שלושה צווארים המצויד במעבה ריפלוקס, מערבל ומחיצת גומי. הכנס מדחום ומחט של 120 מילימטר לכניסת החנקן דרך המחיצה.
מחממים את התמיסה ל 60 מעלות צלזיוס תוך כדי ערבוב. לאחר מכן, יש לחמצן את התמיסה על ידי טיהור עם חנקן למשך 40 דקות. הכינו בו זמנית תמיסת יוזם של 155 מיליגרם אשלגן פרסולפט, או KPS, בחמישה מיליליטר מים מזוקקים כפולים מסוננים, ומבעבעים את התמיסה בחנקן להסרת חמצן.
לאחר מכן, שטפו מזרק בחנקן, והעבירו את תמיסת ה- KPS המלאה של חמישה מיליליטר למזרק שטוף חנקן המצויד במחט של 120 מילימטר. הרם את מחט החנקן מעל מפלס התמיסה בבקבוק בעל שלושה צווארים, והוסף את תמיסת KPS במהירות דרך מחיצת הגומי לתוך הכור. תן לפילמור להמשיך במשך שעה תחת זרימת חנקן וערבוב איטי ב 60 מעלות צלזיוס.
השתמש במשפך בוכנר ונייר סינון כדי לסנן את תמיסת התגובה החמה, והשליך את כל האגרגטים הגדולים. לאחר שנתנו לפיזור להתקרר, צנטריפוגה ופזרו מחדש את הפיזור שלוש פעמים במשך 40 דקות ב-257,000 פעמים G.לבסוף, פזרו מחדש את המשקעים בכמות מינימלית בת קיימא של מים מזוקקים כפולים לפני ליופיליזציה של הפיזור לאחסון. שקלו 257.7 מיליגרם של NIPAM, 3.5 מיליגרם של BIS ו-1.5 מיליגרם של צבע מתקרילוקסיאתיל תיוקרבמואיל רודמין B בכלי זכוכית, והוסיפו 10 מיליליטר מים מזוקקים כפולים מסננים.
הכינו את אותה תמיסה ללא הצבע בכלי זכוכית נפרד. אולטרסאונד את תמיסת הצבע למשך 15 דקות כדי להמיס את הצבע במים. הכן דילולים שונים של תמיסת המונומר עם הצבע לקבלת סדרת ריכוז.
כאן משתמשים בצבע בטווח הריכוזים של 02 עד 0.1 מילימול לליטר. לאחר מכן, ממיסים 8.4 מיליגרם KPS ב-10 מיליליטר מים מזוקקים כפולים מסוננים כדי לקבל את תמיסת היוזם. העבירו 0.5 מיליליטר מסדרת הריכוז ו-05 מיליליטר מתמיסת KPS למבחנות בקוטר 10 מילימטר כדי לקבל את פתרונות התגובה הסופיים.
אוטמים את הצינורות במחיצות גומי. מחממים אמבט שמן בכלי זכוכית בעל דופן כפולה המחובר למחזור חימום ל 63 מעלות צלזיוס. דה-חמצן את תמיסות התגובה על ידי טיהור עם חנקן דרך מחטים של 120 מילימטר למשך 20 דקות.
לאחר מכן, הכנס את הצינורות לפלטפורמה צפה, וטבל את הפלטפורמה באמבט השמן שחומם מראש. הגדר את הטמפרטורה ל 60 מעלות צלזיוס. עבור כוונון גודל חלקיקים ברמת דיוק גבוהה, בקרת הטמפרטורה במהלך התגובה הראשונית צריכה להיות קפדנית, בדרך כלל פלוס מינוס 0.1 מעלות צלזיוס.
תן לתגובה להמשיך למשך פרק זמן מתאים. בדרך כלל, שעה אחת מספיקה. לאחר התגובה, העבירו את צינורות התגובה במהירות לתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס.
שים טיפה אחת מהפיזור החם ב -10 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים מסוננים, מחוממים מראש מעל טמפרטורת מעבר שלב נפח פולי-NIPAM על מנת למדוד את הרדיוסים ההידרודינמיים של החלקיקים במצב קריסה. תנו לשאר הפיזורים להתקרר לטמפרטורת החדר, והעבירו אותם לצינורות צנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה של התמיסה, יש לדלל את המיקרוג'לים בשני מיליליטר מים מזוקקים כפולים מסוננים לשימוש כחלקיקי מעקב.
לקביעת רדיוס הידרודינמי במצב שקרס על ידי פיזור אור דינמי, יש לשטוף תחילה את הקובטות וכלי הזכוכית באדי אצטון. העבר כמיליליטר אחד של פיזור חלקיקים מדולל לקוביית מדידה. מזגו את מדד הגוניומטר הדינמי של פיזור האור באמבטיה ל-50 מעלות צלזיוס, והעבירו את הדגימה למכשיר מבלי לתת לה להתקרר.
הכנס את קובטת הדגימה, והזז את זרוע הגלאי לזווית הפיזור הקטנה. לאחר בדיקת פרופיל האלומה וטווח הספירה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, העבר את זרוע הגוניומטר לזווית הפיזור הגבוהה ביותר. בדוק שקצב הספירה עדיין גבוה מספיק למדידה.
אם העוצמה נמוכה מדי, הזז את הזרוע לזווית פיזור נמוכה יותר. לאחר מכן, בדוק את הקורה חזותית דרך זכוכית אמבט הטולואן בזווית הפיזור הנמוכה ביותר. אם נצפה זוהר סביב אלומת האירוע, מתרחש פיזור מרובה.
רכוש 20 קורלוגרמות בין זווית הפיזור המינימלית למקסימלית עם זמן רכישה מינימלי של 60 שניות. הגדל את זמן הרכישה עבור זוויות פיזור גדולות בעוצמה חלשה במידת הצורך. השתמש בעדשה אובייקטיבית מתאימה של ההגדלה והצמצם הרצויים לעירור העוקבים ואיסוף הקרינה בו זמנית מהדגימה.
בעבודה זו נעשה שימוש בעדשת אובייקטיבית טבילת שמן עם צמצם מספרי של 100X, 1.3. הנח את תא הלחות על שולחן XYZ pi-SO שמתאים למיקרוסקופ. כדי למנוע את התייבשות הדגימה, הנח החלקת כיסוי מנוקה בפלזמה לתוך תא הלחות, ופיפטה 10 מיקרוליטר מהריכוז הרצוי של פיזור פולי-NIPAM.
בהתאם לספקטרום העירור והפליטה של הצבע הפלואורסצנטי, השתמש בלייזר מתאים לעירור, והתאם את עוצמת הלייזר בהתאם. לייזר מצב מוצק של משאבת דיודה של 561 ננומטר משמש כאן בהספק לייזר קבוע של 16 מילי-וואט. כדי להשיג תאורת דגימה הומוגנית, חבר את הלייזר לסיב מולטי-מוד, נער את הסיב באמצעות מערבולת כדי לממוצע זמני של כתמי לייזר, והקרין את קצה הסיב למישור הדגימה.
כייל את מרחק ה-Z מההשתקפות האחורית של החלקת הכיסוי, ומקד כמה מיקרומטרים לתוך הדגימה על ידי הזזת המטרה מעט למעלה, ותקן את מיקום ה-Z באמצעות מפצה Z. זה מונע כל אפקט ממשק עם החלקת הכיסוי. התאם את פרמטרי הגלאי, כגון זמן החשיפה, לעוצמת האות הפלואורסצנטי.
במקרה זה, נעשה שימוש במצלמת EMCCD עם זמן חשיפה של 0.1 שניות במצב הכפלת אלקטרונים ורווח של 50. רכוש מספר סרטים עם מספר הפריימים המתאים כדי להשיג זמן השהיה הולם לחישוב התזוזה הריבועית הממוצעת של המיקרוג'לים באזורים שונים של המדגם. שמונה קבוצות מיקרוג'ל מסומנות סונתזו.
עבור שש קבוצות, שיעורי דעיכת קורלוגרמה עולים ליניארית כנגד ריבוע גודל וקטור הפיזור, מה שמעיד על התפלגות גודל צרה. התאמה דרך המקור מצביעה רק על דיפוזיה תרגומית. עבור שתי קבוצות נצפית התנהגות לא ליניארית.
הסטייה נגרמת על ידי התפלגות גודל רחבה וגורם צורה מינימלי של חלקיקים, העולה בקנה אחד עם טווח וקטורי הפיזור. כדי לקבל אומדן טוב יותר למקדם הדיפוזיה הממוצע של החלקיקים, אל תכלול את הנקודות הללו מההתאמה. יחס אות לרעש גבוה מאפשר מעקב אחר מיקרוג'לים פלואורסצנטיים.
הדיפוזיה שלהם מוגבלת על ידי מטריצת המיקרוג'ל הלא מסומנת. ריכוזים גבוהים יותר של מטריצת מיקרוג'ל ללא תווית בצד ימין מובילים לאפקט כלוב בולט, שבו המיקרוג'לים הפלואורסצנטיים נלכדים במטריצה לא מסומנת של מיקרוג'לים. בריכוזים נמוכים של מטריצת מירקוג'ל לא מסומנת, מיקרוג'לים העוקבים מציגים דיפוזיה נורמלית, אשר מוסקת מהעלייה הליניארית של תזוזה ממוצעת בריבוע עם זמן השהיה.
עם זאת, בריכוזים גבוהים הקרובים למעבר הזכוכית הקולואידית, הם מציגים דיפוזיה לא ליניארית, המתוארת על ידי התפתחות זמנית לא ליניארית של תזוזות ריבועיות ממוצעות. בריכוז גבוה יותר של מטריצת מיקרוג'ל ללא תווית, המיקרוג'לים העוקבים נלכדים על ידי שכנים לא מסומנים בכלובים חולפים, כפי שמודגם על ידי מסלולים מקובצים ל-12 מיקרוג'לים. סינתזה מקבילה בקנה מידה קטן מאפשרת התנסות מהירה בפרמטרי תגובה שונים.
זה גם ממזער כל וריאציה ניסויית לא רצויה עקב הבדלי טמפרטורת תגובה. בשילוב עם אפיון פיזור האור הדינמי הזהיר, ניתן למצוא במהירות את תנאי התגובה לגודל המיקרוג'ל הנכון. בסרטון זה, אנו מדגימים כיצד סינתזת מיקרוג'ל מבוקרת מאפשרת לנו לחקור את הדיפוזיה של מיקרוג'לים בודדים בתמיסות מיקרוג'ל מרוכזות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה רחב.
בעקבות הליך זה ניתן יהיה להבין כיצד מבנה המיקרוג'לים שולט בתכונותיהם. זה יפתח את הדלת לעיצוב חומר אינטראקטיבי רך חדש.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה חוקר את ההתנהגות הדינמית של חלקיקים קולואידליים רכים, ובמיוחד מיקרוג'לים של פולי(N-איזופרופילאקרילאמיד), בפיזורים קרובים למעבר זכוכית. המחקר משתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבה שדה כדי לעקוב אחר מיקרוג'לים בודדים, ומספק תובנות לגבי תנועתם ומאפייני הדיפוזיה שלהם.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- כימיה של פולימרים
- מדע קולואידים
רקע
- מיקרוג'לים יכולים להתאים את גודלם, צורתם ותנועתם בהתאם לתנאי הסביבה.
- הבנת ההתנהגות של מיקרוג'לים רכים חיונית ליישומים שונים.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה מאפשרת לוקליזציה ומעקב מדויקים אחר מיקרוג'לים.
- מחקרים קודמים התמקדו בעיקר בחלקיקים קולואידליים קשיחים.
מטרת המחקר
- לחקור את הדינמיקה של מיקרוג'לים בודדים במערכות צפופות.
- לחקור את האינטראקציה של מיקרוג'לים בצפיפות חלקיקים משתנה.
- לנצל פולימריזציה של משקעים ללא ערבוב לסינתזה של מיקרוג'לים בגדלים מבוקרים.
שיטות ששימשו
- פולימריזציה של משקעים ללא ערבוב לסינתזת מיקרוג'לים.
- אפיון פיזור אור של מיקרוג'לים.
- מעקב פלואורסצנטי של חלקיקים בודדים במיקרוסקופיה רחבת שדה.
- ניתוח התנהגות הדיפוזיה בפיזורי מיקרוג'לים.
תוצאות עיקריות
- הוכח שיטה מהירה וניתנת לשחזור לסינתזת מיקרוג'לים.
- אפיון מיקרוג'לים באמצעות טכניקות פיזור אור.
- מעקב אחר תנועת מיקרוג'לים בודדים ברמת דיוק גבוהה.
- הספקת תובנות לגבי הדינמיקה של הדיפוזיה של מיקרוג'לים בסביבות צפופות.
מסקנות
- המחקר משפר את ההבנה של התנהגות חלקיקים קולואידליים רכים.
- הממצאים עשויים להשפיע על מחקרים עתידיים על יישומים של מיקרוג'לים.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה מוכיחה את עצמה כיעילה לחקר הדינמיקה של מיקרוג'לים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Controlled synthesis and fluorescence tracking of PNIPAM microgels enables precise interrogation of soft colloidal particle dynamics, supporting mechanistic de-risking in early discovery and formulation research. The ability to tune microgel size and directly quantify diffusion in dense matrices advances predictive confidence for material behavior in complex environments. This workflow is strategically positioned for rapid prototyping and hypothesis testing in biopharma R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of microgel diffusion and interaction under variable density conditions.
- Supports mechanistic de-risking by isolating the impact of microgel structure on dynamic behavior.
- Facilitates rapid prototyping of new compositions for hypothesis-driven material design.
Screening & Assay Development
- Provides validated, size-controlled microgels for reproducible assay development.
- Delivers quantitative diffusion and mobility measurements for screening candidate formulations.
- Enables parallel synthesis to minimize batch variability and accelerate optimization cycles.
Translational & Preclinical Research
- Offers insight into microgel behavior near glass transition, relevant for advanced formulation studies.
- Supports continuity from discovery to preclinical evaluation of soft material systems.
- Improves risk-adjusted advancement by clarifying structure-function relationships in complex matrices.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through screening and preclinical formulation, providing a reusable platform for material characterization and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Quantifies how microgel structure and composition affect dynamic properties and environmental response.
- Screening: Supplies standardized, size-tuned microgels for robust, reproducible assay workflows.
- Analytics: Generates high-precision diffusion and mean-square displacement data for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by modeling behavior in dense, physiologically relevant matrices.
- Enterprise Reuse: Enables rapid adaptation of synthesis and tracking protocols across diverse soft material projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in material performance and target validation.
- Operational Value: Standardizes synthesis and measurement, reducing experimental variability.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for new material candidates and formulations.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of soft material assets and research directions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polymer synthesis, fluorescence microscopy, and light scattering analytics.
- Demands precise temperature control and analytical instrumentation for reproducible results.
- Necessitates cross-team standardization of synthesis and measurement protocols.
- Adaptable to various comonomer systems and labeling strategies for broader application.
- Limited to small-scale prototyping; not optimized for large-batch production.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Microgel Synthesis: Conventional Batch Synthesis of Poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) Matrix Microgels
3:14
Microgel Synthesis: Non-stirred Synthesis of Fluorecently Labled Poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) Microgels
5:40
Light Scattering Characterization
7:00
Particle Tracking by Wide-field Fluorescence Microscopy
8:51
Results: Dynamic Light Scattering Characterization and Fluorescence Tracking of Microgels in Concentrated Dispersions
10:29
Conclusion
