נחישות כימות המינים בשנת תערובות שימוש ספקטרומטריית מסה MRM של פפטידים יישומית כדי אימות בשר

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להשתמש בספקטרומטריית מסה לניטור תגובות מרובות כדי לזהות ולכמת את המינים הקיימים בתערובות בשר נא לשימוש ככלי לזיהוי הונאות מזון. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום שלמות המזון, כגון אישור המינים הקיימים במוצרים כמו נקניקיות או המבורגרים. הגישה שלנו מבוססת על ספקטרומטריית מסה של מרכיב החלבון.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לתת תוצאה מהירה וכמותית. הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כששמנו לב שהחלבונים הידועים באותו שם ומינים שונים הם למעשה שונים מספיק כדי לתת זיהוי מינים, אבל דומים מספיק כדי לאפשר כמות. ניקוי תרמי של מיוגלובין ייחוס מטוהרים על ידי חימום הדגימה בבלוק חם ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

מצננים את הדגימה כ-15 דקות עד שהיא מגיעה לטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסיפו 30 מיליגרם אוריאה כדי לשפר את העיכול ולערבב. הוסף תמיסת טריפסין לדגימה ביחס של אחד ל -30 של אנזים לסובסטרט לפי משקל.

לאחר מכן מערבבים על ידי מערבולת עדינה ומניחים לו לפרוטאוליזה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, המלח את הדגימה שלאחר הפרוטאוליזה על ידי דילול הדגימה בנפח עד שניים במים. הפעל מחסנית פאזה הפוכה פולימרית מלאה ב-30 מיליגרם של חומר בפאזה הפוכה על ידי הוספת מיליליטר אחד של מתנול.

לאחר מכן יש לאזן את המחסנית על ידי הוספת מיליליטר אחד של אחוז אחד של חומצה פורמית. טען את הדגימה על המחסנית בכוח הכבידה. כעת שטפו עם מיליליטר אחד של חמישה אחוז מתנול המכיל אחוז אחד של חומצה פורמית.

יש להוציא את הפפטידים עם מיליליטר אחד של מי אצטוניטריל לשני צינורות מיקרו-צנטרופוגה של מיליליטר שמולאו מראש בחמישה מיקרוליטרים של DMSO. לאחר מכן, הסר את הממס בוואקום בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס באמצעות מאייד צנטריפוגלי למשך 120 דקות. לאחר מכן ממיסים מחדש את השאריות ב -250 מיקרוליטר מי אצטוניטריל.

העבר את התמיסה לבקבוקון דגימה אוטומטית בנפח נמוך. אתר את רצפי המיוגלובין עבור המפגשים השונים במסד הנתונים של UniProt. הזן את רצפי המיוגלובין לתיבת המטרה של תוכנת חיזוי הפפטיד והמעבר.

במידת הצורך, רחף מעל פפטיד כדי לחשוף את רשימת המקטעים שלו. לאחר הזנת העדפות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, לחץ על ייצוא ובחר רשימת מעבר כדי ליצור גיליון אלקטרוני המכיל את מעברי ה-MRM והפרמטרים שנוצרו. הגדר כרומוטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים או מערכת HPLC של שיפוע בינארי עם דגימה אוטומטית ועמודת HPLC של מעטפת ליבת C18 המחוברת לספקטרומטר מסה משולש מרובע המופעל במצב אלקטרוספריי חיובי עם זיהוי MRM.

בסעיף עריכת פרמטרים של תוכנת איסוף נתוני ספקטומטריית מסה של כרומוטוגרפיה נוזלית, בחר את סוג הסריקה כ-MRM ואת הקוטביות כחיובית. הזן את ערכי Q1, Q3, time, ID, DP ו-CE עבור המעברים שנוצרו בגיליון האלקטרוני ושמור את שיטת הרכישה. לאחר הגדרת פרמטרי השיטה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, נווט אל תוכנת איסוף הנתונים, לחץ על Acquire ובחר Equilibrate.

בתיבה שנפתחת, בחר את שיטת הרכישה הנדרשת כדי להתחיל בשוויון המכשירים. לאחר מכן הכניסו את בקבוקוני הדגימה למתלה בדגימה האוטומטית. לחץ על קובץ ובחר חדש, ולאחר מכן אצוות רכישה.

בשם המדגם הכנס את הזהות של כל אחת מהדגימות שיש לנתח. עיין בפרוטוקול הטקסט לפרטים כיצד להמחיש את הנתונים שנרכשו. השתמש בבשר שהוקפא בעבר ואז נטחן לאבקה.

הכינו מגוון תערובות בשר על ידי שקילת כמויות הבשר המתאימות לצינורות צנטריפוגה מפלסטיק של 15 מיליליטר. הוסף ארבעה מיליליטר של מאגר מיצוי לאבקת הבשר. לאחר מערבולת במשך 30 שניות, יש לחלץ על שייקר מעבדה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים ב-250 מחזורים לדקה.

העבירו שני מיליליטר מהתמצית לצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר וצנטריפוגה למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ו-17,000 גרם.העבירו 200 מיקרוליטר של הסופרנטנט לשני צינורות צנטריפוגה של מיליליטר. יבש את הדגימות באמצעות מאייד צנטריפוגלי לפני קביעת ריכוז החלבון של הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לבצע פרוטאוליזה של תערובות בשר, יש להמיס מחדש את השאריות המיובשות במיליליטר אחד של תמיסת אמוניום ביקרבונט 25 מילי-מולרי.

מערבבים היטב על ידי מערבולת ומבצעים פרוטאולויזה כמו קודם. לאחר מכן הגדר והפעל את ה-LCMS באופן דומה באמצעות MRM מתוזמן. הצג את הכרומטוגרמה המלאה בתוכנת הצגת הנתונים.

הצג את היונים שחולצו עבור כל מעבר שנקבע בתורו. ודא חזותית שכל אשכול מכיל את המספר הנדרש של פסגות בצורת פעמון בזמן השמירה הצפוי. ובכך מאשר את קיומו של הפפטיד שנבחר.

לאחר מכן, לחץ פעמיים על אשף הQuantiation בסרגל הניווט. בחלון Select Sample, צרו ערכת כימות באמצעות בחירת קובץ נתונים יחיד. לאחר מכן בחר דוגמה זמינה אחת או יותר.

בחר הבא כדי להציג את בחר הגדרות ותיבת שאילתה. השאר את הגדרות ברירת המחדל ובחר הבא כדי להציג בחר שיטה. מהתיבה הנפתחת שיטה, בחר את קובץ שיטת האינטגרציה, ולבסוף בחר סיום.

שמור את טבלת התוצאות, ייצא כקובץ טקסט ופתח אותה בגיליון אלקטרוני כדי לסקור את הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. איור זה מציג את מעברי ה-MRM האינטנסיביים ביותר עבור סוס המתקבלים ממשקל של אחוז אחד לתערובת משקל עם בקר. לעומת זאת, הקו האדום מראה את המעבר מבשר בקר כאשר אין סוס.

זוהי חלקה של כמות הסוס הנמדדת לעומת כמות הסוס המוכנה בבקר המבוטאת ביחסים. התרשים מראה בבירור כיצד ניתן להשתמש בשיטה לביצוע מדידות כמותיות. לאחר שליטה ובעת שימוש בעיבוד אצווה, התפוקה בשיטה זו יכולה להגיע עד 20 דגימות ל-24 שעות.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבחור חלבון מתאים לניתוח מיצוי. מיוגלובין הוא מועמד טוב לבחינת מיני בשר אדום מכיוון שהוא בשפע, מסיס במים ויציב בחום. ניתן להרחיב הליך זה כך שיכלול מינים נוספים שיש לזהות ולכמת בו זמנית.

המספר המרבי מוגבל רק על ידי מהירות סריקת ספקטומטריית המסה. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים להשתמש בטביעת אצבע פפטו בתחומים כמו הגנה על הצרכן והמותג.