החזותי איתור מדד-צבע של פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד על פלטפורמת מניפולציה אגל פניאומטיים
27 בספטמבר 2016
עבודה זו מציגה שיטה פשוטה וחזותית לזהות פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד על פלטפורמת מניפולצית אגל פנאומטי. עם השיטה המוצעת, הניסוי כולו, כולל מניפולציה אגל וזיהוי של פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד, יכול להתבצע ליד 23 מעלות צלזיוס ללא סיוע של מכשירים מתקדמים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לשלב שיטה פשוטה לזיהוי ויזואלי של פולימורפיזמים מרובי נוקלאוטידים עם פלטפורמה למניפולציה של טיפות פנאומטיות. פלטפורמת זיהוי ה-DNA נמצאת על משטח פתוח והיא מיועדת לשימוש עבור חוקרים ביוכימיים. חקרנו כלי פשוט לאיתור חוזר ונשנה של מוטציות גנטיות ומחלות גנטיות.
יש לו פוטנציאל גדול יותר לעזור לנו להבין כיצד שונות גנטית מובילה למחלות. שילבנו שתי שיטות חדשות ופשוטות. ניתן לזהות את הפולימורפיזם הרב-נוקלאוטידי על פלטפורמת מניפולציית הטיפות הפנאומטית בעין בלתי וללא כל מכשיר נוסף.
השיטה לזיהוי פולימורפיזם רב-נוקלאוטידי תודגם על ידי צו-מינג וואנג, הפוסט-דוקטור בקבוצה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו תמיסה של 100 מיקרו-מולרית של DNA בדיקה כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הוסף את ה-DNA של הגשושית לתמיסה של OD אחד למיליליטר של ננו-חלקיקי זהב.
להביא את הריכוז הסופי של SDS ל-0.01% ושל PBS ל-0.01 מולחנת. אפשר לתמיסה לדגור למשך 20 דקות. לאחר מכן, הגדל את ריכוז הנתרן הכלורי ל-0.05 טוחנת על ידי הוספת תמיסה של שני נתרן כלורי מולרי ו-0.01 PBS מולארי.
שמור על ריכוז ה-SDS על 0.01% ותן לתמיסה לדגור למשך 20 דקות. הגדל את ריכוז הנתרן הכלורי במרווחים של 0.1 טוחנת במרווחים של 20 דקות עד להגעה לריכוז סופי של טוחנת אחת. דגרו את התמיסה בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס למשך הלילה על מסובב.
לאחר שדגימות ה-DNA וננו-חלקיקי הזהב הצמידו, צנטריפוגה את התמיסה ב-7,000 פעמים גרם למשך 30 שניות. הסר את ה-supernatant. לאחר מכן, הכינו תמיסת בדיקה של ננו-חלקיקי זהב 25 ננו-מולרי על ידי השעיית הגלולה במים נטולי יונים.
הכן דגימות DNA יעד כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף שישה מיקרוליטרים של תמיסת בדיקה של ננו-חלקיקי זהב לכל דגימת DNA עם נתרן כלורי. בעזרת מערבל מערבולת יש לנער כל תמיסת דגימה למשך חמש דקות בחום של 23 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הוסף שישה מיקרוליטרים של 400 מילי-מולרי הידרוקסיל אמין ושישה מיקרוליטרים של חומצה כלורואורית של 25.4 מילי-מולרית לכל תמיסת דגימת DNA. הניחו את הדגימות הללו בצד מכיוון ששינוי קבוע בצבע יתרחש במהלך השעה הקרובה. ניתן להבחין בגודל, בתכונות האופטיות תלויות הצורה של הננו-חלקיק, במספר אי ההתאמה במקטע DNA דגימה אופייני בעין.
כדי להתחיל לייצר את פלטפורמת המניפולציה של הטיפות, השתמש במכונה מבוקרת מספרית ממוחשבת המצוידת במקדח 0.5 מילימטר כדי לייצר תבניות מופת מבוססות PMMA עם מיקרו-מבנים. עבור המקדחה, השתמש במהירות הזנה של שבעה מילימטרים לשנייה ובקצב סיבוב של 26,000 סל"ד, ובדוק את התבניות לאחר הקידוח. השתמש במפוח אוויר ובמים נטולי יונים כדי לנקות את פני השטח של תבניות המאסטר ולהסיר כל שאריות PMMA.
לאחר מכן, הכינו תערובת של 10 לאחד של בסיס PDMS וחומר ריפוי. הסר את התערובת בחומר ייבוש עד להסרת כל בועות האוויר. לאחר מכן, יוצקים את תערובת ה-PDMS לתבנית המופת.
אופים שלוש שעות בחום של 60 מעלות צלזיוס כדי להשיג את המיקרו-מבנים ההפוכים בתאי האוויר ובתעלות האוויר. לאחר סיום האפייה, הסר את שכבת ה-PDMS מתבנית המאסטר, ונקב בה חורים לכניסות יניקת האוויר. השתמש במערכת טיפול בפלזמת חמצן כדי לנקות את קרום ה-PDMS ושכבת ה-PDMS.
לאחר הטיפול, קשר את קרום ה-PDMS ושכבת ה-PDMS, ולאחר מכן נקב חורים במבנה מצומד זה. לאחר מכן, חבר את ה-PDMS ומצע הזכוכית יחד באמצעות פלטה חמה ב-90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר שהשכבות מחוברות זו לזו, הנח את הצלחת המרוכבת למכונת חיתוך לייזר PDMS עם הממברנה כלפי מעלה.
ייבא את קובץ ה-dwg כדי להגדיר את האזור הסופר הידרופובי, ושים לב שהוא ייחרט ישירות בממברנת ה-PDMS. נקה את המשטח הסופר-הידרופובי החרוט החדש במים נטולי יונים. זה ישטוף את כל השאריות המוגזות.
לאחר ניקוי המשטח, חבר את כניסת יניקת האוויר ומשאבת הוואקום דרך שסתום סולנואיד. לאחר מכן, חבר את שסתום הסולנואיד למחשב כדי לשלוט בו באמצעות מודול USB IO דיגיטלי. לאחר הקמת פלטפורמת המניפולציה הפנאומטית, הוסף 10 מיקרוליטר של 0.5 מיקרו-מולרי DNA מטרה על האזור הסופר-הידרופובי.
לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת בדיקה של ננו-חלקיקי זהב 25 ננו-מולרי טריים ליד טיפת ה-DNA המטרה. השתמש בתוכנית פשוטה כדי לשלוט ביניקת האוויר לפלטפורמה דרך שסתום סולנואיד. הגדר את הלחץ למינוס 80 קילופסקל, ואת תדירות הנסיעה לחמישה הרץ.
ספק יניקה לאורך נתיבי הרטט של הטיפה, מה שגורם להם להתנגש ולהתלכד. לאחר מכן, מערבבים את הטיפה המאוחדת על ידי מניפולציה של היניקה כדי לגלגל את הדגימה למשך שלוש דקות. הוסף שני מיקרוליטרים של 400 מילי-מולרי הידרוקסילאמין, ושני מיקרוליטרים של 25.4 מילי-מולרי חומצה כלורואורית לאזור הסופר-הידרופובי של פלטפורמת מניפולציית הטיפות הפנאומטיות.
תפעל את היניקה כך שהטיפות יתנגשו ויתמזגו. לאחר מכן, מערבבים את הטיפה הממוזגת על ידי גלגולה למשך דקה אחת. התבונן בצבע הטיפה הסופית בעין בלתי.
במחקר זה, פולימורפיזמים מרובי נוקלאוטידים מתגלים באופן קולורומטרי באמצעות הכלאת DNA בתיווך צמיחה של בדיקות ננו-חלקיקי זהב. כאן, לדגימות ה-DNA יש זיקה שונה ל-DNA של הגשושית, מה שגורם להבדלים בצמיחה של ננו-חלקיקי הזהב, הנראים כשינוי בצבע. לדגימת ה-DNA הלא תואמת של שלושת זוגות הבסיסים יש פחות הכלאה מאשר ה-DNA המשלים במלואו, מה שניתן לראות כהבדלים בולטים בצבע, במיוחד בריכוזים גבוהים יותר.
ל-DNA הלא תואם של ששת הבסיסים יש זיקה חלשה להכלאה לבדיקה, ולכן גודל הגידול של ננו-חלקיקי הזהב היה קטן. ניתוח קולורומטרי זה הוכח כחוזר על עצמו כאשר דגימות עוברות מניפולציה באמצעות פלטפורמת יניקה פנאומטית, שכן התוצאות של אי התאמה של DNA ניתנות לצפייה בקלות בעין בלתי. לאחר השליטה, ההליך כולו לוקח פחות מחמש דקות מהוספת הדגימה והמגיב ועד לתוצאתם, וזה הרבה יותר מהיר מהשיטה המסורתית.
הסכום הכולל בכל פעולה הוא 10 מיקרוליטר בלבד, וזה פחות משמעותית מהנדרש במערכת גדולה. בעקבות הליך זה, לאחר אישור וריאציה של הרצף של חלל שבר ה-DNA כאחראית למחלה ספציפית. ניתן להשתמש במוצר שתוכנן במיוחד כדי לרכוש מספר אי התאמה של ה-DNA של הדגימה.
פלטפורמת מניפולציית הטיפות הפנאומטית תואמת יותר ביולוגית משיטות אחרות כגון שקלול אופטי, אלקטרו פלואורסצנטי צבע, שקלול אלקטרו והפעלה נימית של shoomoo. שיטת זיהוי הפולימורפיזם הרב-נוקלאוטידי המוצעת בוצעה תחת פלטפורמת מניפולציה של טיפות פנאומטיות, כלומר ניתן לטעון ולאסוף ישירות את הדגימות והריאגנטים עם פיפטה. לאחר פיתוחה, לטכניקה זו יש פוטנציאל גבוה לבדיקת דנ"א, ויישומים כימיים וביומטיים אחרים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
עבודה זו מציגה שיטה פשוטה וחזותית לגילוי פולימורפיזם רב-נוקלאוטידי על גבי פלטפורמה פנאומטית לניהול טיפות. השיטה מאפשרת גילוי ללא מכשירים מתקדמים, ובכך היא הופכת לנגישה עבור חוקרים בתחום הביוכימיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביוכימיה
- גנטיקה
- ביוטכנולוגיה
רקע
- פולימורפיזמים רב-נוקליאוטידיים הם וריאציות גנטיות שעלולות להוביל למחלות.
- הבנת מוטציות גנטיות היא קריטית למחקר של מחלות.
- שיטות נוכחיות דורשות לעיתים קרובות מכשור מורכב.
- שיטה פשוטה יותר עשויה לשפר את הנגישות עבור חוקרים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה פשוטה לזיהוי מוטציות גנטיות.
- שימוש בפלטפורמה פנאומטית לניהול טיפות למטרה זו.
- סיוע בהבנת השונות הגנטית והשלכותיה על הבריאות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פלטפורמה פנאומטית למניפולציה של טיפות.
- זיהוי ויזואלי של פולימורפיזמים רב-נוקליאוטידיים.
- ביצוע ניסויים בטמפרטורה הקרובה לטמפרטורת החדר (23 °C).
- אין צורך במכשור מתקדם לצורך הזיהוי.
תוצאות עיקריות
- השיטה מזהה בהצלחה פולימורפיזמים רב-נוקליאוטידיים באופן חזותי.
- היא מפשטת את התהליך הניסיוני עבור חוקרים.
- מדגימה פוטנציאל ליישומים רחבים יותר במחקר גנטי.
- משפרת את ההבנה של וריאציות גנטיות הקשורות למחלות.
מסקנות
- השיטה המוצעת היא יעילה וידידותית למשתמש.
- היא פותחת נתיבים חדשים למחקר גנטי ללא צורך בכלים מורכבים.
- מחקרים עתידיים יוכלו להרחיב את היישומים של שיטה זו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת זיהוי חזותי מהיר של פולימורפיזמים רב-נוקליאוטידיים ללא צורך במכשירים, ובכך היא תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים של מחקר על מחלות גנטיות. על ידי הפחתת זמן הבדיקה לפחות מחמש דקות ונפח הדגימה ל-10 µL, היא משפרת את יעילות הסריקה בתהליכי גילוי. גישה זו מספקת פלטפורמה זולה וביו-קומפטבילית לבדיקת השערות במסגרת הפחתת סיכונים (de-risking) של מטרות בשלב הפרה-קלניי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר הבחנה חזותית ברמות של אי-התאמה (mismatch) ב-DNA באמצעות צמיחת גשושית AuNP, ובכך תומך בבחינת היפותזות טיפוליות.
- ערך תפעולי: מקל על הערכה מהירה של וריאנטים גנטיים הקשורים למנגנוני מחלה ללא צורך במכשור מורכב.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תוצאות קריאה אופטיות התלויות בגודל ובצורה, המתואמות עם מספר אי-התאמות הנוקליאוטידים לצורך סריקה כמותית.
- ערך תפעולי: משתמש במניפולציה פנאומטית של טיפות לצורך ערבוב מדויק וסימולטני של ריאגנטים על פני שטח פתוח, ובכך משפר את הדיוק והשחזור של הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול מערכות רלוונטיות למחלות על ידי זיהוי וריאציות ברצף אשר הוכח כי הן מניעות פתולוגיות ספציפיות.
- ערך תפעולי: מאפשר רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות זיהוי חוזר של השפעות פולימורפיזם בעין בלתי מזוינת.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה מתאימה לשלבים שבין גילוי מוקדם לזיהוי תרכובות מובילות, ומספקת תיקוף פונקציונלי של מטרות גנטיות לפני סריקת תרכובות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבירור מסלולים על ידי קישור יעילות היברידיזציית DNA לצמיחת ננוחלקיקים ופלט קולורימטרי.
- סריקה: מספקת מוכנות של הבדיקה באמצעות התמזגות וערבוב סטנדרטיים של טיפות תחת יניקה פנאומטית מבוקרת.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה חזותית של מצבי אגרגציה של AuNP כמדד לנאמנות ההיברידיזציה ולסבילות לחוסר התאמה (mismatch).
- מחקר תרגומי: מקשרת בין זיהוי וריאנט גנטי לתוצאות פנוטיפיות בהקשרים רלוונטיים למחלה, כאשר השונות ברצף תוקפה פתוגנית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר לסריקת חומצות גרעיניות, הישמה במגוון קמפיינים של תיקוף מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות תצפית ישירה על השפעות פולימורפיזם על אינטראקציות בין גששים לננו-חלקיקים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה באמצעות בקרה פנאומטית ניתנת לתכנות וצריכה מינימלית של ריאגנטים.
- ערך אסטרטגי: מקצר את לוחות הזמנים להפחתת סיכונים ביולוגיים, ומאפשר קבלת החלטות מהירה יותר של go/no-go בתעדוף מטרות.
- השפעה על תיק הפרויקטים: תומך בקידום מותאם-סיכון על ידי אישור מניעים גנטיים של מחלה לפני השקעה בפיתוח טיפולי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהיברידיזציה של חומצות גרעיניות ובפונקציונליזציה של ננו-חלקיקים.
- תלוי במערכות בקרה פנאומטיות, משאבות ואקום ושסתומי סולנואיד למניפולציה של טיפות.
- מחייב סטנדרטיזציה של תכונות פני השטח של ממבراءة PDMS ושל פרמטרי שאיבת אוויר בין הצוותים השונים.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של ריכוז הפרובים ותנאי האינקובציה.
- מגבלות מעשיות כוללות תלות בפירוש ויזואלי של הצבע, אשר עשוי להיעזר בתנאי תאורה סטנדרטיים.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Detecting Multi-nucleotide Polymorphisms by Hybridization-mediated Growth of Gold Nanoparticles
3:36
Fabrication of the Pneumatic Droplet Manipulation Platform
5:58
Detecting Multi-nucleotide Polymorphisms on the Pneumatic Droplet Manipulation Platform
7:21
Results: Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms
8:24
Conclusion
