עיצוב ושימוש בעלות נמוכה, אוטומטי Morbidostat עבור Adaptive אבולוציה מהירה של חיידקים תחת אנטיביוטי והתרופות בחירה

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לאפיין את הנתיב האבולוציוני של עמידות לאנטיביוטיקה באמצעות Morbidostat, המנטר באופן רציף את הצמיחה הבקטריאלית ומתאים באופן דינמי את ריכוז האנטיביוטיקה ככל שהבקטריות רוכשות עמידות לתרופה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהמערכת מורכבת מרכיבים אלקטרוניים זמינים וזולים, וניתן להגדירה מחדש בקלות למטרות ספציפיות. את הפרוצדורות ידגימו Po Cheng Liu ו-Yi Tai Lee, שניהם סטודנטים לתארים מתקדמים במעבדתי.

להרכבת ה-Morbidostat, התחילו בשימוש במחט במידה 18 (gauge) כדי ליצור שלושה חורים במכסה של מבחנה התרבית. גזרו שלושה קטעים של צינור פוליאתילן באורך של כחמישה סנטימטרים והכניסו אותם לחורים במכסה. השתמשו בסרט הדבקה כדי לעטוף את קצה המכסה שישמש כתבנית עבור תערובת ה-Polydimethylsiloxane, או PDMS.

לאחר מכן, הוסיפו חמישה גרמים של רכיב A ו-0.5 גרמים של רכיב B של ה-PDMS למכל פלסטיק בנפח 150 מיליליטר וערבבו ידנית באמצעות קיסם. העבירו את התערובת למזרק בנפח 10 מיליליטר. לאחר מכן, השתמשו במזרק כדי להזריק את תערובת ה-PDMS אל הפקק.

אפו את המכסה כולו בטמפרטורה של 70 °C למשך שמונה שעות כדי להקשות את ה-PDMS. לאחר מכן, בעזרת מלחם, המריאו את האנודה של ה-LED עם חוט 24 gauge ואת הקתודה של ה-LED עם נגד פחמן. לאחר מכן, המריאו נגד פחמן של 680 Ohm עם חוט 24 gauge.

השתמשו בסרט בידוד כדי לבודד את חיבור החוטים. הלחימו את הקולקטור (collector) של גלאי הפוטו-דיודה עם חוט בנחיר 24, ואת האמיטר (emitter) של גלאי הפוטו-דיודה עם נגד פחם של 100 Ohm. לאחר מכן, השתמשו בסרט בידוד כדי לבודד את חיבור החוטים.

הניחו את הדיודה הפולטת אור במחזיק מבחולות התרבית. בהתאם לסכימת המעגל המוצגת כאן, חברו את הדיודה הפולטת אור והשתמשו במקור כוח של five volt כדי להפעילה. ודאו שה-LED פועלת באמצעות מצלמה דיגיטלית המסוגלת לזהות IR. כעת, הניחו את גלאי האור במחזיק מבחולות התרבית.

לאחר מכן, בהתאם לדיאגרמה, חברו את גלאי הפוטו והשתמשו בספק כוח של five volt כדי להפעילו. חברו את החוט לשני צדי נגדי גלאי הפוטו כדי למדוד את המתח על פני לוח הבקרה האלקטרוני. הדביקו מגנט על הציר של מאוורר הקירור המשמש כיחידה לבבחישה מגנטית.

מכיוון שיחידת הערבוב המגנטית מורכבת מהמגנט וממאוורר הקירור, חיוני להיישר את מדף המאוורר אל מול מבחורת התרבית. כמו כן, המרחק בין מבחורת התרבית למגנט קריטי מאוד להבטחת פעולה יציבה. חבר כל קטע של צינור פוליאתילן של מבחורת התרבית לקטע המתאים של צינור סיליקון עבור המיקרו-משאבות, בקבוקי המדיום ובקבוק הפסולת.

הפעילו את המשאבה למשך שעה אחת ומדדו את הנפח הכולל הנשאב מבקבוק המצע אל מבחלת התרבית כדי לקבוע את קצב השאיבה. קצב השאיבה הטיפוסי צריך להיות כ-4 ml לשעה, מה שמתאים לקצב דילול של D שווה ל-0.33 לשעה עבור נפח עבודה של 12 ml במבחלת התרבית. עם השלמת ההכנה, הניחו את המכלול כולו במערבב עם דגירה (shaking incubator) בגודל בינוני.

כדי לבצע בדיקת תקינות ראשונית ל-Morbidostat, הגדירו את מתח ספק הכוח של מאוורר הקירור לחמישה וולטים כדי להפעיל את המנוע שלו ולבדוק את מוט הבחישה המגנטי. לאחר הכנת סדרה של דגימות E-coli ושרטוט עקום כיול בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכינו את מבחנת התרבית עם שלושה קטעים של צינור Tygon עמיד במיוחד לכימיקלים באורך של שבעה סנטימטרים, בעל קוטר פנימי של 1/32 אינץ' וקוטר חיצוני של 3/32 אינץ', שישמשו כפתחי כניסה להרכבת המכשיר. הכינו מצע מינימלי M9 עם 0.2% glucose ומצע M9 המכיל את התרופה Trimethoprim או TMP.

לאחר מכן, עקרו את המצע, את בקבוק המצע, את בקבוק המצע עם התרופה, את בקבוק הפסולת ואת מבחורת התרבית באוטוקלב בטמפרטורה של 121 °C. ביום הראשון של הניסוי, הפשירו 1 mL של תאי E-coli MG1655 מסוג wild type קפואים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, והעבירו 120 µL מהתאים למבחורת תרבית המכילה כ-12 mL של מצע גידול M9. הפעילו את האינקובטור המנער והגדירו את הטמפרטורה ל-30 °C ללא ניעור.

התחילו את פעולת המורבידוסטט (Morbidostat) על ידי הפעלת מיקרו-המשאבה, יחידת ערבוב מגנטית ומדידת צפיפות אופטית. לאחר כ-23 שעות, הפסיקו את פעולת מיקרו-המשאבה על ידי כיבוי מתח ההזנה שלה והוציאו את מבחנת התרבית. הוסיפו 15% glycerol למבחנת התרבית והקפיאו את הדגימות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לצורך אחסון.

מעבר למבחנת תרבית חדשה בתחילת כל אחד מהניסויים הללו הוא חשוב גם כן כדי למנוע היווצרות של biotin. אחרת, היווצרות biotin עלולה להתרחש בתוך יומיים או שלושה. לאחר הפשרת הדגימה הקפואה היומית בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, יש להחדיר את התרבית למבחנה חדשה עם מצע M9 טרי.

הנח את הדגימה באינקובטור עם ניעור בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה. למחרת, השתמש במצע M9 כדי לדלל את הדגימה המיקרוביאלית פי עשרה, והעבר אותה אל המכשיר המיקרופלואידי על ידי הפעלת לחץ של 5 PSI על מיכל הדגימה המיקרוביאלית. לאחר מכן, העמס למשבב את המצע המכיל TMP על ידי הפעלת לחץ של 5 PSI על מיכל ה-M9 עם ה-TMP.

בצעו את הערבוב בין המיקרוב לתרופה על ידי הפעלת השסתום המכני-מיקרוסקופי בין שני התאים שבשבב המיקרופלואידי למשך 15 דקות. לבסוף, הניחו את השבב המיקרופלואידי בתוך האינקובטור של המיקרוסקופ המותקן על גבי מיקרוסקופ הפוך. בעזרת מצלמת CCD, רכשו תמונות של התאים בתא הצמיחה בכל שעה למשך שמונה שעות.

חשבו את נתוני מספר התאים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. פעולות Morbidostat נפוצות, הכוללות אבולוציה ניסוית, בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה ובדיקת מורפולוגיית תאים, תוקפו באמצעות תרבית של E-coli MG1655 שנחשפה לאנטיביוטיקה TMP, המשרה עלייה מדרגית מובהקת בעמידות לתרופה עם מוטציות המתרכזים סביב הגן של dihydrofolate reductase, או DHFR. בכל יום, המיקרואורגניזם צפוי לצמוח מעל סף הצפיפות האופטית שהוגדר מראש ולהפעיל את הזרקת התרופה כפי שמוצג כאן.

הזרקת התרופה צפויה לעכב את הצמיחה, וכתוצאה מכך, להפחית את הצפיפות האופטית. גרף זה מציג את העלייה הכרונולוגית בעמידות לתרופה האנטיביוטית בניסוי לקביעת ה-IC50. העמידות לתרופה עלתה פי 1500 בקירוב, עד ל-1,000 micrograms per milliliter לאורך כ-12 ימים.

בדומה לממצאים קודמים. מוטציות נקודתיות ב-DHFR במוטנט של היום האחרון נמדדו באמצעות ריצוף סנגר (Sanger sequencing) והן מפורטות בטבלה זו. רכישת עמידות לתרופות עם מוטציות מרובות מוכיחה את יעילותו של ה-Morbidostat.

מכיוון שהברירה על מצעי אגר המכילים תרופות נוטה להעניק מוטציה בודדת בלבד. איור זה מציג את עקומות הגדילה על השבב בריכוזים שונים של TMP. דגימות המוטנטים מראות עלייה משמעותית בעמידות לתרופות אנטיביוטיות.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים לבחון את מיקומם של תרופות עמידות לאנטיביוטיקה בסביבת מעבדה מבוקרת אמיתית. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מדידות נוספות, כגון מדידה מיקרופלואידית של תא בודד, על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון השאלה האם המורפולוגיה משתנה עקב חשיפה לתרופות אנטיביוטיות. לאחר השליטה במכשיר, ניתן להגדירו מחדש בקלות עבור כל ניסוי בתרביית חיידקים, כגון גידול של זן חיידקים או העלאת רמת הסבילות לתרופה של זן חיידקים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו לומדים את רכישת העמידות לסמי antibiotiques בניסוי אבולוציוני מעבדתי אדפטיבי עם ביקורת ממשית. אל תשכחו לטפל בחיידקים העמידים לסמים בהתאם לכללי הביו-בטיחות לפרקטיקה מיקרוביולוגית. ייתכן שיידרש אישור מיוחד עבור ניסוי הכולל אימון בסיסי של חיידקים.