גישה פשוטה מניפולציות חמצן מומס לתצפיות התנהגות בעלי החיים
28 ביוני 2016
מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט לשחזור כדי לתפעל תנאי חמצן מומסים במעבדת הגדרה ללימודי התנהגות בעלי החיים. פרוטוקול זה יכול לשמש הוא הגדרות הוראת מעבדת המחקר להעריך תגובה האורגניזם של חסרי חוליות, דגים, דו-חיים או לשינויים בריכוז חמצן מומס.
המטרה הכללית של שיטה זו היא לבצע מניפולציה יעילה והדרגתית של תנאי חמצן מומס או DO בסביבת מעבדה, כדי לאפשר תצפית על תגובות התנהגותיות של בעלי חיים מימיים. היתרון של שיטה זו הוא שניתן ליישמה במספר ניסויי התנהגות בבעלי חיים.
עבור חולייתנים וחסרי חולייתנים כאחד. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן ליישם אותה הן לצורכי הוראה בכיתה והן למטרות מחקר. באתר שדה נבחר, במרחק של עד שעה נסיעה מהמעבדה, השתמשו בנהלי רשת דגיסת (kick net) סטנדרטיים כדי לאסוף לפחות 35 זבובים אבנים.
אספו מהנחל ארבעה ליטרים של מי נחל עבור כל אקווריום. הוסיפו שלושה ליטרים נוספים לכל ניסוי. כמו כן, אספו מספר סלעים שקוטרם המקסימלי הוא שני סנטימטרים.
עם החזרה למעבדה, חלק את הסלעים לאקווריומים המוצבים במקרר, אשר טמפרטורתו מכוונת לטמפרטורה שנמדדה באתר הנחל. הוסף ארבעה ליטרים של מי נחל לכל אקווריום. לאחר מכן, הוסף 20 עד 30 זבובים-אבן (stoneflies) לכל אקווריום.
הניחו אבן אוורור המחוברת למשאבת אוויר של אקווריום בכל אחת מהמיכלים, כדי להוסיף באופן רציף אוויר חדר למים. לאחר יומיים, חברו צינור ואקום סטנדרטי לקיר לזרוע הצד של בקבוק עם זרוע צד בנפח שני ליטר. מלאו את הבקבוק ב-1.9 ליטר של מי נחל בטמפרטורה של 12 °C.
הניחו את הבקבוק ואת הצינורות על מגש גדול מספיק כדי להכיל אמבט קרח מבלי להסתיר את המבט אל תוך הבקבוק בעל הזרוע הצדדית. מלאו את המגש בקרח. הכניסו גשושית DO לאחד החורים בקוטר 3 mm של פקק גומי שהוכן במיוחד.
וצינור נחושת בקוטר שני מילימטרים המצויד במחבר ברב לצינור (male hose barb coupler) של שלושה מילימטרים דרך חור נוסף של שלושה מילימטרים. עד שאורך הצינור מבסיס הפקק יהיה במרחק של 10 סנטימטרים מתחתית הבקבוק. חברו צינור גז מפוליאתילן בעל דופן דקה, בקוטר שלושה מילימטרים ובאורך 0.7 מטרים, למחבר.
בדקו אם קיים איטום מאובטח בין הפקק לבקבוק, וכן אם הצינור והחוט של הפרובה מותאמים היטב בתוך הפקק. קריטי שהפקקים והצינורות יהיו אטומים היטב כדי לשמור על סביבת לחץ שווה בכלי לאורך כל הניסוי ולמנוע דליפת חנקן מהכלי. הכניסו את צינור הפוליאתילן לבקבוק של 1 liter המכיל 0.4 liters של מי ברז, והדביקו את הצינור כדי לשמור על הקצוות טבולים לאורך כל הניסוי.
לאחר מכן, חברו את קו הגז בקוטר שלושה מילימטרים מהבקבוק הוואקום למנפח אוויר של אקווריום. הפעילו את המנפח כדי להעשיר בחמצן את המים בבקבוק של שני ליטר באמצעות החמצן מהסביבה. השתמשו בבקר ה-DO כדי לנטר את טמפרטורת המים ואת ריכוז ה-DO במשך כחמש דקות.
עד להשגת שיווי משקל של ה-DO בתוך התא. לפני הוספת זבובות האבנים, הניחו שלושה עד ארבעה סלעים לתוך הבקבוק בנפח שני ליטר, כך שלחרקים יהיה מצע המאפשר תנועות דחיפה (push ups). לאחר מכן, התחילו במניפולציה ניסיונית של ה-DO על ידי ניתוק צינור הגז מהמבעבע וחיבורו לקו גז החנקן.
התחילו להזרים חנקן בנפח של 20 cubic feet לשעה למשך כ-40 עד 60 שניות. הפסיקו את זרימת החנקן מיד עם ההגעה לריכוז היעד. השתמשו במנשף אוויר של אקווריום כדי לחזור לריכוז היעד במידה וה-DOD יורד מתחת ליעד.
אם רמת ה-DO אינה יציבה במהלך הבדיקה, יש לוודא שנפח המים הוא עדיין 1.9 ליטר ושלא עלו בועות מים החוצה. יש לוודא שטמפרטורת המים יציבה ושאטמי כל החיבורים סגורים היטב. לאחר השגת שיווי משקל מחודש של המערכת, יש להוסיף לבקבוק מספר זבובים מים (stoneflies) השווה למספר הצופים.
והרמתו מחדש של הבקבוק בעזרת פקק גומי. הזרים בועות של מים כפי שהודגם הרגע עד להגעה לריכוז מטרה של 10 milligrams per liter. לאחר מכן, רשום את טמפרטורת המים ההתחלתית.
והמתינו עד שזבובות האבן ייצמדו למצע הסלע בתוך הבקבוק. לאחר מכן, כל תצפית יספור ויתעד את מספר ה"שכיבות סמיכה" (push ups) שביצעה זבובת אבן בודדת במשך שלוש דקות. לאחר מכן, שנו את רמת ה-DO לרמה הניסויית הבאה וחזרו על התצפית למשך שלוש דקות.
באיור זה, נדגם מספר השכיבות הממוצע שבוצעו בתוך רמה של DO, ובתוך כל אחד מששת הניסויים, כדי להתוות את מספר השכיבות אל מול רמת ה-DO. בניסויים אלו, רק ריכוז ה-DO השפיע באופן מובהק על מספר השכיבות שביצעו זבובים האבן, ללא משתנה או אינטראקציה אחרים, ובכך הוא הוכח כמנבא מובהק של מספר השכיבות.
ברגע ששולטים בטכניקה זו, ניתן לשחזר אותה כדי לעמוד ביעדים ספציפיים שהגדיר החוקר. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להימנע משינויים בטמפרטורה, שכן אלה עלולים להוביל לשינויים ב-DO. באמצעות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון כאלה שישנו את ה-PH, כדי להשיב על שאלות נוספות בנוגע להשפעות ה-PH וה-DO על אורגניזמים מימיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו מסוגלים לבצע מניפולציה של חמצן מומס בסביבת מעבדה עבור מספר ניסויי התנהגות בעלי חיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט וניתן לשחזור למניפולציה של תנאי חמצן מומס בסביבת מעבדה לצורך מחקרי התנהגות בעלי חיים. שיטה זו מאפשרת התבוננות בתגובות התנהגותיות של בעלי חיים מימיים הן בסביבות הוראה והן בסביבות מחקר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- התנהגות בעלי חיים
- אקולוגיה מימית
- פרוטוקולים מעבדתיים
רקע
- רמות החמצן המומס הן קריטיות עבור חיים מימיים.
- הבנת תגובות בעלי חיים לשינויים ברמות החמצן חיונית למחקרים אקולוגיים.
- ניתן להחיל פרוטוקול זה על מינים שונים, כולל חסרי חולבתיים גדולים, דגים ודו-חיים.
- הוא מתאים הן למטרות חינוכיות והן למטרות מחקר.
מטרת המחקר
- להערכת תגובות של אורגניזמים לשינויים בריכוז החמצן המומס.
- לספק שיטה הניתנת לשחזור לחקר התנהגות של בעלי חיים מימיים.
- לאפשר למידה מעשית בסביבת מעבדה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מניפולציה הדרגתית של תנאי חמצן מומס.
- שימוש בפרוטוקולי רשת דליייה (kick net) סטנדרטיים לאיסוף אורגניזמים מימיים.
- תצפית על תגובות התנהגותיות בסביבה מבוקרת.
- יישום הן במסגרת לימודית בכיתה והן במסגרת מחקרית.
תוצאות עיקריות
- שליטה מוצלחת ברמות החמצן המומס.
- שינויים התנהגותיים ניתנים לצפייה במינים מימי שנאספו.
- הפרוטוקול הוכיח יעילות עבור ניסויי התנהגות שונים בבעלי חיים.
- היתכנות לשימוש חינוכי במעבדות הוראה.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק כלי בעל ערך לחקר התנהגות של בעלי חיים מימיים.
- ניתן להתאימו למגוון מינים ולשאלות מחקר שונות.
- מעודד מעורבות בחקירה מדעית במסגרות חינוכיות.
שאלות נשאלות שכיחוק
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
פרוטוקול זה מאפשר מניפולציה מבוקרת של חמצן מומס לצורך חקר תגובות התנהגותיות באורגניזמים מימיים, ותומך בתיקוף מטרות בנורו-פרמקולוגיה ובטוקסיקולוגיה סביבתית. באמצעות אספקת שיטה הניתנת לשחזור להשראת תנאי היפוקסיה או אנוקסיה, הוא מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים של תרכובות המשפיעות על מסלולי חישה של חמצן. הגישה ניתנת להרחבה, ממעבדות הוראה ועד לסריקה בתוספת גבוהה, ומספקת ערך ניבוי עבור פנוטיפים התנהגותיים הקשורים לזמינות החמצן.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות הקשורות למסלולי הגורם המושרה להיפוקסיה (HIF) ואיתות תלוי חמצן.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות המעורבות בהומאוסטזיס של חמצן ובהסתגלות התנהגותית.
- ערך ניבוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי קישור השפעות של תרכובות לשינויים התנהגותיים ניתנים לצפייה תחת רמות DO מבוקרות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף לסריקת תגובה למספר (dose-response) של תרכובות המשפיעות על ניצול חמצן.
- ערך תפעולי: הבטחת סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות בקרת DO יציבה במהלך חלונות תצפית של 5 דקות.
- ערך ניבוי: אספקת נתונים התנהגותיים כמותיים (למשל, תדירות שכיבות סמיכה) להערכה אמינה של תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תואם למודלים רלוונטיים למחלות של איסכמיה, שבץ או הפרעות מטבוליות שבהן מתח החמצן משתנה.
- ערך תפעולי: מקל על הרציפות מסינון התנהגותי לתיקוף פרה-קליני באמצעות מניפולציה עקבית של DO.
- ערך ניבוי: תומך בקידום מותאם סיכון על ידי זיהוי תרכובות המווסתות התנהגויות הרגישות לחמצן.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות של מטרות ועד לזיהוי תרכובות מובילות (leads), ובמיוחד עבור תרכובות המכוונות למנגנוני חישוש לחמצן.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ביולוגיים על ידי בידוד החמצן כמשתנה בלתי תלוי במבחנים התנהגותיים.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור במהלך תקופות תצפית קצרות, מה שמאפשר סריקה בקיבולת בינונית.
- אנליטיקה: מספקת משתנים תלויים מדידים (למשל, תדירות תנועה) המתואמים עם ריכוז ה-DO לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשרת למודלים פרה-קליניים שבהם מודולציית חמצן מספקת מידע על יעילות טיפולית בתנאי היפוקסיה.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה מודולרית וניתנת להרחבה, שניתן ליישם בפרויקטים מרובים החוקרים פנוטיפים רגישים לחמצן.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי על ידי הפחתת משתנים מתבלבלים במחקרים התנהגותיים הקשורים לחמצן.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור ויציבות של רמות DO לצורך ניסויים עקביים בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי הבהרת קשרים מכניסטיים בין רמות החמצן לתוצאות פנוטיפיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מבוסס סיכונים של תרכובות המכוונות ל-HIF, PHD או למסלולי חישה של חמצן.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול באורגניזמים מימי ובניטור חמצן מומס.
- נדרשות מערכות בקרת גזים (חנקן/אוויר), בקבוקים אטומים וגששי DO למניפולציה מדויקת.
- נדרש סטנדרטיזציה של נפח המים, הטמפרטורה וצפיפות האורגניזמים בין החזרות.
- חלונות התצפית מוגבלים לפחות מ-5 דקות עקב סטיות תרמיות וחוסר יציבות של ה-DO מעבר לנקודה זו.
- התאמה למודלים של חולייתנים עשויה לדרוש התאמות בגודל התא ובנקודות קצה התנהגותיות.
