זיהום בדרכי השתן במודל בעלי חיים קטנים: צנתור-Transurethral של זכר ונקבה עכברים

המטרה הכוללת של גישה ניסויית זו היא לחקור את התגובה החיסונית לזיהום בדרכי השתן, ולמנוע השוואה ישירה בין בעלי חיים זכרים ונקבות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח של אימונולוגיה רירית הקשורות לאופן שבו זכרים ונקבות מגיבים לדלקת בדרכי השתן. היתרון העיקרי הוא שהזיהום נוצר באמצעות השורש הטבעי.

לראשונה עלה לנו הרעיון לשיטה זו לאחר שציינו באיזו תדירות נאמר, כי התקנת שלפוחית השתן של העכברים הזכרים אינה אפשרית. למרות ששיטה זו תספק תובנה לגבי זיהום בדרכי השתן, ניתן ליישם אותה גם במחקרי מחלות אחרים, כגון סרטן שלפוחית השתן. כדי להתחיל, הכינו צינורית גישה תוך-ורידית אחת לילדים לכל קבוצת עכברים שתידבק.

באמצעות מנגנון הקפיץ המובנה, הסר כל צינורית מהמחט שלה לפי הוראות היצרן. השליכו את המחטים, ושמרו רק על הצינורית התוך-ורידית מפלסטיק. עקר את הצנתרים במכסה זרימה למינרי למשך מחזור UV אחד של כ-25 עד 30 דקות.

לאחר תרבית לילה של אי קולי אורופתוגני, או UPEC, על פי פרוטוקול הטקסט, סובב את תרחיף החיידקים במיקרו-צנטריפוגה שולחנית ב-17,000 פעמים גרם למשך דקה אחת, והשהה מחדש את כדור החיידקים שנוצר ב-2 כפול 10 עד ה-CFU השמיני למיליליטר ב-PBS. יש לדלל באופן סדרתי כמות גדולה של תרחיף, ולפלוט על אגר LB עם אנטיביוטיקה במידת הצורך, כדי לקבוע את החיסון המדויק לכל זיהום. משוך את החיסון החיידקי למזרק של מיליליטר אחד, והצמד את הקטטר לקצה המזרק.

הקש על המזרק כדי להוציא אוויר, ולחץ על הבוכנה כדי למלא את חלל האוויר המת בצנתר לפני תחילת ההחדרה. לאחר הרדמת עכברה על פי פרוטוקול מאושר, הניחו את החיה על הבטן, והפעילו לחץ בינוני על הבטן התחתונה כדי לרוקן את שלפוחית השתן משתן. שלפוחית השתן המלאה מרגישה כמו אפונה מתחת לעור, בין פסגות הכסל.

כאשר שלפוחית השתן ריקה, בעזרת היד הלא דומיננטית, הניחו את האגודל על הזנב ואצבע של אותה היד על בטן העכבר, והפעילו לחץ עדין בכיוונים מנוגדים כדי להחזיק את העכבר בחוזקה במקומו. לאחר מכן, הנח את קצה הקטטר בניצב לעכבר בפתח השופכה, ולאחר מכן, בלחץ עדין, החלק את הקטטר לתוך השופכה עד שהרכזת פוגשת את פתח השופכה, ובמקביל הורד את המזרק כך שיהיה מקביל למשטח העבודה. לאחר שהקטטר נמצא במקומו, השתמש באצבע מהיד הלא דומיננטית המונחת על בטן העכבר כדי למשוך בעדינות רבה את עור הבטן לכיוון ראש העכבר.

שימו לב שפתח השופכה לא יזוז. עם זאת, אם הצנתרים נמצאים בנרתיק, הרקמה תנוע למעלה והרחק מהקטטר. כאשר רכזת הקטטר כנגד פתח השופכה, יש להוציא לאט 15 מיקרוליטר של החיסון החיידקי.

קצב התקנה איטי ממזער ריפלוקס שלפוחית השתן לכליה. הסר לאט את הקטטר כדי למנוע דליפה. לאחר מכן הניחו את החיה בכלוב שלה במצב שכיבה.

כדי לחסן עכברים זכרים, הנח שני מלקחיים באגודל בצורה גולגולתית וזנבית לאיברי המין החיצוניים של העכברים. החזר את הקדם כדי לחשוף את איבר המין של הבלוטה במלואו. לאחר מכן, לאחר שהפין ממוקם חיצונית, שחרר את מלקחיים האגודל.

מקם מחדש את המלקחיים כדי לייצב את הפין הבולט בניצב לבעל החיים, החזק את האיבר בעדינות אך מתוח. לאחר מכן דרך הפתח הקטן בקצה בשר השופכה, הכניסו בזהירות את הקטטר והובילו אותו בעדינות לתוך הפין באמצעות מלקחיים כדי לשמור בעדינות על מתח. ברגע שרכזת הצנתרים פוגשת את קצה הפין, יש להוציא לאט מאוד 50 מיקרוליטר מהחיסון, תוך שמירה על מיקום הפין.

שימו לב לאיכות ההחדרה על פי ציון איכות החדרה שנקבע מראש, כמו זה שמוצג כאן. החזר את הקטטר לאט במשך חמש שניות כדי למנוע דליפה של החיסון. הנח את העכבר בכלוב שלו במצב שכיבה.

בעל החיים אמור להתחיל להתאושש 30 עד 45 דקות לאחר מתן חומר ההרדמה. לאחר הקרבת עכברים על פי פרוטוקול מאושר, השתמש ב-70% אפינל כדי להרטיב את הבטן ביסודיות כדי למזער את הזיהום על ידי הפרווה. בעזרת מספריים, בצע חתך של שני סנטימטרים על פני השליש התחתון של בטן העכברים, והסר באופן אספטי את שלפוחית השתן וכל איבר רצוי אחר.

העבירו את האיברים לתוך צינורות פוליפרופילן בנפח חמישה מיליליטר, המכילים מיליליטר אחד של PBS סטרילי ושמרו את כל הדגימות על קרח. בעזרת הומוגנייזר כף יד, הומוגניזציה של האיברים עד שכמעט ולא נותרה רקמה מוצקה. השליכו כל רקמת שומן מבריקה בצבע בז'-לבן שאינה הומוגנית היטב.

לאחר מכן, השתמש ב-Epinal, ואחריו PBS כדי לשטוף את ההומוגנייזר בין כל קבוצת ניסוי או איברים. לאחר הכנת דילולים סדרתיים של תרחיף איברים הומוגניים, דילול צלחות על צלחות אגר LB, עם אנטיביוטיקה במידת הצורך, ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי לבצע ציטומטריית זרימה על רקמת שלפוחית השתן, לאחר בידוד שלפוחית השתן כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה, השתמש במספריים כדי לטחון היטב את הרקמה.

הוסף שלפוחית טחון אחת לכל צינור המכיל מאגר עיכול. לאחר מכן יש לנער את הצינור כדי לשטוף את הרקמה הטחונה במאגר העיכול, ולשמור אותו על קרח עד שכל שלפוחית השתן מנותחת ונטחנת. דגרו על שלפוחית השתן הטחונה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, למשך 60 עד 75 דקות עם ניעור נמרץ ביד למשך חמש שניות, כל 15 דקות.

כאשר לרקמה יש מראה שקוף זכוכית הדומה לנייר טישו רטוב, העיכול הושלם. השבת את אנזימי העיכול על ידי הוספת שניים עד שלושה מיליליטר של מאגר ציטומטריה בזרימה קרה כקרח, וערבב בעדינות. לאחר מכן הניחו את הצינורות על קרח.

כדי להבטיח תרחיף של תא בודד, וכדי להסיר כל רקמת חיבור, העבירו את תכולת הצינור דרך מסנן של 100 מיקרומטר המונח בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן, עם קצה בוכנת מזרק, לחץ בעדינות על כל הרקמה שנותרה דרך המסנן. שטפו את המסנן עם שני מיליליטר נוספים של מאגר ציטומטריית זרימה, ושמרו את הדגימות על קרח.

יש לשטוף את הדגימות בצנטריפוגה בטמפרטורה של 200 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס, למשך שבע דקות. השעו מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטר של מאגר ציטומטריית זרימה המכיל בלוק Fc, מדולל לחמישה מיקרוגרם למיליליטר, והעבירו לצלחת תחתונה עגולה של 96 באר. לאחר 10 עד 15 דקות מוסיפים 100 מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים הרצוי לכל דגימה.

לאחר מכן דגרו את הדגימות על קרח מוגן מאור למשך 30 עד 45 דקות. שוטפים את הדגימות על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 200 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך שבע דקות. לבסוף, השעו מחדש את כדורי התא ב-200 מיקרוליטר של מאגר זרימה ציטומטרית, והעבירו את הדגימות דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר על צינור פוליסטירן של חמישה מיליליטר, ממש לפני הרכישה על ציטומטר זרימה.

איור זה מציג נתונים מייצגים של עכברים שנדבקו במשך 24 שעות. עומס החיידקים היה שווה ערך בין עכברים זכרים ונקבות 24 שעות לאחר ההדבקה. כדי לקבוע אם אובדן החיסון בזמן ההדבקה השפיע על התבססות ההדבקה, כל הזרקה קיבלה ציון בסולם של 1 עד 5, כאשר אחד היה האופטימלי ביותר.

קולוניזציה של חיידקים נקבעה 24 שעות לאחר ההדבקה. לא נמצאו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין ה-CFU שהתקבלו מבעלי חיים עם ציוני החדרה שונים כפי שהוערכו על ידי מבחן Kruskal-Wallis לא פרמטרי, המשווה את הדירוג הממוצע של כל עמודה עם הדירוג הממוצע של כל עמודה אחרת, ותיקון השוואות מרובות באמצעות מבחן דאן. ניתן להסיק כי החדרות לא אופטימליות, וכתוצאה מכך דליפה משמעותית של חיסון חיידקי במהלך ההדבקה, אינן משפיעות באופן משמעותי על קולוניזציה של חיידקים לאחר 24 שעות.

חשוב לציין, תדירות ההחדרה הלא אופטימלית תפחת עם התרגול. לבסוף, בעוד שמספר תאי החיסון החיוביים ל-CD45, הקיימים בבעלי חיים נאיביים, לא היה שונה בין עכברים נקבות לזכרים, הייתה עלייה מובהקת סטטיסטית בחדירה לשלפוחית השתן של עכברים נקבות נגועות. בזמן ניסיון צנתור, חשוב להשתמש בתנועות איטיות ועדינות.

עם התפתחותה, הטכניקה הזו סייעה לנו לחקור הבדלים מבוססי מין בחסינות בשלפוחית השתן של חיות זכרים ונקבות.