מגן היעילות ריאתי החיסונית בתגובה תת עורי ואת אפי BCG מינהל עכברים

אנו מפרטים כאן את המתודולוגיה שננקטה כדי להשוות את יעילות ההגנה והתגובה החיסונית של הריאות הנגרמת על ידי חיסון תוך-אף ותת עורי עם BCG במודל עכבר. התוצאות שלנו מראות את היתרונות של חיסון ריאתי ומצביעות על תפקיד לתגובה בתיווך IL17 בהגנה הנגרמת על ידי חיסון.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את התגובות החיסוניות בריאות לאחר חיסון נגד שחפת, כולל יעילות ההגנה של החיסון מפני אתגר תוך-אף והתגובה החיסונית המקומית של הריאות הנגרמת על ידי החיסון. מתודולוגיה זו יכולה לעזור לענות על שאלות המפתח שלנו בחיסון נגד שחפת, כולל זיהוי התגובות החיסוניות ההגנתיות של הריאות שנקבעו על ידי חיסוני ריאות להגנה אופטימלית על מערכת החיסון של הריאות. אחד היתרונות של מתודולוגיה זו הוא שהתגובה החיסונית של הריאות מבעל החיים שלה מוערכת באופן אינדיבידואלי במקביל ליעילות ההגנה.

המאפשר זיהוי של הפרמטרים החיסוניים הספציפיים הקשורים להגנה. למתן תת עורי של חיסון BCG, ראשית, יש למלא מזרק מיליליטר אחד המצויד במחט 26 עם מיליליטר אחד של תרחיף החיסון BCG, ולהסיר את בועות האוויר. לאחר מכן הניחו עכבר מורדם במצב שכיבה בתוך מכסה המנוע של הזרימה הלמינארית, וחסנו את החיה באופן תת עורי ב-100 מיקרוליטר חיידקים באגף האחורי.

למתן תוך-אף, טען מיקרו-פיפטה עם 20 מיקרוליטר של תרחיף ה-BCG, והנח את העכבר המורדם במצב שכיבה בתוך מכסה המנוע. יש לתת את החיסון בטיפה בין שני הנחיריים עד להפקדת כל נפח 20 המיקרוליטר, ולהשאיר זמן בין הטיפות כדי לאפשר לעכבר לשאוף את התרחיף. לאחר מכן, טען מחדש את המיקרו-פיפטה עם עוד 20 מיקרוליטר חיידקים וחזור על הניהול.

לאתגר תוך-אף עם זן המיקרובקטריום טוברקולוזיס H37Rv, בנקודת הזמן הניסוי המתאימה לאחר החיסון, יש לחסן את בעלי החיים במתן תוך-אף של 40 מיקרוליטר של תרחיף חיידקי H37Rv כפי שהודגם זה עתה. כדי לרכוש את שטיפת הסימפונות או דגימת הכדור, השתמש תחילה במלקחיים סטריליים ובמספריים כדי לחשוף את קנה הנשימה. לאחר מכן בצע חתך קטן בקנה הנשימה, הקפד לא לכרות את הרקמה לחלוטין, והכנס צינורית המחוברת למזרק סטרילי של 1 מ"ל, המכיל 800 מיקרוליטר PBS קר כקרח.

כאשר הצינורית במקומה, מלאו בזהירות את הריאות ב-PBS, ולאחר מכן משכו לאט לאט את הבוכנה כדי להחזיר לפחות 500 עד 600 מיקרוליטר של נוזל שטיפה. הוציאו את הכדור לתוך צינור של 1.5 מ"ל על קרח, וודאו שהמתלה חסר צבע, מה שמעיד על חוסר זיהום בדם. אחסן דגימות על קרח עד לעיבוד הכדור.

כדי לקבוע את העומס החיידקי והתגובה החיסונית בריאות, קבע את העכבר עם מחטים במצב שכיבה על משטח שטוח ומחוטא בתוך מכסה הזרימה הלמינרית, ובצע חתך בעור העליון מעל החזה. לאחר מכן, מקלפים את העור כדי לחשוף את אזור בית החזה, וחותכים את הריאות. השתמש במספריים ובמלקחיים סטריליים כדי לקצור את הריאות והלב, ולהניח את האיברים על משטח נקי.

לאחר מכן, הסר את הלב, קנה הנשימה ורקמת החיבור. הנח כל ריאה בצינור אחר של 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל מים נטולי יונים על קרח לקביעת עומס חיידקים ותגובות חיסוניות תאיות. בהשוואה לדרך התת עורית, מסלול החיסון התוך-אף מעניק יעילות הגנה הרבה יותר גדולה בריאות.

ניתוח של מספר מייצג של מושבות מקבוצת החיסון התוך-אף BCG על ידי PCR ספציפי לאזור הגנום RD9 מדגים כי כל המושבות מספקות מקטע של 0.4 קילו-זוגות בסיסים התואמים ל-H37Rv. BCG תוך-אף מעורר IL17 גבוה יותר ומפריע לייצור גמא בריאות, וחושף מתאם בין יעילות ההגנה המוענקת על ידי חיסון BCG תוך-אף לבין התגובה החיסונית המושרה על ידי החיסון בריאות לפני האתגר עם ריכוז גבוה יותר של ריכוז ה-IgA הספציפי לנגזרת החלבון המטוהר H37Rv בדגימות השטיפה שנצפו עבור מקבלי החיסון התוך-אף. ניתוח נוסף של תאים מייצרי ציטוקינים בריאות בעקבות אתגר השחפת גילה כי בעוד שהפרעה לתאים מייצרי גמא זוהתה בכל הקבוצות הנגועות, תאי IL17A המייצרים CD4+ נמצאו רק בקבוצת ה-BCG התוך-אף, מה שמדגים מתאם מובהק בין נוכחות IL17 להפחתת העומס על חיידקי הריאות.

בעקבות הליך זה, ניתן להשוות את התגובות החיסוניות המקומיות של הריאות בשימוש בחיסוני שחפת מגוונים ביולוגית, כמו גם דרכי מתן שונות ונקודות זמן לאחר אתגר. בנוסף, ניתן להשתמש במתודולוגיה זו כדי להעריך את החיסון בשימוש על ידי חיסון לאחר אתגר. מה שיכול לאפשר זיהוי של התגובות החיסוניות המתואמות עם הגנה.

חשוב לציין, עבודה עם מיקובקטריום שחפת דורשת מתקני מעבדה נטולי BCL, ותמיד יש לנקוט באמצעי הזהירות המתאימים בעת ביצוע הליך זה.