מדידה כמותית של רמות חומצה רטינואית יחסית ב E8.5 עוברים neurosphere תרבויות באמצעות assay Reporter F9 נדיר- lacZ מבוססי תאים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד באופן כמותי רמות יחסיות של retinoic acid בדגימות רקמה, כגון עוברי עכבר בשלב E8.5 או תרביות של נוירוספירות ממבוגרים, באמצעות מערך דשייר (reporter assay) מבוסס תאים. בעוד שנתיב השביעות של RA מאופיין היטב, מדידה היסטולוגית ישירה של RA אינה khảשימה מבחינה טכנית. מערך זה יכול לסייע במענה על שאלות מפתח בנוגע לאופן שבו מוטציות גנטיות יכולות להשפיע על רמות RA.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא רגישה ורב-גונית מאוד, עם יכולת למדוד טווח רחב של ריכוזי RA במגוון דגימות רקמה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה ישירה לקביעת רמות RA בדגימות רקמה שונות, ניתן ליישם אותה גם במחקרים אחרים, כגון קביעת הנוכחות או ההיעדרות של אנזימי מטבוליזם של RA על ידי ניטור שינויים ברמות ה-RA. לפני תחילת הניסויים, יש לבדוק את תגובת תאי F9 RARE-LacZ ל-RA. הוסף 1 nanomolar של all-trans RA לתאי F9 RARE-LacZ שהועלו לפלטה בעלת 96 בארות.

לאחר מכן, הדגרירו את הפלטה, וגדלו בתרבית בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. למחרת, בצעו צביעת LacZ ובדקו את התאים לנוכחות משק כחול. אם הצבע אינו אחיד בכל התאים, המשיכו לביצוע סב-קלון (subclone) של התאים.

חלקו את התרביות שנבחרו לצלחונות בני 10 סנטימטר בריכוז של 100,000 תאים ל-10 מיליליטר. לאחר יומיים של גידול, הכינו פלטה בעלת 24 בארות עם 500 מיקרוליטר של ג'לטין 0.2% לכל בארה, והניחו לפלטה לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסירו את הג'לטין ושטפו את הבארות פעמיים עם 500 מיקרוליטר של מים מזוקקים.

כעת, הוסיפו 500 microliters של מדיום תרבית תאים F9 RARE-LacZ לבארות. לאחר מכן, בחרו מושבות של תאי F9 באמצעות טיפ פפית P10 סטרילי והעבירו כל אחת לבארה אחת. לאחר שלושה או ארבעה ימי תרבית, פצלו את המושבות לשתי פלטות בעלות 24 בארות מצופות ג'לטין, אחת לבדיקה והשנייה להתרחבות.

לאחר יומיים נוספים של תרבית, הוסף 1 nanomolar של RA לכל באר בלוח אחד בעל 24 בארות והגדל את התרבית למשך הלילה. למחרת, בצע צביעת LacZ כדי לבדוק מגיבים גבוהים והרחב את התרבית המתאימה. יום אחד לפני קצירת העוברים בשלב E8.5 או פירוק הנוירוספירות, צפה לוח בעל 96 בארות ב-100 µL של ג'לטין בריכוז 0.2% לכל באר, והשאר את הלוח למשך 30 דקות.

לאחר מכן, שאבו את הג'לטין ושטפו את הבארים פעמיים עם 200 µl של מים מזוקקים. לאחר מכן, בצעו טריפסינציה לתאי F9 RARE-LacZ שנבחרו, המטופחים בצלחות של 10 סנטימטר. לאחר מכן, זרעו 100,000 תאים לכל באר בלוח 96-בארים תוך שימוש במצע גידול ללא G418.

מלאו מספיק בארות לתרבית משותפת (co-culture) של כל עובר, או הכינו שלוש בארות לכל גנוטיפ אם אתם עובדים עם נוירוספירות (neurospheres). הכינו בנוסף 24 בארות עבור עקומת הסטנדרט. לאחר מכן, דגרו את הפלטה למשך 24 שעות.

לצורך תרבית משותפת של תאים עובריים, התחילו בניתוח של עוברים בשלב E8.5. לאחר מכן, מלאו מבחנה חדשה בנפח 1.5 מיליליטר ב-10 מיקרוליטר של trypsin, ובעזרת טיפ פואט P20 בעל פיה רחבה, העבירו את העובר השלם למבחנה והניחו את המבחנה על קרח. לאחר בידוד כל העוברים, דגרו את כל המבחנות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לפרק את הרקמות.

לאחר חמש דקות, בצעו טריטורציה (ערבוב על ידי פי펫ה) עדינה של תכולת כל מבחנה באמצעות טיפ של פי펫ה P20, והעבירו 10 µL לבאר בלוח 96-בארים שהוכן עם תאי F9 RARE-LacZ. דגרו את הלוח למשך לילה. עבור תרביות משותפות (co-cultures) של נוירוספרות, התחילו בהעברת תרבית נוירוספרות למבחנות של 15 ml.

סובב את המבחנות ב-200 g's למשך 10 דקות, והסר את כל הנוזל העליון (supernatant) למעט מיליליטר אחד. לאחר מכן, בצע טריטורציה (trituration) של התוכן באמצעות פיפט P1000. כעת, השתמש בנפח קטן כדי לקבוע את צפיפות התאים המופרדים.

לאחר מכן, זרע 100,000 תאי נוירוספירה מופרדים מעל תאי F9 RARE-LacZ. טען שלוש באערות עבור כל סוג של תרבית נוירוספירה. כעת, ודא כי הבאערות עבור עקומת הסטנדרט מוכנות.

הוסיפו בשלוש חזרות 100 microliters של תמיסות all-trans RA שהוכנו בדילול סדרתי בשבעה ריכוזים שונים בתוך מצע גידול F9 RARE-LacZ. כללו בקרות שליליות של תאים לא מטופלים. לבסוף, דגרו את פלטת 96 הבארים המלאה למשך לילה.

ביום למחרת, הסירו את המצע וקבעו את התרביות באמצעות 100 µL של 2.5% glutaraldehyde לכל באר. הניחו לפלטה להדגר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, הסירו את המקבע ושטפו את הבארה פעמיים עם 200 µL של PBS למשך 10 דקות לכל שטיפה.

בשלב הבא, שטפו את הבארים שלוש פעמים עם 200 microliters של תמיסת שטיפה LacZ למשך 10 דקות לכל שטיפה. במהלך השטיפה השלישית, הכינו את תמיסת הצביעה X-gal במבחנה של 15 milliliter עטופה בנייר אלומיניום. כמו כן, הכינו תא לח למגש ה-96-well.

כעת, הוסיפו 200 µL של תמיסת צביעת X-gal לכל באר. הניחו את הפלטה בתוך תא לחות, והדגירו בטמפרטורה של 37 °C. לאחר ההדגרה, הסירו את תמיסת צביעת ה-LacZ והחליפו אותה ב-200 µL של PBS.

לאחר מכן, מדדו את הבליעה באורך גל של 610 nanometers, וצלמו את הפלטה. שורת תאי הדגם F9 RARE-LacZ מורכבת מתאי קרצינומה עובריים הדבקים המגיבים באופן כמותי ל-RA באמצעות השראה פרופורציונלית של beta-galactosidase. לתאים אלו יש גם מורפולוגיה אפיתליאלית.

על אף תרבית תחת סלקציה של G418, התגובה של תאים אלו ל-RA תיחלש לאחר מספר מעברים. לכן, נדרש ביצוע סב-שיבוט (subcloning) תקופתי כדי להבטיח תגובה חזקה ואחידה ל-RA. עוברי E8.5 הומוזיגוטים למוטציה vl ב-Gpr161 צפויים להראות ירידה באותיות RA עובריות. ציפייה זו אוששה באמצעות בדיקת התרבית המשולבת (co-culture assay) המתוארת של עוברי מפורקים עם תאי F9 RARE-LacZ.

שימוש בתרבית משותפת של נוירוספירות מבוגרות מסוג פראי (wild-type) עם תאי F9 RARE-LacZ שימש גם לבדיקת נוכחות RA בתרביות נוירוספירות. עלייה בעוצמת הצביעה, בהשוואה לתאי שלב E8.5, עשויה לנבוע מההומוגניות של תרביות הנוירוספירות. באמצעות יצירת עקומת סטנדרט לרמות RA, ניתן היה לכמת את רמת ה-RA בתרביות נוירוספירות מסוג פראי ובעוברים בשלב E8.5.

בעת ביצוע הליך זה, זכרו לשמר באמצעות סוב-קלונינג (subcloning) תקופתי תאי F9 RARE-LacZ המגיבים בעוצמה ל-RA. כמו כן, הקפידו להפריד (dissociate) את הדגימה ביסודיות כדי לאפשר פיזור הומוגני ומדידה עקבית של RA. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לחקור את השפעתן של מוטציות גנטיות על רמות ה-RA, ולאחר מכן ניתן לבצע שיטות אחרות כדי לבדוק אילו מרכיבים במסלול האיתות של RA הושפעו באופן ישיר.