Name: מדידה כמותית של רמות חומצה רטינואית יחסית ב E8.5 עוברים neurosphere תרבויות באמצעות assay Reporter F9 נדיר- lacZ מבוססי תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: למד מדידה כמותית של רמות חומצה רטינואית בעוברי עכברים E8.5 ותרבויות נוירוספיר באמצעות assay תאי דיווח F9 RARE-lacZ. שיטה רגישה זו מאפשרת הערכת ריכוזי RA במגוון רחב של דגימות רקמה וחקר השפעת מוטציות גנטיות על תהליכי התפתחות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד"ר מייקל וגנר (המרכז הרפואי SUNY Downstate) ולבן ת'יד (מעבדת ד"ר ג'ף קורווין, אוניברסיטת וירג'יניה) על שסיפקו לנו את תאי F9 RARE-LacZ והתמיכה הטכנית. מחקר זה ממומן על ידי ועדת ניו ג'רזי לחקר חוט השדרה (NJCSCR) (מספר מענק: 10-3092-SCR-E-0) והוועדה של ניו ג'רזי לחקר פגיעות מוח (NJCBIR) (מספר מענק: CBIR13FEL006).

<ol><li>Vilhais-Neto, G. C., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid.</a> Curr Biol. 18 (5), R191-R192 (2008).</li>
<li>Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+in+the+functioning+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signalling%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling in the functioning brain.</a> Science Signalling. 324, 1-3 (2006).</li>
<li>Lane, M. A., Bailey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+retinoid+signalling+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Role of retinoid signalling in the adult brain.</a> Prog Neurobiol. 75 (4), 275-293 (2005).</li>
<li>Maden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+signalling+in+the+development+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retinoid signalling in the development of the central nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 3 (11), 843-853 (2002).</li>
<li>Maden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoids+and+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Retinoids and spinal cord development.</a> J Neurobiol. 66 (7), 726-738 (2006).</li>
<li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signalling+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li>
<li>Ang, H. L., Deltour, L., Hayamizu, T. F., Zgombic-Knight, M., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+synthesis+in+mouse+embryos+during+gastrulation+and+craniofacial+development+linked+to+class+IV+alcohol+dehydrogenase+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid synthesis in mouse embryos during gastrulation and craniofacial development linked to class IV alcohol dehydrogenase gene expression.</a> J Biol Chem. 271 (16), 9526-9534 (1996).</li>
<li>Ang, H. L., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+premature+retinoic+acid+synthesis+in+Xenopus+embryos+following+premature+expression+of+aldehyde+dehydrogenase+ALDH1%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stimulation of premature retinoic acid synthesis in Xenopus embryos following premature expression of aldehyde dehydrogenase ALDH1.</a> Eur J Biochem. 260, 227-234 (1999).</li>
<li>Bastien, J., Rochette-Egly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+retinoid+receptors+and+the+transcription+of+retinoid-target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nuclear retinoid receptors and the transcription of retinoid-target genes.</a> Gene. 328, 1-16 (2004).</li>
<li>Chatzi, C., Cunningham, T. J., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+retinoic+acid+function+during+embryonic+brain+development+using+retinaldehyde-rescued+Rdh10+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Investigation of retinoic acid function during embryonic brain development using retinaldehyde-rescued Rdh10 knockout mice.</a> Dev Dyn. 242 (9), 1056-1065 (2013).</li>
<li>Sakai, Y., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+retinoic+acid+catabolism+with+reporter+systems+and+by+in+situ+hybridization+for+CYP26+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of retinoic acid catabolism with reporter systems and by in situ hybridization for CYP26 enzymes.</a> Methods Mol Biol. 652, 277-294 (2010).</li>
<li>Yamamoto, M., Drager, U. C., McCaffery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+retinoic+acid+catabolic+enzymes+shows+high+expression+in+the+developing+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">A novel assay for retinoic acid catabolic enzymes shows high expression in the developing hindbrain.</a> Dev Biol Res. 107, 103-111 (1998).</li>
<li>Rossant, J., Zirngibl, R., Cado, D., Shago, M., Giguere, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+retinoic+acid+response+element-hsplacZ+transgene+defines+specific+domains+of+transcriptional+activity+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of a retinoic acid response element-hsplacZ transgene defines specific domains of transcriptional activity during mouse embryogenesis.</a> Genes & Dev. 5, 1333-1344 (1991).</li>
<li>Wagner, M., Han, B., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+differences+in+retinoid+release+from+embryonic+neural+tissue+detected+by+an+in+vitro+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regional differences in retinoid release from embryonic neural tissue detected by an in vitro reporter assay.</a> Development. 116, 55-66 (1992).</li>
<li>Luo, T., Wagner, E., Crandall, J. E., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinoic-acid+critical+period+in+the+early+postnatal+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A retinoic-acid critical period in the early postnatal mouse brain.</a> Biol Psychiatry. 56 (12), 971-980 (2004).</li>
<li>Luo, T., Wagner, E., Grun, F., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+in+the+brain+marks+formation+of+optic+projections%2C+maturation+of+the+dorsal+telencephalon%2C+and+function+of+limbic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling in the brain marks formation of optic projections, maturation of the dorsal telencephalon, and function of limbic sites.</a> J Comp Neurol. 470 (3), 297-316 (2004).</li>
<li>Kelley, M. W., Xu, X. M., Wagner, M. A., Warchol, M. E., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developing+organ+of+Corti+contains+retinoic+acid+and+forms+supernumerary+hair+cells+in+response+to+exogenous+retinoic+acid+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The developing organ of Corti contains retinoic acid and forms supernumerary hair cells in response to exogenous retinoic acid in culture.</a> Development. 119, 1041-1053 (1993).</li>
<li>McCaffery, P., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+spots+of+retinoic+acid+synthesis+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Hot spots of retinoic acid synthesis in the developing spinal cord.</a> Proc Natl Acad Sci. 91, 7194-7197 (1994).</li>
<li>Hu, L., Gudas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+analogs+and+retinoic+acid+influence+the+expression+of+retinoic+acid+receptor+alpha%2C+beta%2C+and+gamma+mRNAs+in+F9+teratocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP analogs and retinoic acid influence the expression of retinoic acid receptor alpha, beta, and gamma mRNAs in F9 teratocarcinoma cells.</a> Mol Cell Biol. 10 (1), 391-396 (1990).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratocarcinomas+and+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis.</a> Science. 209 (4458), 768-776 (1980).</li>
<li>Strickland, S., Mahdavi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+differentiation+in+teratocarcinoma+stem+cells+by+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The induction of differentiation in teratocarcinoma stem cells by retinoic acid.</a> Cell. 15 (2), 393-403 (1978).</li>
<li>Li, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+GPCR%2C+Gpr161%2C+regulates+the+retinoic+acid+and+canonical+Wnt+pathways+during+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The orphan GPCR, Gpr161, regulates the retinoic acid and canonical Wnt pathways during neurulation.</a> Dev Biol. 402 (1), 17-31 (2015).</li>
<li>Hogan, B., Constantini, F., Lacy, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHogan%2C+B+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , 1st, Cold Spring Harbor Laboratory. (1986).</li>
<li>Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+expansion%2C+and+differentiation+of+adult+Mammalian+neural+stem+and+progenitor+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay.</a> Methods Mol Biol. 549, 91-101 (2009).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השורה תא F9 נדיר- LacZ 14 היא מערכת רבת עוצמה, שניתן להשתמש בהם לצורך זיהוי של RA המיוצר על ידי explants רקמות 12,14,17,18. הוא רגיש לריכוזי RA נמוכים כמו 100 FM, ללא תגובה שאינה ספציפית זוהתה בתאים שלא טופלו עם 12,14,18 RA. יתר על כן, תאי הכתב להגיב לכל-trans RA באופן ליניארי בטווח מסוים של ריכוז, ובכך מאפשרים את תגובת LacZ להיות לכמת המשמשת לקביעת עוצמת רמות RA 12,14,18. את assay כתב RA הקל והמהיר המוצג כאן מנצל את שורת תאי כתב נדיר- LacZ F9 להדמיה (איור 2) ומדידת כמותית יחסית (איור 3) של עוברים ותאי גזע עצבי מבוגרים תרבותי. מערכת הכתב הזה מאפשר השוואה של רמות RA אנדוגני בין דגימות בודדות, כפי שמוצג באיור 2. הוא רגיש מספיק כדי להיות מסוגל לזהות RAשנוצר על ידי עוברי E8.5 בודדים (איור 2 א) וכן RA המיוצרים על ידי neurospheres התרבותי (איור 2 ב). התגובה תלויה במינון של שורות התאים כדי ריכוזים שונים של RA מאפשרת כימות של רמות RA (איור 3 א) בדגימות וכן השוואה של רמות היחסיות RA בין הדגימות (איור 3 ב). חשוב לציין כי הקו הסלולרי כתב F9 RARE מודד את הסכום הכולל של RA שנוצר על ידי דגימות הרקמה לאורך זמן דגירה. זה שווה המאזן הנטו של סינתזת RA ו פירוק. בעוד מערכת כתב נדיר- LacZ תא F9 רגישה מאוד תכליתי, ישנם מספר צעדים לפתרון בעיות קריטיים שאנחנו נשלב כדי להבטיח את האמינות של מערכת זו. ראשית, כפי שמוצג באיור 1, חשוב לשמור על הבריאות של תאים אלה על ידי קטעים רגילים בלי לתת להם גרמולחתור אל confluency. שנית, ראינו מאוחר יותר קטעים נוטים לגרום לתגובות RA עולות בקנה אחד, גם אם התרבויות נשמרות כל זמן תחת בחירה עם G418. כדי לפתור בעיה זו, מומלץ להשליך תרבויות אחרי 20 קטעים להפשיר בקבוקון חדש. בנוסף, חייבות להתבצע בדיקות תקופתיות על מנת להבטיח כי תאי הכתב עדיין המגיבים חזק לנוכחות של RA בתקשורת. שלישית, אם הקטעים הראשונים להציג תגובה ירודה או לא אחידה כדי RA (איור 1B, משמאל), אחד או מספר סבבי subcloning עשוי להיות נחוץ עד מגיבים חזקים מתקבלים (האיור 1B, righ t). לבסוף, לפני התרבות משותפת, מומלץ כי דגימות רקמה כגון עובר neurospheres הם ניתקים תאים בודדים. ראינו דיסוציאציה כי תוצאות הדגימות במדידות colorimetric עקביות יותר. זה יכול להיות בגלל חלוקה אף יותר של RA בבארות התרבות, כמו התאים הניתקים נמצאים חדטופס יצירת קשר עם תאי הכתב. מספר שינויים נעשו גם הפרוטוקול המקורי 14. ראשית, תגובת RA של התאים הנדיר-LacZ F9 כומתו על ידי תיקון התאים ומדידת ספיגה ישירות ב 610 ננומטר במקום איסוף תאים וניתוח lysate לפעילות ב-galactosidase 14. שינוי נוסף הוא שיתוף התרבות הישירה של דגימות ניתקו עם F9 נדיר- LacZ לפני כימות בתגובת RA. שיטות קודמות דיווחו culturing דגימות בנפרד והוספה רק תקשורת מתרבויות אלה F9 נדיר- LacZ 16,18. למרות היותה מערכת עוצמה, assay הכתב נדיר- LacZ F9 יש מספר מגבלות. מגבלה אחת של שורת תאים הכתב הזה הוא כי על אף שהוא מגיב חזק בנוכחות כל-trans RA, זה גם מגיב איזומרים החומצה הרטינואית אחרים כולל 9-cis-RA ו -13-cis-RA; עם זאת, הם פי 100 יותר רגישים לכל-trans RA compaאדום איזומרים האחר 18. מגבלה נוספת למערכת זו היא שהתגובה ליניארי תלוי במינון נופלת רק בין 10 -13 M 10 -7 M ב-RA 14,18; וכך, אם משווים רמות RA מחוץ לגבולות אלה, ייתכן שיהיה צורך לבצע דילול סדרתי של המדגם עד המדידות ליפול בטווח ליניארי. לבסוף, שכן מדובר assay colorimetric בעיקר, נקודת הסיום של התפתחות צבע ינוע בין דגימות וניסויים. לפיכך, חשוב כי עקומת סטנדרט תמיד להיות מצופית במקביל עבור כל ניסוי יחיד כדי להשתמש בו עבור כימות של תגובת תא כתב. לסיכום, יש לנו דיווח השימוש של הקו הסלולרי הכתב F9 נדיר- LacZ RA כדי למדוד את רמות RA כמותית בעוברים E8.5 ו, בעבר שלא דווחו מבוסס, neurospheres. הרבגוניות של מערכת הכתב הזה עשויה לאפשר כימות של רמות RA כמעט לכל סוג תא או רקמה, ו- mאיים לגרום להתפתחות של יישומים מגוונים בעתיד.

חומצה רטינואית (RA) היא נגזרת מטבוליט של A רטינול או ויטמין מופק באמצעות פעילות רציפה של דהידרוגנאז הסלולר מספר 1. בגלל האופי הכימי amphiphatic שלה, שהוא חוצה ממברנות שומנים בדם בקלות יכול לפעול כגורם מסיסים המוךפו&quot;גנטי שהולך 1. זוהי מולקולה חיונית המווסת תהליכים תאיים התפתחותיים מבוגרים רבים על ידי מתנהג כמו ליגנד לרצפטורים retinoid הגרעיני והפעלת ביטוי גני 2-10. ללא RA, קולטנים RA אלה (RARs) לאגד Rareş בדנ&quot;א ולפעול repressors; RA קשירה לקולטנים אלה הופך אותם activators תעתיק וכתוצאה מכך ביטוי גן המטרה 1,5,6. למרות מסלול איתות RA מאופיין היטב, בגודל הקטן (~ 300 Da) וטבע amphipathic של RA עושים ויזואליזציה היסטולוגית ישירה ומדידה של RA 11 כיום טכני ישימה. השיטה היחידה עבור dirמדידת ect של רמות RA היא באמצעות בידוד של RA ממדגמים רקמות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) 11. שיטה זו דורשת בדרך כלל כמויות גדולות של רקמה, בהנחייתם של איגום מדגמים שונים 12. לפיכך, טכניקה זו היא אינה מותאמת למדידת רמות RA בעוברי פרט או כמויות קטנות של מדגם / רקמות. על מנת לחקור את הפונקציה הסלולרית של RA, מספר שיטות פותחו כדי להסיק את הנוכחות בעקיפין של RA. שיטות אלה לעשות שימוש במערכות כתב המכילות את RARE RAR-בטא תגובה מאוד נהיגת הביטוי של-galactosidase ביתא או בלוציפראז 11,13,14. עכבר כתב נדיר- LacZ המהונדס שנוצר על ידי Rossant et al. 13 הוא מערכת אידיאלית המאפשרים הדמית אזורי spatiotemporal של איתות RA באתרו 11,13,15,16 אבל אינו מתאים מדידות כמותיות. שורת תא נדיר- LacZ F9 14, על tהוא לעומת זאת, הוא שימושי עבור זיהוי של RA ו מדידות כמותיות של רמות RA ב explants רקמת 11,12,14,17,18. F9 תאים teratocarcinoma להביע אלפא אנדוגני, בטא, וחומצה רטינואית-גמא קולטני 19, וליזום בידול לתוך endoderm הקודקודית לאחר חשיפה 19-21 RA. תאי F9 הוקמו עוד מודל ההתמיינות-induced RA, ולכן הוא נבחר קו תא אידיאלי עבור assay כתב RA. שורת התא העיתונאי F9 הנגזרת סיל-15 RA שנוצרה על ידי וגנר ואח &#39;. 14 מכילה E. coli&#39;LacZ גנים במורד הזרם של עותק אחד של אלמנט תגובה החומצה הרטינואית 64 נ&quot;ב (RARE) של הקולטן חומצה בטא-רטינואית האדם גן (RAR-בטא). כדי לבחור ולשמור שיבוטים יציבים, המבנה מכיל גם את phosphotransferase aminoglycoside הגן (NEO r) כסמן לבחירה בנוכחות G418. שיתוף מבנה זהnfers ביטוי מושרה של-galactosidase ב בנוכחות RA, אשר ניתן דמיינו באמצעות מכתים LacZ ותגובה זו יכולה להיות ובהמשך לכמת באמצעות שיטות colorimetric 11,12,14,18. שורת תאי כתב מאוד צדדי זה נעשה שימוש נרחב זיהוי של ייצור RA אנדוגני באמצעות שיתוף התרבות של דגימות רקמה עם תאי הכתב, כגון explants צלחת רצפת שבלול 17 ועוברים 14. בנוסף, קו הכתב הזה שימש במשך כימות של רמות RA בחוט השדרה פיתוח על ידי culturing סעיפים ונקווה של מיתרי השדרה עובריים בנפרד והוספת התקשורת מותנה מתרבויות אלה לתאים נדיר- LacZ F9 18. כימות בוצעה לאחר מכתים LacZ באמצעות קריאה colorimetric באמצעות קורא צלחת ELISA תקן 11,12,18. לבסוף, שורת תאי הכתב הזה נוצל בעבר זיהוי של הנוכחות של אנזימים מטבוליים RA ידי ניטורng שינויים ברמות RA 12,18. כאן אנו מדווחים כי הרגישות של שורת תאי הכתב הזה גם מאפשרת המדידה של רמות RA שנוצרו מעוברים E8.5 שיתוף תרבותי פרט. זה מאפשר השוואה בין עבר הבודדים של גנוטיפים שונים. כדוגמה ספציפית, Gpr161 הוא GPCR יתום המווסת neurulation בין היתר, באמצעות מסלול איתות RA 22, ואנחנו מדווחים באמצעות שורת תאים הכתב הזה כדי לחקור את ההשפעה של מוטציה רצסיבית ב Gpr161 (VL Gpr161) על רמות RA הכולל עוּבָּר. בנוסף לכך, את הרבגוניות וקלה לשימוש של מערכת הכתב הזה מאפשר את החופש למדוד ולהשוות רמות RA בדגימות רקמה שונות, אפילו בתרבויות neurosphere המתקבלות תאי גזע חוט שדרה מבוגרים. כאן אנו מתארים את הנחישות כמותית של רמות RA ביחס בעוברים ותרבויות neurosphere באמצעות שיתוף התרבות ישיר עם נציג F9 נדיר- LacZ RAשורת תאי orter.

<table><tbody><tr><td>זן עכבר C3H/HeSn-Gpr161vl/J</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>000316</td><td></td></tr><tr>F9 <td></td><td></td><td>קו תאי דיווח RARE-LacZ</td><td>מד"ר מייקל וגנר (המרכז הרפואי SUNY Downstate) ובן ת'יד (מעבדת ד"ר ג'ף קורווין, אוניברסיטת וירג'יניה)</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 (עם L-גלוטמין ו-HEPES)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS), מוסמך</td><td>חנות ThermoFisher Scientific</td><td>26140-079</td><td>ב-20 מעלות; C בכמות של 10 מ"ל כדי למנוע הקפאה והפשרה חוזרת ונשנית; חם ב 37 מעלות; C להכנת מדיה</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>חנות ב-20 מעלות; C בכמות של 10 מ"ל כדי למנוע הקפאה והפשרה חוזרת ונשנית; רגיש לאור</td></tr><tr><td>G418</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131-027</td><td>חנות בטמפרטורה של 4 מעלות; C; רגיש לאור</td></tr><tr><td>2% ג'לטין</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1393</td><td>יש לאחסן ב-4 מעלות; תוסף C</td></tr><tr><td>B-27 (תמיסת מלאי 2%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>חנות ב-20 מעלות; C בכמות של 1 מ"ל כדי למנוע הקפאה והפשרה חוזרת ונשנית; לחמם בטמפרטורת החדר להכנת מדיה</td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמיס עכברי (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td>הכן 100 &mu; תמיסת מלאי גרם/מ"ל באלבומין סרום בקר 0.1% (BSA) ב-1xPBS; להכין ריכוזי עבודה על ידי דילול עם 1x PBS; יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים של עכברים (FGF) - בסיסי</td><td>PeproTech</td><td>450-33</td><td>הכן 100 &mu; תמיסת מלאי גרם/מ"ל באלבומין סרום בקר 0.1% (BSA) ב-1x PBS; להכין ריכוזי עבודה על ידי דילול עם 1x PBS; יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>50% glutaraldehyde</td><td>Amresco</td><td>M155</td><td>חנות ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולאט מונוהידראט (C24H39NaO4 &middot; H2O)</td><td>חנות Sigma Aldrich</td><td>D5670</td><td>ב-RT</td></tr><tr><td>X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-d-galactopyranoside)</td><td>Promega</td><td>V3941</td><td>חנות מלאי ב-20 מעלות; C&nbsp;</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>41639</td><td>אחסן ב-RT</td></tr><tr><td>all-trans חומצה רטינואית (at-RA)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>R-2625</td><td>אחסן 1 מ"ל מכסות מלאי ב-80 מעלות; C; רגיש במיוחד לאור</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12605-010</td><td>חנות ב-RT</td></tr><tr><td>0.25% טריפסין-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200-056</td><td>חלופה ל-TrypLE Express; יש לאחסן ב-20 מעלות; </td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של C Hank (HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170-112</td><td>חנות ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>10x תמיסת חוצץ פוספט (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>חנות ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>חנות LK003176</td><td>ב-4 &deg;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Worthington</td><td>LS003703</td><td>לאחסן ב -1 מ"ל ב -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>חומצה היאלורונית&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>385908</td><td>Store 200 &mu; l aliquots ב-20 &deg;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>חנות LS002139 DNaseI</td><td>Worthington</td><td></td><td>ב-200 &mu; l aliquots ב-20 & deg; C</td></tr><tr><td>חומצה קינורנית</td><td>Sigma Aldrich</td><td>K3375</td><td>חנות ב-200 &mu; l aliquots ב-20 & deg; C</td></tr><tr><td>95% אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיכל הקפאה Mr. Frosty ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית 10 ס"מ (לא מטופלת בתרבית תאים)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>צלחת תרבית 10 ס"מ (מטופלת בתרבית תאים)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>צלחת תרבית 6 ס"מ (לא מטופלת בתרבית תאים)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>צלחות תרבית תאים 96 בארות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות</td><td></td><td></td><td></td>מיקרוצנטריפוגה ענבר</tr><tr><td>1.5 מ"ל קריוביאלים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 מעלות; C אמבט מים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כירורגיים מספריים כירורגיים</td><td></td><td></td><td></td>עדינים</tr><tr><td>מס '5 מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קהים מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>להב</td><td></td><td></td><td></td>אזמל</tr><tr><td>זכוכית פיפטות</td><td></td><td></td><td></td>פסטר</tr><tr><td>כותנה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מנורת</td><td></td><td></td><td></td>אלכוהול</tr><tr><td>ELISA קורא</td><td></td><td></td><td></td>צלחות</tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מדידה כמותית של רמות חומצה רטינואית יחסית ב e8.5 עוברים neurosphere תרבויות באמצעות assay reporter f9 נדיר- lacz מבוססי תאים

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

חומצה רטינואית (RA) היא מורפוגן התפתחותי חשוב המתאם דפוס ציר קדמי-אחורי וגב-וונטרלי, התמיינות סומית, נוירוגנזה, דפוס של המוח האחורי וחוט השדרה, והתפתחות של מערכות איברים מרובות. בשל אופיו הכימי כשומן אמפיפתי קטן, זיהוי והדמיה ישירים של RA מבחינה היסטולוגית נותרים בלתי אפשריים מבחינה טכנית. נכון לעכשיו, שיטות המשמשות להסקת נוכחות ולוקליזציה של דלקת מפרקים שגרונית עושות שימוש במערכות דיווח המזהות את הפעילות הביולוגית של דלקת מפרקים שגרונית. רוב מערכות הדיווח המבוססות, הן עכברים טרנסגניים והן קווי תאים, עושות שימוש באלמנט תגובת RA (RARE) חזק מאוד במעלה הזרם של הגן RAR-beta כדי להניע ביטוי השראת RA של גנים מדווחים, כגון בטא-גלקטוזידאז או לוציפראז. העכבר הטרנסגני RARE-LacZ שימושי בהדמיית שינויים מרחביים-זמניים באיתות RA במיוחד במהלך ההתפתחות העוברית. עם זאת, הוא אינו מודד ישירות את רמות ה-RA הכוללות. כמערכת דיווח, ניתן להשתמש בקו התאים F9 RARE-LacZ במגוון דרכים, החל מזיהוי פשוט של RA ועד למדידות כמותיות של רמות RA בצמחי רקמה. כאן אנו מתארים את הקביעה הכמותית של רמות RA יחסיות שנוצרו בעוברים ובתרביות נוירוספרה באמצעות קו התאים המדווח F9 RARE-LacZ.

כתב נדיר- LacZ F9 הוא שורת תאי קרצינומה עוברית חסיד גדלה על פני שטח ג&#39;לטין מצופים. בונת הכתב מאפשרת לתאים להגיב כמותית כדי RA עם אינדוקציה יחסית של-galactosidase בטא. 11,12,14,18. תאים אלה להציג מורפולוגיה אפיתל (איור 1 א). בגלל קצב ההכפלה הגבוה שלהם, מומלץ כי תאים אלה להתפצל כל 2 - 3 ימים ביחס של 1:10. במהלך עבודתנו עם שורת תאי הכתב הזה, יש לנו ציין כי אפילו עם התוספת של G418 לתוך מדיום התרבות, התגובה של תאים אלה כדי RA מחלישה אחרי קטעים אחדים (איור 1B, משמאל), וזה יכול להשפיע על יכולת כתב שורות התאים. הפסד זה של היענות יכול להיות בגלל אובדן חלקי של transgene ב קטעים מאוחר יותר. כפי subcloning כזה, תקופתי יש צורך להבטיח מגיבים חזקים ואחידים כדי RA (איור1B, מימין). בעוד שימושים שונים של שורת תאים זו פורסמו בעבר 12,14-18, דיווחו כאן הוא השימוש שורות התאים כדי למדוד את רמות RA אנדוגני מעוברים E8.5 הפרט עם גנוטיפים שונים. Gpr161 VL / VL תוצאות מוטצית ירד RA העוברי איתות 22. כפי שמוצג על ידי שיתוף התרבות של עוברים ניתקים עם תאי F9 נדיר- LacZ, אלה Gpr161 VL / VL עובר צמצם אנדוגני RA לעומת להמלטת wild-type (איור 2 א). בגלל הרבגוניות של שורת תאי הכתב הזה, דיווח גם כאן הוא שימוש רומן של תאים אלה כדי לזהות רמות RA המיוצרות על ידי תרבויות neurosphere המתקבלות Gpr161 מבוגר עכברי WT / WT (תרשים 2B). שורת תאי הכתב הזה הצליחה להוכיח כי תרבויות neurosphere מתאי גזע חוט שדרה מבוגרים לייצר RA אנדוגני. ל diff הגדולerence בעוצמה מכתים זו מלמדת על תגובה תא עיתונאי יותר neurospheres חוט השדרה לעומת עוברי E8.5. זה יכול להיות בגלל רמות הרבה יותר RA שנוצרו על ידי neurospheres לאורך זמן לעומת עוברי E8.5, אשר יכול להיות בשל העובדה כי neurosphere תרבויות יותר הומוגנית שאינו עובר בשלב E8.5 ובכך להכיל יותר תאי RA-ייצור. הוספת ריכוזים שונים של תוצאות ב-RA בתגובה ליניארית-תלוי-מינון של תאי הכתב. תגובה זו יכולה להימדד colorimetrically ידי קריאה הספיגה ב 610 ננומטר. עקומת תקן שנוצר לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לכמת רמות RA בדגימות, כגון בתרבויות neurosphere wild-type (איור 3 א) או עוברים E8.5 (איור 3 ב). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig1.jpg" /> בשימור באיור 1.enance ו subcloning של תאים נדירים-LacZ F9. (א) תמונת שלב ניגודיות של תאים הנדיר-LacZ F9 מוצגת. תאים אלה זמן הכפלה של hr ~ 10 ו יש להעביר כל 3 ימים. (בערך 70 - 80% מפגש) ביחס 01:10 (בוקר) בדיקות תקופתיות של תרבויות עם תוספת של 1 ננומטר ב-RA ו LacZ עוקבות מכתים חייב להיעשות כדי להבטיח תרבויות להישאר מגיבים חזקים ואחידים כדי RA (מימין). במקרה של מגיבים עניים לא אחידים (משמאל), חייבת להתבצע subcloning. סולם bars 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54443/54443fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig2.jpg" /> איור 2. LacZ הכתמה של שיתוף תרבותי דוגמאות (עוברים E8.5 ניתק / Neurospheres) ו F9 תאים נדיר- LacZ. (א) העובר עכבר E8.5<html> ים של גנוטיפים שונים היו ניתק מצופה על גבי תאים נדיר- LacZ F9. LacZ מכתים 24 שעות לאחר מכן מאפשר הדמיה של תגובת תאי נדיר- LacZ F9 כדי אנדוגני RA המיוצרים על ידי דגימות שיתוף תרבותי. תוצאות מוטצית VL Gpr161 ב- RA אנדוגני ירד כמו דמיינו מההיענות המופחתת של תאי הכתב. (ב) שמאל. תמונת שלב ניגודיות של neurospheres התרבותי מתאי גזע עצביים בחוט השדרה מבוגרים מוצגת. ימין. Neurospheres נגזר מבוגר Gpr161 WT חוט שדרה / WT היה ניתק מצופה על גבי תאי נדיר- LacZ F9. הנוכחות של המשקע הכחול שבא בעקבות מכתים LacZ להעיד על נוכחות של אנדוגני RA ב neurospheres אלה. ההבדל מכתים בעוצמה בין neurosphere ואת העובר E8.5 שיתוף תרבויות מצביעים רמות גבוהות יותר של ההווה RA ב neurospheres שאינם עוברים בשלב E8.5. סולם bars 100 מיקרומטר.Target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig3.jpg" /> עקומת סטנדרט דיאגרמה 3. מדד-צבע כימות רמות RA. התגובה של הקו הסלולרי כתב נדיר- LacZ F9 ניתן למדוד colorimetrically ב 610 ננומטר באמצעות קורא צלחת ELISA סטנדרטי. (א) עקומת תקן נציג לכמת רמות RA היחסיות של neurosphere התרבות של wild-type. (ב) כימות של רמות RA ביחס מעוברים E8.5-תרבותי משותף. N = 3; * P &lt;0.05, מבחן t. ברי שגיאה SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54443/54443fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> סטיתיחוצצי ck / פתרונות </td><td> רכיבי </td><td> תנאי אחסון </td></tr><tr><td> 10% מונוהידראט deoxycholate נתרן (C 24 H 39 נאו 4 · H 2 O) </td><td> 10 מ&quot;ל ב 100 מ&quot;ל DH 2 O </td><td> 4 ºC </td></tr><tr><td> 1 מגנזיום כלוריד M (MgCl 2) </td><td></td><td> RT </td></tr><tr><td> 100x פרוציאני אשלגן (K 4 [Fe (CN) 6] · 3H 6 O) </td><td> 2.12 גרם ב 10 מ&quot;ל DH 2 O </td><td> RT בחושך </td></tr><tr><td> 100x אשלגן ferricyanide (K 3 [Fe (CN) 6]) </td><td> 1.64 גרם ב 10 מ&quot;ל DH 2 O </td><td> RT בחושך </td></tr><tr><td> 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​X-gal (5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-β-ד-galactopyranoside) </td><td> להוסיף לפוראמיד דימתיל 5 מ&quot;ל לעשות 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון המניות </td><td> -20 ºC </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;מ (3 מ&quot;ג / מ&quot;ל) כל-TRans החומצה הרטינואית </td><td> ממיסים 50 מ&quot;ג ב 16.67 מ&quot;ל אתנול אבסולוטי. הכן 1 aliquots מ&quot;ל. </td><td> -80 ºC בחושך, צינורות microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל ענבר </td></tr><tr><td> פפאין </td><td> לפזר בקבוקון אחד ב -7 מ&quot;ל HBSS </td><td> 4 ºC </td></tr></tbody></table> טבלה 1. חוצצי פתרון יצירות. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> עבודת חוצצים / פתרונות </td><td> רכיבי </td><td> תנאי אחסון </td></tr><tr><td> מדיום רייר-LacZ תרבית תאים F9 </td><td> 50 מ&quot;ל סרום שור עובר (FBS) (ריכוז סופי 10%) </td><td> מסנן לעקר. </td></tr><tr><td></td><td> 5 מ&quot;ל סטרפטומיצין פניצילין 100x (סופי קונצרט כלשהו 1X) </td><td> חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </td></tr><tr><td></td><td> 4מ&quot;ל 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​G418 (סופי קונצרט כלשהו 0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 500 מ&quot;ל DMEM / F-12 (עם L- גלוטמין ו HEPES) </td><td></td></tr><tr><td> 0.2% ג&#39;לטין </td><td> 25 מ&quot;ל 2.0% ג&#39;לטין </td><td> חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </td></tr><tr><td></td><td> מים 80 מ&quot;ל מזוקקים </td><td></td></tr><tr><td></td><td> לערבב היטב </td><td></td></tr><tr><td> אתנול 70% </td><td> אתנול 30 מ&quot;ל 95% </td><td> מניחים בתוך בקבוק תרסיס. </td></tr><tr><td></td><td> מים 70 מ&quot;ל מזוקקים </td><td> חנות ב RT </td></tr><tr><td> בינוני דיסוציאציה neurosphere </td><td> 1 מ&quot;ל 20U פפאין </td><td> להכין טרי בכל פעם </td></tr><tr><td></td><td> 100 μl 13 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​טריפסין </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 100 μl 7 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​חומצה היאלורונית </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 28 μl 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​DNaseI </td><td></td></tr><tr><td></td><td>50 μl 4mg / חומצה kynurenic מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> מדיום תרבות neurosphere </td><td> DMEM / F-12 (עם L- גלוטמין ו HEPES) </td><td> להכין טרי בכל פעם </td></tr><tr><td></td><td> 2% B-27 תוספת </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20 גורם גדילה פיברובלסטים ng / ml (FGF) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20ng גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) </td><td></td></tr><tr><td> 2.5% glutaraldehyde </td><td> 250 μl 50% glutaraldehyde </td><td> להכין טרי בכל פעם </td></tr><tr><td></td><td> 4750 μl 1x PBS </td><td></td></tr><tr><td> פתרון לשטוף LacZ </td><td> 0.5 מ&quot;ל 10% deoxycholate (קונצרט כלשהו 0.1% הסופי) </td><td> חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </td></tr><tr><td></td><td> 1.0 מ&quot;ל 100% NP-40 (סופי קונצרט כלשהו 0.2%) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 50 מ&quot;ל 10X PBS </td><td></td></tr><tr><td></td><td> מים מזוקקים 500 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> X-gal פתרון מכתים </td><td> פרוציאני אשלגן 1x </td><td> להכין טרי בכל פעם </td></tr><tr><td></td><td> אשלגן 1x ferricyanide </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​X-gal </td><td></td></tr><tr><td></td><td> נפח המתאים באמצעות פתרון לשטוף LacZ </td><td></td></tr><tr><td> בינוני הקפאת נדיר- LacZ F9 </td><td> F9 בינוני תרבות נדיר- LacZ + DMSO 5% </td><td> להכין טרי בכל פעם </td></tr></tbody></table> טבלה 2. חוצצים מדי עבודה יצירות פתרון.

שיטות למדידה מדויקת של רמות חומצה רטינואית (RA) בכמויות קטנות של רקמה אינן קיימות. פרוטוקול זה מתאר מדידה קלה וכמותית של רמות RA יחסיות בעוברים E8.5 ונוירוספרות באמצעות קו תאים מדווח RA.

מדידה כמותית של רמות חומצה רטינואית יחסית ב E8.5 עוברים neurosphere תרבויות באמצעות assay Reporter F9 נדיר- lacZ מבוססי תאים

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד באופן כמותי רמות יחסיות של retinoic acid בדגימות רקמה, כגון עוברי עכבר בשלב E8.5 או תרביות של נוירוספירות ממבוגרים, באמצעות מערך דשייר (reporter assay) מבוסס תאים. בעוד שנתיב השביעות של RA מאופיין היטב, מדידה היסטולוגית ישירה של RA אינה khảשימה מבחינה טכנית. מערך זה יכול לסייע במענה על שאלות מפתח בנוגע לאופן שבו מוטציות גנטיות יכולות להשפיע על רמות RA.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא רגישה ורב-גונית מאוד, עם יכולת למדוד טווח רחב של ריכוזי RA במגוון דגימות רקמה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה ישירה לקביעת רמות RA בדגימות רקמה שונות, ניתן ליישם אותה גם במחקרים אחרים, כגון קביעת הנוכחות או ההיעדרות של אנזימי מטבוליזם של RA על ידי ניטור שינויים ברמות ה-RA. לפני תחילת הניסויים, יש לבדוק את תגובת תאי F9 RARE-LacZ ל-RA. הוסף 1 nanomolar של all-trans RA לתאי F9 RARE-LacZ שהועלו לפלטה בעלת 96 בארות.לאחר מכן, הדגרירו את הפלטה, וגדלו בתרבית בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. למחרת, בצעו צביעת LacZ ובדקו את התאים לנוכחות משק כחול. אם הצבע אינו אחיד בכל התאים, המשיכו לביצוע סב-קלון (subclone) של התאים.חלקו את התרביות שנבחרו לצלחונות בני 10 סנטימטר בריכוז של 100,000 תאים ל-10 מיליליטר. לאחר יומיים של גידול, הכינו פלטה בעלת 24 בארות עם 500 מיקרוליטר של ג'לטין 0.2% לכל בארה, והניחו לפלטה לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסירו את הג'לטין ושטפו את הבארות פעמיים עם 500 מיקרוליטר של מים מזוקקים.כעת, הוסיפו 500 microliters של מדיום תרבית תאים F9 RARE-LacZ לבארות. לאחר מכן, בחרו מושבות של תאי F9 באמצעות טיפ פפית P10 סטרילי והעבירו כל אחת לבארה אחת. לאחר שלושה או ארבעה ימי תרבית, פצלו את המושבות לשתי פלטות בעלות 24 בארות מצופות ג'לטין, אחת לבדיקה והשנייה להתרחבות.לאחר יומיים נוספים של תרבית, הוסף 1 nanomolar של RA לכל באר בלוח אחד בעל 24 בארות והגדל את התרבית למשך הלילה. למחרת, בצע צביעת LacZ כדי לבדוק מגיבים גבוהים והרחב את התרבית המתאימה. יום אחד לפני קצירת העוברים בשלב E8.5 או פירוק הנוירוספירות, צפה לוח בעל 96 בארות ב-100 µL של ג'לטין בריכוז 0.2% לכל באר, והשאר את הלוח למשך 30 דקות.לאחר מכן, שאבו את הג'לטין ושטפו את הבארים פעמיים עם 200 µl של מים מזוקקים. לאחר מכן, בצעו טריפסינציה לתאי F9 RARE-LacZ שנבחרו, המטופחים בצלחות של 10 סנטימטר. לאחר מכן, זרעו 100,000 תאים לכל באר בלוח 96-בארים תוך שימוש במצע גידול ללא G418.מלאו מספיק בארות לתרבית משותפת (co-culture) של כל עובר, או הכינו שלוש בארות לכל גנוטיפ אם אתם עובדים עם נוירוספירות (neurospheres). הכינו בנוסף 24 בארות עבור עקומת הסטנדרט. לאחר מכן, דגרו את הפלטה למשך 24 שעות.לצורך תרבית משותפת של תאים עובריים, התחילו בניתוח של עוברים בשלב E8.5. לאחר מכן, מלאו מבחנה חדשה בנפח 1.5 מיליליטר ב-10 מיקרוליטר של trypsin, ובעזרת טיפ פואט P20 בעל פיה רחבה, העבירו את העובר השלם למבחנה והניחו את המבחנה על קרח. לאחר בידוד כל העוברים, דגרו את כל המבחנות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לפרק את הרקמות.לאחר חמש דקות, בצעו טריטורציה (ערבוב על ידי פי펫ה) עדינה של תכולת כל מבחנה באמצעות טיפ של פי펫ה P20, והעבירו 10 µL לבאר בלוח 96-בארים שהוכן עם תאי F9 RARE-LacZ. דגרו את הלוח למשך לילה. עבור תרביות משותפות (co-cultures) של נוירוספרות, התחילו בהעברת תרבית נוירוספרות למבחנות של 15 ml.סובב את המבחנות ב-200 g's למשך 10 דקות, והסר את כל הנוזל העליון (supernatant) למעט מיליליטר אחד. לאחר מכן, בצע טריטורציה (trituration) של התוכן באמצעות פיפט P1000. כעת, השתמש בנפח קטן כדי לקבוע את צפיפות התאים המופרדים.לאחר מכן, זרע 100,000 תאי נוירוספירה מופרדים מעל תאי F9 RARE-LacZ. טען שלוש באערות עבור כל סוג של תרבית נוירוספירה. כעת, ודא כי הבאערות עבור עקומת הסטנדרט מוכנות.הוסיפו בשלוש חזרות 100 microliters של תמיסות all-trans RA שהוכנו בדילול סדרתי בשבעה ריכוזים שונים בתוך מצע גידול F9 RARE-LacZ. כללו בקרות שליליות של תאים לא מטופלים. לבסוף, דגרו את פלטת 96 הבארים המלאה למשך לילה.ביום למחרת, הסירו את המצע וקבעו את התרביות באמצעות 100 µL של 2.5% glutaraldehyde לכל באר. הניחו לפלטה להדגר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, הסירו את המקבע ושטפו את הבארה פעמיים עם 200 µL של PBS למשך 10 דקות לכל שטיפה.בשלב הבא, שטפו את הבארים שלוש פעמים עם 200 microliters של תמיסת שטיפה LacZ למשך 10 דקות לכל שטיפה. במהלך השטיפה השלישית, הכינו את תמיסת הצביעה X-gal במבחנה של 15 milliliter עטופה בנייר אלומיניום. כמו כן, הכינו תא לח למגש ה-96-well.כעת, הוסיפו 200 µL של תמיסת צביעת X-gal לכל באר. הניחו את הפלטה בתוך תא לחות, והדגירו בטמפרטורה של 37 °C. לאחר ההדגרה, הסירו את תמיסת צביעת ה-LacZ והחליפו אותה ב-200 µL של PBS.לאחר מכן, מדדו את הבליעה באורך גל של 610 nanometers, וצלמו את הפלטה. שורת תאי הדגם F9 RARE-LacZ מורכבת מתאי קרצינומה עובריים הדבקים המגיבים באופן כמותי ל-RA באמצעות השראה פרופורציונלית של beta-galactosidase. לתאים אלו יש גם מורפולוגיה אפיתליאלית.על אף תרבית תחת סלקציה של G418, התגובה של תאים אלו ל-RA תיחלש לאחר מספר מעברים. לכן, נדרש ביצוע סב-שיבוט (subcloning) תקופתי כדי להבטיח תגובה חזקה ואחידה ל-RA. עוברי E8.5 הומוזיגוטים למוטציה vl ב-Gpr161 צפויים להראות ירידה באותיות RA עובריות. ציפייה זו אוששה באמצעות בדיקת התרבית המשולבת (co-culture assay) המתוארת של עוברי מפורקים עם תאי F9 RARE-LacZ.שימוש בתרבית משותפת של נוירוספירות מבוגרות מסוג פראי (wild-type) עם תאי F9 RARE-LacZ שימש גם לבדיקת נוכחות RA בתרביות נוירוספירות. עלייה בעוצמת הצביעה, בהשוואה לתאי שלב E8.5, עשויה לנבוע מההומוגניות של תרביות הנוירוספירות. באמצעות יצירת עקומת סטנדרט לרמות RA, ניתן היה לכמת את רמת ה-RA בתרביות נוירוספירות מסוג פראי ובעוברים בשלב E8.5.בעת ביצוע הליך זה, זכרו לשמר באמצעות סוב-קלונינג (subcloning) תקופתי תאי F9 RARE-LacZ המגיבים בעוצמה ל-RA. כמו כן, הקפידו להפריד (dissociate) את הדגימה ביסודיות כדי לאפשר פיזור הומוגני ומדידה עקבית של RA. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לחקור את השפעתן של מוטציות גנטיות על רמות ה-RA, ולאחר מכן ניתן לבצע שיטות אחרות כדי לבדוק אילו מרכיבים במסלול האיתות של RA הושפעו באופן ישיר.

quantitative-measurement-relative-retinoic-acid-levels-e85-embryos

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מתאר דרך פשוטה וזולה לכמת את הפעילות של cis-הרגולציה אלמנטים (כלומר, משפר / היזמים) לחיות הרשתיות העכבר דרך electroporation explant. הכנת ה-DNA, דיסקציה רשתית, electroporation, תרבות explant רשתית, שלאחר קיבוע ניתוח וכימות מתוארים.

כימות של פעילות Cis-Regulatory אלמנטים ברשתית עכבר ידי electroporation Explant

סרטון זה מדגים טכניקה פשוטה לנוירוגנזה הנגרמת על ידי חומצה רטינואית בתאי קרצינומה עוברית של עכבר P19. חומצה רטינואית מפעילה גורמי שעתוק ומפעילה ביטוי גנים להתמיינות עצבית.

נוירוגנזה הנגרמת על ידי חומצה רטינואית באמצעות תאי קרצינומה עוברית של עכבר

סרטון זה מדגים טכניקה להערכת פעילות חומצה רטינואית בעוברי עכברים. לאחר בידוד התאים מעוברי העכברים, התאים עוברים תרבית משותפת עם תאי כתב חומצה רטינואית (RA). תאים עובריים מייצרים RA, אשר גורם לביטוי בטא-גלקטוזידאז בתאי כתב, מה שמעיד על פעילות RA בתאים העובריים.

העסקת תאי כתב בתרבית משותפת לחקר ייצור חומצה רטינואית על ידי תאים עובריים של עכברים

סרטון זה מדגים את מדידת הפרשת חומצה רטינואית (RA) מתאי נוירוספרה באמצעות תאי כתב RA. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בטיפוח משותף של תאי נוירוספרה עם תאי כתב RA וביצוע בדיקת RA קולורימטרית למדידת רמות RA.

מדידת רמות חומצה רטינואית בנוירוספרות באמצעות קו תאי כתב חומצה רטינואית

שיטה לכמת את גודלו וצורת orofacial של עוברי laevis Xenopus פותחה. בפרוטוקול זה, מדידות גודל מסורתיות בשילוב עם morphometrics הגיאומטרי כדי לאפשר ניתוחים מתוחכמים יותר של התפתחות וליקויי orofacial.

כימות Orofacial פנוטיפים ב צפרדעים

בעבודה זו אנו מספקים זרימת עבודה ניסיונית כיצד ניתן לזהות משפרים פעילים ולאמת אותם בניסוי.

חיזוי ותיקוף של גן בקרה אלמנטים הופעל במהלך החומצה הרטינואית מושרה גזע עובריים התמיינות תאים

אנו מתארים שיטה לשימוש בתאי גזע עובריים בעכברים ליצירה שניים או שלושה גופי embryoid ממדים. לאחר מכן נסביר כיצד להשרות התמיינות עצבית של תאי הגוף Embryoid ידי חומצה רטינואית, וכיצד לנתח מצב הבידול שלהם על ידי immunofluorescence סמן תא אב ו immunoblotting.

ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

כאן, המחברים מציגים את התועלת של MULTI-seq עבור פנוטיפ והצמד הבא scRNA-seq ו- scATAC-seq באפיון פרופילי הנגישות של תעתיק וכרומטין ברשתית.

ניתוח מרובב של ביטוי גנים ברשתית ונגישות כרומטין באמצעות scRNA-Seq ו- scATAC-Seq

פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה להסרה גנטית של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) באמצעות מודל של דגי זברה מהונדסים. התאמת הפרוטוקול לשילוב אפנון מסלול איתות באמצעות תרכובות פרמקולוגיות מפורטת בהרחבה. פלטפורמת MATLAB לכימות התחדשות RPE המבוססת על פיגמנטציה פותחה והוצגה ונדונה.

ניטרורדוקטאז/אבלציה בתיווך מטרונידזול ופלטפורמת MATLAB (RpEGEN) לחקר התחדשות של אפיתל פיגמנט הרשתית של דג הזברה

אלקטרופיזיולוגיה היא תקן הזהב לחקר פעילות תעלות היונים. עם זאת, ישנן גישות חלופיות רבות, כולל שיטות אופטיות. במאמר זה אנו מתארים שיטה לניטור הפעילות של תעלות אניון עשירות בלאוצין המכילות 8 ערוצי אניון (LRRC8) באמצעות שיטה מבוססת העברת אנרגיית תהודה בין תת-יחידות Förster (FRET).

ניטור פעילות חוזרת עשירה בלאוצין המכילה 8 ערוצים (LRRC8/VRAC) באמצעות העברת אנרגיית תהודה של Förster עם פליטה רגישה (SE-FRET)

RASopathies הן תסמונות גנטיות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי היפראקטיביזציה של מסלול RAS-MAPK. וריאנטים פתוגניים פוטנציאליים הממתינים לאימות מופיעים ללא הרף בעוד ראיות פרה-קליניות גרועות מגבילות את הטיפול. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ה-in vivo שלנו לבדיקה ואימות צולב של רמות הפעלת ERK הקשורות ל-RASopathy ואת האפנון הפרמקולוגי שלו במהלך האמבריוגנזה על ידי הדמיית FRET חיה בדג זברה Teen-reporter.

פרוטוקול יעיל להערכת אפנון פעילות ERK במודלים מוקדמים של תסמונת נונן של דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ FRET חי ואימונופלואורסצנציה

למד מדידה כמותית של רמות חומצה רטינואית בעוברי עכברים E8.5 ותרבויות נוירוספיר באמצעות assay תאי דיווח F9 RARE-lacZ. שיטה רגישה זו מאפשרת הערכת ריכוזי RA במגוון רחב של דגימות רקמה וחקר השפעת מוטציות גנטיות על תהליכי התפתחות.

מדידה כמותית של רמות חומצה רטינואית יחסית ב E8.5 עוברים neurosphere תרבויות באמצעות assay Reporter F9 נדיר- lacZ מבוססי תאים

גלה סרטונים נוספים