דפוסי Subtractive מהירים של שכבות תא חיות עם בדיקת Microfluidic

המטרה העיקרית של השיטה המוצגת במאמר וידאו זה היא ליצור במהירות דפוסי תאים מוגדרים מרחבית כדי להקל על ניתוח מרחבי-זמני באתרו של אינטראקציות בין תאים. האסטרטגיה המוצגת ממנפת את טכנולוגיית הבדיקה המיקרופלואידית. ראש הבדיקה המיקרו-מיוצר ממקם נפחי ננו-ליטר של ביוכימיקלים על מצעים ביולוגיים כדי לעצב חד-שכבות של תאים.

היתרון העיקרי של טכניקת דפוס מבוססת MFP הוא שהיא כמעט מיידית, עקב ליזה מקומית, ומאפשרת ליצור שינוי בזמן אמת של התבניות. הרעיון לשיטה הזו עלה לראשונה כששמנו לב ששיטות אחרות ליצירת תבניות תאים דורשות פרוטוקולים ארוכים ורב-שלביים לפני שראינו בפועל את ההצלחה של תבניות התאים. כדי לבצע ניסויים יציבים עם כליאת זרימה הידרודינמית על פני התא, יש לייעל את פרמטרי ה-MFP.

לשם כך, הדגמה חזותית היא קריטית. אדיטיה קשיאפ וג'וליאן קורס ידגימו את ההליך הזה. המודולים התפעוליים של הפלטפורמה כוללים מזרקים ממונעים, שלבים ממונעים ובקר.

ה-MFP מחובר ל-Z-stage ממונע כדי לשלוט במרחק הרווח בין הראש למצע, ומחזיק המצע מחובר לשלבים הממונעים X ו-Y המרכיבים את מערכת הסריקה. לראש ה-MFP יש דרכים נוזליות לחיבור לתחנת השאיבה, חורי הרכבה להרכבת הראש על ה-Z-tagה, ותעלות היוצאות מהקודקוד המלוטש. הקודקוד מוגדר קו-מישורי למצע תרבית התאים.

להכנת תחנת השאיבה ומנגנון הטיפול בנוזלים, נקו מזרקים ובוכני מזרקים על ידי סוניקציה ותמיסת אקונומיקה של 0.5% במים טהורים במיוחד לפני ואחרי ניסויים בתאים חיים. שוטפים אותם היטב במים. מלאו את המזרקים במים על ידי טבילת קצותיהם לחלוטין באמבט מים ושאיבה באמצעות הבוכנה.

נקה את הנוזל בעודו בתוך אמבט המים כאשר פיר המזרק יוצר קשר עם החותם ביציאת המזרק. המשיכו לשאוף ולנקות עד שלא נראו בועות אוויר בעמודי המזרק. חבר את המזרקים המלאים למשאבות המזרקים באמצעות מחברי נעילה תחתונה.

השתמש בשסתום המתג המותקן על המשאבות כדי לכוון את הנוזל מהמזרק לאחד משני הנימים המובילים לראש ה-MFP או למאגרי הנוזל. יש לטהר את שני הנימים במים מהמזרקים בקצב זרימה של כ-10 עד 50 מיקרוליטר לדקה, תלוי בגודל המזרק, עד שנותרו כ-10 מיקרוליטר מים במזרקים. נקה את ראש ה-MFP באמצעות סוניקציה באמצעות חומר ניקוי לכלי זכוכית לניקוי רגיל, או 0.5% אקונומיקה לניקוי מחמיר, למשך חמש דקות.

נקה את התעלות במים על ידי טבילת הקודקוד במים והחלת ואקום על הפתחים. בדוק את הערוצים תחת מיקרוסקופ סטריאו לאיתור חסימות פוטנציאליות, וחזור על השלב הקודם, במידת הצורך. לאחר מכן, הרכיב את הראש הנקי על מחזיק הראש והברג את המחבר על הראש.

הכנס את הנימים המטוהרים למתאם מחבר מיקרו-נוזלי מתאים המתממשק עם דרך התעלה בראש. הברג את מחזיק הראש ל-Z-stage, המשמש לבקרת מרחק הפער בין הראש לחד-שכבת התא, לפני ביצוע כיול נקודת קצה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השג מרחק אפס פער גולמי על ידי הבאת ראש ה- MFP מעל מגלשה תאית ללא תאים וירידה איטית בצעדים של חמישה מיקרון.

במגע בדיקה עם המצע, יש להבחין בטבעות של ניוטון. זו הערכה גסה. יש לקבל מיקום מדויק לאחר התאמת הקו-מישוריות של קודקוד הגשושית למצע.

כאשר נוצרים, ודא שהטבעות של ניוטון סימטריות. כדי להבטיח קו-מישוריות של קודקוד הבדיקה, כוונן את הטיית הראש באמצעות גוניומטר בממשק הראש ושלב ה-Z. הרחק את ראש ה-MFP 20 מיקרון מהמצע והתאם את ההטיה באמצעות הגוניומטר.

חזור על התאמת הירידה, האפס וההטיה עד שהטבעות של ניוטון יהיו סימטריות במגע. כאשר ההטיה מותאמת, הגדר את מיקום Z, המייצר טבעות ניוטון סימטריות, לאפס. לאחר מכן, הכן את נוזל העיבוד לתעלת ההזרקה הפנימית ואת תמיסת חיץ המיצוי הנדרשת להזרקה החיצונית, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

באמצעות קו הניקוז התחבר למשאבות המזרק, נקה את המים הנותרים ושאב את התמיסות המנוקות לתוך מזרקי ההזרקה במהירות של 40 מיקרוליטר לדקה עד שהמזרקים מלאים. זה מבטיח מילוי ללא בועות של המזרקים, המחברים והנימים. כדי להכין את החד-שכבות של התאים על שקופיות תא, הוצא תאים בצלוחיות T באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של תרבית תאים.

בהגעה למפגש תאים בצלוחיות התרבית, טריפסיניזציה ואיסוף תאים. זרע 0.2 מיליון תאים לסנטימטר רבוע בכל אחת מהשקופיות הדו-קאמריות לדפוס. תרבית התאים במשך 48 שעות באמצעות התאים באחד התאים כבקרה על צמיחת התאים וחיותם.

בהגיעך למפגש התאים בשקופיות החדר, דגרו על התאים למשך 45 דקות עם 500 מיקרוליטר של תמיסת צבע עוקב תאים בריכוז של 10 מיקרומולרית שהוכנה במדיום נטול סרום. זה נעשה לצורך הדמיית תאים במהלך דפוס. שטפו את התאים המסומנים עם PBS על ידי שטיפה עדינה של כל תא באמצעות פיפטה.

לאחר מכן, תרבית התאים במדיום בתוספת סרום לניסויי הדפוס. כליאת הזרימה ההידרודינמית ממקמת נוזלים באמצעות הזרקה ושאיבה בו זמנית של נוזל עיבוד. בכליאה ההיררכית, נוזלי עיבוד מרובים מוגבלים, כאשר ה-HFC החיצוני מגן על הדגימה מפני ה-HFC המעבד הפנימי.

העבר את ה- MFP מעל שכבת התא למרחק פער של 50 מיקרון משקופית הזכוכית. מרחק פער זה מבטיח מגע של ה-HFC ההיררכי ומהווה גם את וריאציה של פני השטח והעובי החד-שכבתיים. הזרקת נתרן הידרוקסיד בשישה או שמונה מיקרוליטר לדקה דרך I-two.

הערך קצבי זרימה אחרים באמצעות כללי הזרימה בפרוטוקול הטקסט. לווסת את גודל ה-HFC הפנימי על ידי שינוי היחס בין קצבי זרימת ההזרקה QI-two ו-QI-one באמצעות מזרקי ההזרקה. לדוגמה, השתמש ב-QI-one בין 1.3 מיקרוליטר לדקה לארבעה מיקרוליטר לדקה, כאשר ה-QI-two קבוע על שמונה מיקרוליטר לדקה, כדי לגרום לטביעת רגל של נתרן הידרוקסיד של 150 עד 300 תאים.

הזרקת מדיום שלם מהפתחים החיצוניים ביותר בראש ה-MFP בקצב זרימה של 20 מיקרוליטר לדקה כדי להסביר את אידוי המדיום והשאיפה במהלך פעולת ה-hHFC. כדי לעצב את שכבות התא החד-שכבתיות, הגדר את תוכנת הבמה לסרוק את ראש הגשושית מעל התא חד-שכבתי בדפוסים המוגדרים על ידי המשתמש במהירות סריקה של 10 מיקרון לשנייה ומרחק פער של 50 מיקרון. כאשר ה-hHFC המקונן פועל ובמגע עם החד-שכבה, סרוק את ה-MFP עם המסלול של התבנית הרצויה כדי לבצע הסרת תאים מעוצבים.

עבור קוקולטורה לאחר הסרת סוג התא הראשון, זרע קו תאים אחר כדי למלא את החסר, כמו קודם. הכן את תחנת הדגימה לניתוח במורד הזרם של הליזאט. מוצגת כאן דוגמה לתחנת דגימה, הכוללת מחזיק PCR בעל שמונה רצועות מודפס בתלת מימד

נגב את מחזיק הצינור עם 70% אתנול או חומרים מזהמים אחרים על פני השטח, בהתבסס על החומרה הרצויה ליישום. השתמש בקליפ מגנטי על מחזיק הצינור כדי לחבר אותו למחזיק המצע. לאחר הכנת תחנת הדגימה, מקם את ראש ה- MFP במרחק של 100 מיקרון מהחד-שכבה.

התחל להפעיל את ה-hHFC עם תמיסת נתרן הידרוקסיד של 50 מילי-מולרית כנוזל העיבוד לתעלת ההזרקה הפנימית עם קצב זרימה של מיקרוליטר לדקה עבור QI-one, שישה מיקרוליטר לדקה עבור QI-two, מינוס שבעה מיקרוליטר לדקה עבור QA-one ומינוס-17.5 מיקרוליטר לדקה עבור QA-two. לאחר שכליאת הזרימה התייצבה, רד את ראש הגשושית למרחק פער של 50 מיקרון כדי לבצע ליזה מקומית מבוססת נתרן-הידרוקסיד בתת-אוכלוסיית התאים הנבחרת עם hHFC. לאחר השלמת הליזיס של תת-האוכלוסייה, כוון את הראש לכיוון הצינורות בתחנת הדגימה.

הוצא את הליזאט שנאסף ישירות לצינורות ה-PCR. לאחר עיבוד הליזאט, כמתואר בפרוטוקול הטקסט, טען את הליזאט לזרימת עבודה סטנדרטית של qPCR כפי שנקבע על ידי ספק המכשיר. על ידי שליטה ביחס נוזלי ההזרקה ב-HFC ההיררכי, גודל טביעת הרגל במגע עם משטח התא מווסת.

קצבי הזרימה נבחרו, כך שהאפקט הכימי, ולא גזירה, הוא המנגנון הדומיננטי לליזה של תאים. זה אושר על ידי קביעת הגזירה באמצעות דינמיקת נוזלים חישובית. מוצג כאן יצירת רשת של איי תאים על ידי סריקת תכנות מסלול עם המדפסת המשולבת.

אפנון גודל טביעת הרגל באמצעות יחס נוזל ההזרקה מאפשר שליטה ברזולוציה של הסרת התאים. ניתן להשתמש בשיטה זו לתרבית משותפת רציפה של אוכלוסיות תאים מרובות, ובכך ליצור דפוסים מורכבים של אינטראקציות בין תאים. השימוש בנתרן הידרוקסיד כנוזל עיבוד הופך את הליזט לתואם לניתוח מבוסס PCR של התאים.

כאן, תכולת ה-DNA כומתה מחמש וטביעת רגל אחת, בשיטה המתוארת. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו על תאים תוך פחות מ-30 דקות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לוודא שהתעלות והנימים נקיים מבועות אוויר, מכיוון שהדבר עלול להשפיע לרעה על ה-HFC.

אל תשכח שעבודה עם נתרן הידרוקסיד, תמיסה כימית מאכלת, עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון משקפי בטיחות ושכבות מעבדה בעת ביצוע הליך זה. בעקבות הליך זה, אנו יכולים לנתח תאים באופן מקומי על ידי צביעה חיסונית או ריצוף DNA-RNA על ידי ליזה בתיווך MFP על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו אילו חלבונים מתבטאים יתר על המידה עקב כליאה גיאומטרית של תאים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה המולקולרית לחקור איתות בין-תאי וחוץ-תאי במהלך יצירת רקמות וניוון.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעצב באופן חיסר חד-שכבות תאים שהוקמו ב-MFP לעיבוד מקומי וליצור גיאומטריות מורכבות של תרבויות של תאים.