דפוסי Subtractive מהירים של שכבות תא חיות עם בדיקת Microfluidic

המטרה העיקרית של השיטה המוצגת במאמר וידאו זה היא יצירה מהירה של תבניות תאים מוגדרות מרחבית, כדי לאפשר ניתוח ספטיו-טמפורלי (מרחבי-זמני) במקום (in-situ) של אינטראקציות בין תאים. האסטרטגיה המוצגת מנצלת את טכנולוגיית הגשושית המיקרופלואידית. ראש הגשושית, המיוצר במיקרו-פבריקציה, ממקם נפחים של ננוליטרים של כימיקלים ביולוגיים על מצעים ביולוגיים ליצירת תבניות של שכבות תאים חד-שכבתיות (monolayers).

היתרון המרכזי של טכניקת תבנית המבוססת על MFP הוא שהיא כמעט מיידית, הודות לליזיס מקומית, מה שמאפשר שינוי בזמן אמת של התבניות שנוצרות. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר שמנו לב ששיטות אחרות ליצירת תבניות תאים דורשות פרוטוקולים ארוכים ובעלי מספר שלבים לפני שניתן לראות בפועל את הצלחתן של תבניות התאים. כדי להריץ ניסויים יציבים עם כבילה של זרימה הידרודינמית על פני שטח של תא, יש לבצע אופטימיזציה לפרמטרי ה-MFP.

לצורך כך, הדגמה חזותית היא קריטית. Aditya Kashyap ו-Julien Cors ידגימו את ההליך הזה. המודולים התפעוליים של הפלטפורמה כוללים מזרקים ממונעים, במות ממונעות ובקר.

ה-MFP מחוברת לבמה מוטורית בציר Z כדי לשלוט במרחק הרווח בין הראש לבין התשתית, ומחזיק התשתית מחובר לבמות מוטוריות בצירים X ו-Y המהוות את מערכת הסריקה. ראש ה-MFP כולל תעלות זרימה לחיבור לתחנת השאיבה, חורי הרכבה לקיבוע הראש על במת Z, ותעלות היוצאות מהקודקוד המלוטש. הקודקוד מוגדר כמישורי (coplanar) ביחס לתשתית תרבית התאים.

להכנת תחנת השאיבה ומערכת הטיפול בנוזלים, נקו את המזרקים ואת בוכנות המזרקים באמצעות סוניקציה ותמיסת הבעת 0.5% במים אולטרה-טהורים לפני ואחרי ניסויי תאים חיים. שטפו אותם היטב במים. מלאו את המזרקים במים על ידי טבילה מלאה של קצותיהם באמבט מים ושאיבה באמצעות הבוכנה.

בצעו פריקה של הנוזל בזמן שהמזרקים נמצאים במקבץ המים, כאשר גוף המזרק נוגע באטם ביציאה מהמזרק. המשיכו לשאוב ולפרוק עד שלא ייראו בועות אוויר בעמודי המזרקים. חברו את המזרקים הממולאים למשאבות המזרקים באמצעות מחברי lower-lock.

השתמשו בשסתום המיתוג המותקן על המשאבות כדי להפנות את הנוזל מהמזרקה לאחד משני הנימיים המובילים לראש ה-MFP או למכלי השמורה של הנוזלים. רחצו את שני הנימיים באמצעות מים מהמזרקות בקצב זרימה של כ-10 עד 50 µL לדקה, בהתאם לגודל המזרקה, עד שיישארו במזרקות כ-10 µL של מים. נקו את ראש ה-MFP באמצעות סוניקציה עם דטרגנט לזכוכית לניקוי סטנדרטי, או 0.5% bleach לניקוי קפדני, למשך חמש דקות.

נקה את התעלים בעזרת מים על ידי טבילת הקודקוד במים והחלת ואקום על הנקיבים. בחן את התעלים תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לזהות חסימות פוטנציאליות, וחזור על השלב הקודם במידת הצורך. לאחר מכן, התקן את הראש המנוקה על מחזיק הראש והברג את המחבר אל הראש.

הכנס את הנימים שנוקו למתאם מחבר מיקרופלואידי מתאים המקשר למעברים של התעלה בראש. הברג את מחזיק הראש לבמה Z, המשמשת לשליטה על מרחק המרווח בין הראש לשכבת התאים החד-שכבתיות, לפני ביצוע כיול נקודת-סוף כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. קבע מרחק אפס גולמי על ידי הבאת ראש ה-MFP מעל שקופית תא ללא תאים וירידה איטית בצעדים של חמישה מיקרון.

עם מגע של הגשש עם התשבצת, יש להבחין בטבעות ניוטון. זוהי הערכה גסה. מיקום מדויק יתקבל לאחר התאמת המישוריות של קודקוד הגשש ביחס לתשבצת.

כאשר טבעות ניוטון נוצרות, ודאו שהן סימטריות. כדי להבטיח מישוריות של קודקוד הגש (probe apex),כווננו את זווית הראש באמצעות גוניומטר בממשק שבין הראש לבמה ה-Z. העבירו את ראש ה-MFP למרחק של 20 microns מהמצע וכווננו את הזווית באמצעות הגוניומטר.

חזור על פעולות ההורדה, איפוס הנקודה והכוונון של הזווית עד שטבעות ניוטון יהיו סימטריות במגע. לאחר כוונון הזווית, הגדר את מיקום ה-Z, המייצר טבעות ניוטון סימטריות, לאפס. לאחר מכן, הכן את נוזל העיבוד עבור תעלת ההזרקה הפנימית ואת תמיסת בופר המיצוי הדרושה להזרקה החיצונית, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

באמצעות קו הניקוז המחובר למשאבות המזרקים, רייקקו את שאריות המים ושאבו את התמיסות מנופות-הגזים לתוך מזרקי ההזרקה בקצב של 40 microliters לדקה עד שהמזרקים יתמלאו. פעולה זו מבטיחה מילוי נטול בועות של המזרקים, המחברים והקפילריות. להכנת שכבות תאי מونو (monolayers) על שקופיות תא, הרביו תאים בבקבוקי T-flasks בהתאם לפרוטוקולי תרביות תאים סטנדרטיים.

עם הגעת התאים להסנפלואנס (confluence) בבקבוקורי התרבית, בצעו טריפסינציה ואספו את התאים. זרעו 0.2 מיליון תאים לסנטימטר רבוע בכל אחת מהשקופיות בעלות שני התאים לצורך תבניות (patterning). תרבתו את התאים במשך 48 שעות, כאשר התאים באחד התאים ישמשו כביקורת לצמיחת תאים וחיוניותם.

עם הגעת התאים למצב של התמסחות (confluence) על שקופיות התאים, דגרו את התאים למשך 45 דקות עם 500 microliters של תמיסת צבע cell-tracker בריכוז של 10 micromolar, שהוכנה במצע ללא סרום. פעולה זו נועדה להדמיות של התאים במהלך תהליך התבנית (patterning). שטפו את התאים המסומנים ב-PBS על ידי שטיפה עדינה של כל תא באמצעות פיפטה.

לאחר מכן, גדלו את התאים במדריך מתוסף סרום עבור ניסויי התבנית. כלילה הידרודינמית של זרימה (hydrodynamic flow confinement) ממקמת נוזלים באמצעות הזרקה ושאיבה בו-זמנית של נוזל עיבוד. בכלילה היררכית, מספר נוזלי עיבוד מכלים, כאשר ה-HFC החיצוני מגן על הדגימה מה-HFC של עיבוד הפנים.

הזיזו את ה-MFP מעל השכבה החד-שכבתית של התאים למרחק פער של 50 microns מהשקף הזכוכית. מרחק פער זה מבטיח מגע של ה-HFC ההיררכי וכן לוקח בחשבון וריאציות במשטח ובבעוות השכבה החד-שכבתית. מזריקו נתרן הידרוקסיד בקצב של שש או שמונה µL לדקה דרך I-two.

העריכו קצבי זרימה אחרים באמצעות כללי הזרימה המופיעים בפרוטוקול הטקסט. ווסתו את גודל ה-HFC הפנימי על ידי שינוי היחס בין קצבי זרימת ההזרקה QI-two ו-QI-one באמצעות מזרקי ההזרקה. לדוגמה, השתמשו ב-QI-one שבין 1.3 microliters per minute ל-four microliters per minute, כאשר QI-two קבוע על eight microliters per minute, כדי להגיע לטביעת רגל של sodium hydroxide של 150 עד 300 תאים.

הזריקו מצע מלא מהפתחים החיצוניים ביותר של ראש ה-MFP בקצב זרימה של 20 microliters per minute כדי לפצות על התאיידות המצע ושאיבה במהלך פעולתו של ה-hHFC. כדי ליצור תבניות של שכבות תאים חד-שכבתיות (cell monolayers), הגדירו בתוכנת השולחן לסרוק את ראש הגשש מעל שכבת התאים בתבניות המוגדרות על ידי המשתמש, במהירות סריקה של 10 microns per second ובמרחק פער של 50 microns. כאשר ה-hHFC המקנן פועל ובמגע עם השכבה החד-שכבתית, סרקו את ה-MFP במסלול של התבנית הרצויה כדי לבצע הסרה תבניתית של התאים.

עבור תרבית משותפת לאחר הסרת סוג התא הראשון, זרעו קו תאים שונה למילוי הרווחים, כפי שנעשה קודם לכן. הכינו את תחנת הדגימה עבור אנליזה המשכית של הליסאט. מוצג כאן דוגמה לתחנת דגימה, המורכבת מתושב PCR שמונה-פסים המודפס בתלת-ממד.

נגבו את מחזיק המבחנות ב-70% ethanol או בחומרי חיטוי משטחים אחרים, בהתאם לרמת הסטריליזציה הנדרשת ליישום. השתמשו בתסבך מגנטי על מחזיק המבחנות כדי להצמידו למחזיק התשתית. לאחר הכנת תחנת הדגימה, מקמו את ראש ה-MFP במרחק של 100 microns מהשכבה החד-מולקולרית (monolayer).

התחילו להפעיל את ה-hHFC עם תמיסת סודיום הידרוקסיד בריכוז 50 millimolar כנוזל עיבוד עבור תעלת ההזרקה הפנימית, בקצב זרימה של 1 µL/min עבור QI-one, 6 µL/min עבור QI-two, 7- µL/min עבור QA-one, ו-17.5- µL/min עבור QA-two. לאחר שהתגבלות הזרימה תתייצב, הורידו את ראש הגשש למרחק פער של 50 microns כדי לבצע ליזיס מקומי מבוסס סודיום הידרוקסיד בתת-אוכלוסיית התאים שנבחרה באמצעות ה-hHFC. עם השלמת הליזיס של תת-האוכלוסייה, כוון את הראש לעבר המבחנות בתחנת הדגימה.

הזריקו את הליזט שנאסף ישירות אל תוך מבחנות ה-PCR. לאחר עיבוד הליזט, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, העבירו את הליזט למסלול עבודה סטנדרטי של qPCR בהתאם להנחיות ספק המכשיר. על ידי בקרת היחס של נוזלי ההזרקה ב-HFC ההיררכי, ניתן לווסת את גודל טביעת הרגל שבא במגע עם פני התא.

ס debits נבחרו כך שהשפעה כימית, ולא כוחות גזירה, תהיה המנגנון הדומיננטי לליזיס של התאים. דבר זה אושש על ידי קביעת גזירה באמצעות דינמיקה של נוזלים חישובית (CFD). מוצגת כאן יצירה של רשת של איים של תאים באמצעות תכנות מסלול סריקה עם ה-MFP.

ביצוע מודולציה של גודל טביעת הרגל (footprint) באמצעות יחס נוזל ההזרקה מאפשר שליטה ברזולוציה של הסרת התאים. ניתן להשתמש בשיטה זו לתרבית משותפת (coculture) רצופית של אוכלוסיות תאים מרובות, ובכך ליצור דפוסים מורכבים של אינטראקציות בין תאים. השימוש בנתרן הידרוקסיד כנוזל עיבוד הופך את הליזאט לתואם לניתוח של התאים המבוסס על PCR.

כאן, תוכן ה-DNA כומת מחמישה ומחנקלה אחת, שחוללו באמצעות השיטה המתוארת. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה על תאים בפחות מ-30 דקות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לוודא שהתעלות והנימיים נקייה מבועות אוויר, שכן הדבר עלול להשפיע לרעה על ה-HFC.

אל תשכחו כי עבודה עם נתרן הידרוקסיד, תמיסה כימית קורוזיבית, עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון משקפי מגן וחלוקי מעבדה בעת ביצוע הליך זה. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לנתח תאים באופן מקומי באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית או רצף DNA-RNA על ידי ליזיס המתווך על ידי MFP, וזאת כדי לענות על שאלות נוספות, כגון אילו חלבונים מביעים ביטוי יתר כתוצאה מהכבלה גיאומטרית של תאים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו עשויה לסלול את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה המולקולרית לחקור איתות תוך-ותמידי-תאי במהלך התהוות וניוון של רקמות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבצע תבנית חיסורית (subtractive patterning) של שכבות תאיים המקובעות ב-MFP לצורך עיבוד מקומי, וכיצד ליצור גיאומטריות מורכבות של תרביות תאים משולבות (cocultures).