מבחנים כדי זיהוי מבנים המשקף-UV ו לקבוע וחשיבותם העדפות Mate באמצעות מולי המפרש
14 בספטמבר 2016
פרוטוקול זה מתאר את השימוש spectrophotometry לזהות מבנים המשקף-אולטרה סגול על אורגניזמים (בדוגמה זו, מולי מפרש Poecilia latipinna) ומתאר בדיקות בחירה דיכוטומית לדגים המאפשרים היקשים להתבצע על עצמו את התפקיד של רמזים אולטרה סגול במהלך בחירת בן זוג.
המטרה הכללית של זיהוי החזרה של UV בדגים כגון *Poecilia latipinna* היא להבין כיצד מבנים המחזירים UV עשויים להשפיע על התנהגות ההזדווגות של המין. שיטה זו יכולה לסייע לנו להבין העדפות הזדווגות, כגון האם רמזי UV הם חשובים, ואם כן, האם הם נמצאים בשימוש על ידי שני המינים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו לזהות רמזים שעשויים שלא להיות גלויים עבורנו, אך עשויים להיות חשובים מאוד עבור הדגים.
עבור פרוטוקול זה, ראשית יש לכלל ספקטרופוטומטר ומקור אור אל מול תקן לבן ידוע. תאורת החדר צריכה להיות עמומה לפני כל פעולות הכיול. יש לכלל את המכשיר עבור כל אורכי הגל שיימדדו, אשר חייבים לכלול את אורכי הגל בטווח ה-UV שבין 300 ל-400 ננומטר.
כעת, לבשו כפפות והרדימו את הדג בתמיסה של 5% של ethyl 3-aminobenzoate methane sulfonic acid salt, הידועה כ-MS222, המבופרת בכמות שווה של sodium bircarbonate. כאשר הדג הופך לבל תגובתי, העבירו אותו מיד לרקע שחור שאינו מחזיר אור. לפני ביצוע המדידות, העמידו שוב את תאורת החדר על עוצמה נמוכה.
להקלטת נתוני הרפלקטנציה, השתמשו בתוכנת ניתוח. כדי להתאים את ההגדרות המוצגות כאן, הגדירו את זמן האינטגרציה ל-2000 seconds. הגדירו את מספר הסריקות הממוצע לשתיים, ואת ערך החלקת הפיקסלים לחמישה.
כעת, מדדו את רפלקטנציית הדג באמצעות גשש סיב אופטי. החזיקו את הגשש כך שייווצר זווית של 45 מעלות בין הסיבים האופטיים לגוף. חשבו ממוצע של מספר סריקות עבור כל אזור בגוף.
בדקו את רמת החזר האור (reflectance) במספר אזורי הגוף וחפשו שונות בין פרטים. עם הסיום, ניתן להחיל באופן רשות חומר הגנה מסחרי כדי לשחזר את שכבת הריר, ולאחר מכן להחזיר את הדג למכל אחסון מאוורר היטב. לאחר ההתאוששות, הדג יפגין תנועות מכסה זימים (operculum) ושחייה תקינות.
בדיקה זו משתמשת במכל ברירה המצויד במסנני UV ומסננים אטומים. כאשר מחיצות הפלקסיגלאס מוסרות, דג במדור הניטרלי יכול לראות אור במעגל מלא או אור ללא UV הודות למסננים בחלקים שונים של המכל. עבור *P.latipinna*, השתמש באקווריום בדיקה בנפח 75.7 ליטר.
לפני כל בדיקה, ודאו שאין שיתוף של מים או רמזים ריחוניים בין שלושת חלקי המיכל. השתמשו בפרטים הקשובים מינית עבור הבדיקה. עבור נקבת *P.latipinna*, בחרו דגים בטווח של 48 שעות לאחר ההטלה והשתמשו בזכרים שהובדלו למשך 24 שעות לפחות.
לביצוע הבדיקה, העבירו תחילה את חיית הניסוי לתא הניטרלי. לאחר מכן, בחרו שני בני זוג פוטנציאליים הדומים זה לזה ככל האפשר בגודלם, בצבעם ובמאפייני התצוגה שלהם. את התאמת הצבע ניתן לבצע באופן מדויק באמצעות מכשירים או באופן כללי בעין.
כעת, תחת תאורה של ספקטרום מלא, מקמו את אחד משני בני הזוג הפוטנציאליים בכל אחד משני תאי הבחירה. המסננים האטומים ומסנני ה-UV ומחיצות התאים חייבים להיות כולם במקומם. אפשרו לבעלי החיים להתרגל לתנאי זה במשך 15 דקות.
עבור כל ניסוי, הקצה באופן אקראי איזה תא יקבל את הסינון של ה-UV. לאחר מכן, הסר את הכיסויים האטומים מהמחיצות. לאחר 15 דקות, התחל להקליט בעזרת שעון עצר את הזמן שהפרט הנבדק מבלה באזורי העדפה ספציפיים.
השטח שנמצא בטווח של שני אורכי גוף מתא נבחר מהווה אזור העדפה. לחלופין, ניתן להשתמש בתוכנה לרישום אירועים. רשום את פעילות הדגים במשך 15 דקות.
אם הדג אינו מבקר בכל אזור העדפה לפחות פעם אחת, יש להתייחס אליו כאל לא מגיב ולהוציאו מנתוני הניסוי. מדידת החזר ה-UV של *P. latipinna* מראה כי לשני המינים יש מאפייני UV המשתנים בין פרטים. התכונות בולטות ביותר לאורך צידי גופם.
לאחר שנמצאו תכונות UV, מבחן ההבחנה גילה כי הנקבות, אך לא הזכרים, השתמשו במאפיינים אלו בהחלטות ההזדווגות שלהן. מכיוון ששני המינים מחזיקים בתכונות UV, ייתכן שהן מעורבות באינטראקציות חברתיות אחרות, כגון התקבצות לנחילים או חיפוש מזון. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את טכניקות מדידת ה-UV בפחות משעתיים.
ניתן להשלים את ניסויי העדפת בן הזוג בפחות משעה עבור כל דג. בעת ביצוע הפרוצדורה, חשוב לוודא שהדגים נמצאים במצב של קבלה רבייתית. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע ניסויים נוספים לבחינת תפקידם של מאפייני UV בזיהוי פרטים או זיהוי מינים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את השימוש בספקטרופוטומטריה לזיהוי מבנים המחזירים אור על-סגול באורגניזמים, ובאופן ספציפי בדג המולי בעל הסנפיר המגובב Poecilia latipinna. הוא מתאר מבחני בחירה דיכוטומיים לדגים המאפשרים להסיק מסקנות לגבי תפקידם של רמזים על-סגוליים במהלך בחירת בן זוג.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אקולוגיה התנהגותית
- תקשורת בין בעלי חיים
רקע
- הבנת מחזירת UV בדגים יכולה לספק תובנות לגבי התנהגויות הזדווגות.
- רמזי UV עשויים למלא תפקיד משמעותי בבחירת בן או בת זוג.
- גילוי של מחזירת UV דורש טכניקות ייעודיות.
- דגים עשויים לתפוס רמזים שאינם נראים לבני אדם.
מטרת המחקר
- לבחון את השפעתם של מבנים מחזירי UV על התנהגות ההרבעה.
- לקבוע האם רמזי UV חשובים לבחירת בן/בת זוג ב-Poecilia latipinna.
- להעריך את השימוש ברמזי UV על ידי שני המינים במהלך ההרבעה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- כיול של ספקטרופוטומטר ומקור אור אל מול סטנדרט לבן ידוע.
- מדידה של אורכי גל בטווח ה-UV בין 300 ל-400 ננומטרים.
- ביצוע מבחני בחירה דיכוטומיים עם דגיים.
- תצפית על העדפות הזיווג המבוססות על רמזי UV.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מבנים מחזירי UV ב-Poecilia latipinna.
- ראיות לכך שרמזי UV משפיעים על בחירת בן/בת זוג.
- הממצאים מרמזים כי שני המינים עשויים להשתמש ברמזי UV.
- הדגמה של יעילות הספקטרופוטומטריה במחקר ביולוגי.
מסקנות
- החזרה של קרינת UV ממלאת תפקיד מכריע בהתנהגות ההזדווגות של Poecilia latipinna.
- הבנת רמזים אלו יכולה להעמיק את הידע על תקשורת בין דגים.
- ניתן להחיל את השיטות המתוארות על מינים אחרים למחקרים דומים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
הבנת רמזים חושיים שאינם חזותיים, כגון החזרה של UV, מרחיבה את תיקוף המטרות במדעי המוח ההתנהגותיים על ידי חשיפת מסלולים בעלי רלוונטיות מכניסטית בקבלת החלטות חברתיות. בדיקה זו מאפשרת סריקה פנוטיפית של התנהגויות התלויות ברמזים, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית במודלים פרה-קליניים שבהם תפיסה חושית משפיעה על התגובה הטיפולית. השיטה מספקת תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור, המשפרות את הביטחון הניבוי במחקרי מעורבות מטרה הכוללים מעגלים עצביים השולטים בבחירת בן/בת זוג ובזיקה חברתית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות לגבי התנהגויות המונעות על ידי חושים באמצעות בידוד השתקפות UV כמשתנה ביולוגי מדיד.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות זיהוי סטנדרטי של מבנים המשקפים UV בקרב פרטים ובמינים שונים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי מחקר על ידי קביעה האם רמזי UV משפיעים באופן משמעותי על החלטות הזיווג בקרב נקבות של דגי המולי עם סנפיר שراعון.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות עבור תהליכי עבודה המשכיים על ידי אישור נוכחות תכונות UV ושונותיהן לאורך אזורי הגוף.
- ערך תפעולי: מענייה על סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות כיול הספקטרופוטומטר לאורכי גל של UV (300–400 nm) ומיקום עקבי של הפרובה האופטית ב-45 מעלות.
- יכולת הרחבה (Scalability): מדגישה את המוכנות לסריקה ואת האפשרות לשימוש חוזר בפלטפורמה, כאשר מדידת UV השלימה נערכת בפחות משעתיים לכל דג.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: דן ברלוונטיות למחלה על ידי קישור בחירת בן זוג המתווכת על ידי UV לאינטראקציות חברתיות רחבות יותר, כגון התקבצות בלהקות או חיפוש מזון, דבר המצביע על תפקידים פוטנציאליים בזיהוי מינים.
- קידום מותאם סיכון: מתאר המשכיות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני, על ידי הצגה של תכונות UV הקיימות בשני המינים אך רלוונטיות התנהגותית רק בנקבות, דבר המנחה מידול של תגובה ספציפית למין.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מתמקד בערך של הפחתת סיכונים חזויה על ידי הדגמה כיצד מניפולציה של רמזים תחושתיים (מסננים חוסמי UV) משנה את התוצר ההתנהגותי בבדיקות בחירה דיכוטומית.
שילוב בקו תהליך ובזרימת עבודה
ממקם את השיטה בתוך רצף הגילוי, משלב הגילוי המוקדם ועד לזיהוי מוביל (Lead Identification), ובכך תומך בבדיקת השערות לגבי מסלולים תחושתיים ואפיון התנהגותי לפני סריקת תרכובות.
- ביולוגיה של הגילוי: מסביר כיצד השיטה תומכת בבדיקת היפותזות באמצעות כימות השונות בהחזרת UV וקישורה לאזורי העדפת הזיווג, המוגדרים כמרחק של עד שני אורכי גוף מתא הבחירה.
- סריקה: מתאר את מוכנות הבדיקה באמצעות תכנון מבחן בחירה דיכוטומי המשתמש במסנני UV ובמסננים אטומים באקווריום בנפח 75.7 ליטר, מה שמאפשר הערכה אמינה של תרכובות הפועלות כסוכנים מווסתים של החושים.
- אנליטיקה: מדגיש מדידות כגון זמן השהייה באזורי ההעדפה שנרשם באמצעות שעון עצר או תוכנה לרישום אירועים, המספקות קריאות כמותיות להשוואה בין תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה לרציפות פרה-קלינית על ידי הצגה של תכונות UV שעשויות להוות בסיס לזיהוי פרט או מין, מה שמרמז על פוטנציאל להתאמה של סמנים ביולוגיים במודלים של התנהגות חברתית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כבסיס ליכולת שניתן להשתמש בה שוב ולא כטכניקה לשימוש חד-פעמי, ישימה על פני מיני דגים שונים לזיהוי רמזי UV ותקינה של בדיקות התנהגותיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי, תיקוף מטרות, והפחתת עמימות מכניסטית בהתנהגויות מונעות חושים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת התרחבות של מדידת החזר UV ובדיקות העדפת בן/בת זוג.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך התקדמות (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי זיהוי מוקדם של ניצול רמזים ספציפיים למין.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון, בהתבסס על השאלה האם רמזי UV משפיעים באופן משמעותי על בחירת בן/בת זוג באוכלוסיות היעד.
שיקולי יישום
- מומחיות מדעית נדרשת בספקטרופוטומטריה, טיפול בדגים ופרוטוקולים של תצפית התנהגותית.
- צרכי תשתית אנליטית ומיכשור, כולל ספקטרופוטומטר מכויל ל-300–400 nm, גשושית סיב אופטי, חומר הרדמה MS222 ומכל בחירה עם מסנני UV/אטומים.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין צוותים עבור פרוטוקולי הרדמה (5% MS222 עם בופר של סודיום ביקרבונט), תנאי תאורה והגדרות של אזורי העדפה.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודל, כולל מיקום תכונות UV ספציפיות למין ובחירת פרטים בעלי קליטה מינית (נקבות תוך 48 שעות לאחר ההמלטה, זכרים מבודדים למשך 24 שעות).
- מגבלות מעשיות הנתמכות על ידי חומרי המקור: הדגים חייבים להיות בעלי תגובה רבייתית; אי-ביקור בכל אזור העדפה לפחות פעם אחת יוביל לה exclusion של נתוני הניסוי.
