Name: Neonatal לב פיגומים: מטריצות Novel ללימודי הרגנרציה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: למד ליצור פיגומים לבביים מרקמת לב ניאונטלית של עכברים לחקר קרדיולוגיה רגנרטיבית. השיטה מאפשרת חקירת אינטראקציות תא-מטריצה והבנת תכונות המטריצה החוץ-תאית הייחודיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לגב' סינתיה דקאי על הכנת האיורים.

<ol><li>Yusen, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registry+of+the+International+Society+for+Heart+and+Lung+Transplantation%3A+Thirty-second+official+adult+lung+and+heart-lung+transplantation+report--2015%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015.</a> J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).</li>
<li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update%3A+A+report+from+the+american+heart+association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association.</a> Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).</li>
<li>Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+cardiosphere-derived+cells+for+myocardial+regeneration%3A+current+progress+and+recent+results%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results.</a> Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+decellularized+matrix%3A+Using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li>
<li>Porrello, E. R., Olson, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neonatal+blueprint+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A neonatal blueprint for cardiac regeneration.</a> Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).</li>
<li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li>
<li>Polizzotti, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+stimulation+of+cardiomyocyte+regeneration+in+mice+and+human+myocardium+reveals+a+therapeutic+window%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window.</a> Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45(2015).</li>
<li>Jesty, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-kit%2B+precursors+support+postinfarction+myogenesis+in+the+neonatal%2C+but+not+adult%2C+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).</li>
<li>Ambrosy, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Global+Health+and+Economic+Burden+of+Hospitalizations+for+Heart+Failure%3A+Lessons+Learned+From+Hospitalized+Heart+Failure+Registries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries.</a> J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).</li>
<li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Executive+Summary%3A+Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2012+Update+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).</li>
<li>Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regeneration%3A+epicardial+mediated+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">Cardiac regeneration: epicardial mediated repair.</a> Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).</li>
<li>Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+Digested+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Cardiomyocyte+Proliferation+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthcare+Mat%22%5BJournal%5D)">Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro.</a> Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).</li>
<li>Borg, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+extracellular+matrix+components+by+neonatal+and+adult+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes.</a> Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immnol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).</li>
<li>Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+DNA+in+biologic+scaffold+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification of DNA in biologic scaffold materials.</a> J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).</li>
<li>Akhyari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quest+for+an+optimized+protocol+for+whole-heart+decellularization%3A+a+comparison+of+three+popular+and+a+novel+decellularization+technique+and+their+diverse+effects+on+crucial+extracellular+matrix+qualities%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).</li>
<li>Lu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repopulation+of+decellularized+mouse+heart+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells.</a> Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

התלות של טכניקה זו על perfusions החוזרת והנשנית של הלב הופכת את ההימנעות של תסחיף מרכיב קריטי של תוצאה מוצלחת. מתוך הצנתור הראשוני של לב שלבי 2.2-2.6, לשינויים של פתרון בין שלבי 2.8-2.14, יש מניפולציות שיכולים לאפשר כניסתה של בועות אוויר אשר פשר זרימת perfusate לתוך שריר הלב. בשל גודלו הזעיר של הלב בילוד, אפילו בועות דקות בכלי הדם יכולות לגרום אוטם טכני, ובכך הופך decellularization שלם. בנוסף, בשלבים לשטוף אחר כך, זלוף שלם יכול לגרום שאריות דטרגנט כי משפיע לרעה התאמה ביולוגית. יתר...

אי ספיקת לב היא נפוצה וקטלנית. זוהי מחלה פרוגרסיבית כי תוצאות התכווצות ירד של הלב, אשר משבש את זרימת דם לאיברים ועוזב את הדרישות המטבוליות של הגוף מסופק. ההערכה היא כי 5.7 מיליון אמריקנים סובלים מאי ספיקת לב וזה הגורם העיקרי של אשפוז בארצות הברית 9. העלות הקולקטיבית של טיפול בחולים באי ספיקת לב בארצות הברית עולה על 300 $ מיליארדים דולרים בשנת 9-10. הטיפול סופי רק עבור אי ספיקת לב סופנית הוא השתלת לב orthotopic. בכל שנה, ההערכה היא כי יותר מ -100,000 לבבות תורמים נדרשים נהלים השתלה לב בארצות הברית 1-2. לאור המספרים של תורמים המוגבלים, רק כ -2,400 השתלות מבוצעות מדי שנה בארה&quot;ב 2. ברור, מחסור האיבר הזה צריך להיות מטופל כמו אסטרטגיות אחרות נדרשות לייצר איברים נוספים transplantation, באופן אידיאלי, איברים אלה יהיו עצמיים כדי למנוע סיבוכים הקשורים דחיית דיכוי חיסוני בחיים. Cardiomyocytes המבוגר יונק להפגין יכולת התחדשות מוגבלת על פגיעה, אך הראיות אחרונות עולה כי לבבות בילוד יונקים לשמור על יכולת התחדשות מדהימה בעקבות פציעת 5-8. באופן ספציפי, לאחר כריתה כירורגית חלקית, חלון משוב התגלה בין יום לידה ואחרי הלידה 7. זה תקופת משובי מאופיין בחוסר צלקת פיברוטית, היווצרות נאווסקולריזציה, שחרור גורמי angiogenic מן epicardium, ו cardiomyocyte התפשטות 5-8 , 11. חלון משוב זה זמן מספק את הפוטנציאל לשימוש בלב בילוד כמקור רומן של חומר לפיתוח לב bioartificial. מטריקס ידוע לספק רמזים חשובים לקדם cardiomyocytהתפשטות וצמיחה דואר. הבדלים ברורים בזמינויות מולקולות מטריצות הילודים מבוגרים 12 ויכולנו לקדם התחדשות נחקרו 13. מטריצות מבוגרות decellularized שמשו מספר מחקרים לספק פיגום ECM עבור ואכלוס הסלולר והדור של לב bioartificial. בעוד שמחקרים אלה, ותגליות חדשות בטכנולוגיות תאי גזע, מתקדמים במהירות, מספר משוכות טרם נפגשו. לדוגמא, מגבלות בשימור מבנה יליד המטריצה, אינטגרציה הסלולר בקיר מטריקס, ואת היכולת לתמוך התפשטות וצמיחה כל להגביל את ההצלחה של גישה זו. בעוד תכונות התחדשות מעולות כבר ייחסו ללב בילוד, על ההיבטים המעשיים של שימוש ברקמות כגון מוגבל החיפושים שלה. בהתבסס על יכולת ההתחדשות הפגינה הלב בילוד, פתחנו מטריצות רומן על ידי פיתוחטכניקה של decellularization ללב עכבר P3. לב P3 נבחר ללימודים אלה כפי שהוא בתוך החלון של התחדשות לב כמו בעבר נקבע 6 אבל הלב הוא גדול מספיק כדי קציר, decellularize ו recellularize. מטרת המחקר הנוכחי היא להוכיח את ההיתכנות של יצירת מטריצת מלב עכבר בילוד. המחקרים שלנו לספק ראיות על היתכנותו של decellularizing דקה, לב בילוד תוך שמירה על שלמות מבני חלבוניים של ECM. כמו כן, אנו מדגימים את היכולת recellularize ECM לב זה עם cardiomyocytes mCherry לבטא ואנחנו בחנו cardiomyocytes אלה עבור ביטוי של סמנים לבביים שונים הבאים recellularization. טכנולוגיה זו תאפשר בדיקה של עליונות של מטריצה ​​בילוד לפיתוח לב bioartificial.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>1. חומרים לבידוד לב עכבר</גורי</td></tr> <tr><td>עכברים חזקים>P1 (כפי שמוצג; ב6; D2-Tg (Myh6 * -mCherry) 2Mik / J)</td> <td>מעבדות ג'קסון</td><td>21577</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>60 מ"מ צלחת תרבית</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח pH 7.4 (סטרילי)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>להב חד פעמי</td><td>סטנלי</td><td>28-510</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>מספריים סטנדרטיים</td><td>מוריה בון (כלי מדע עדין)</td><td>14381-43</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>מספריים קפיציים 10 ס"מ</td><td>Fine Science</td><td>Tools 15024-10</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 3 מ"מ Cutting Edge</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>או שווה ערך</td></tr> <tr><td>#5 מלקחיים</td><td>Dumnot (Fine Science Tools)</td><td>11295-00</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td colspan="4">2. חומרים למתאם דה>-סלולריזציה</כניסה חזקה</td></tr> <tr><td></td><td>Chemglass</td><td>CG-1013</td><td>מחיצה ניתנת לחיטוי</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Chemglass CG-3022-99</td><td>ניתנת לחיטוי</td></tr><tr><td>1/8 אינץ'. ID x 3/8 OD C-Flex צינורות</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06422-10</td><td>ניתן לחיטוי</td></tr><tr><td>זכר לואר ל-1/8 אינץ' מתאם דוקרני צינור</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K33</td><td>ניתן לחיטוי</td></tr><tr><td>מתאם דוקרני צינור נקבה ל-1/8 אינץ'</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K26</td><td>ניתן לחיטוי</td></tr><tr><td>פרולן 7-0 תפר כירורגי&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>8648G</td><td>או מעמד</td></tr><tr><td>טבעת</td> שווה ערך <td>Fisher Scientific</td><td>S47807</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Clamp</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-6Q</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>מחזיק רגיל Clamp</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-754Q</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>לחבית מזרק 60 סמ"ק&nbsp;</td><td>Coviden</td><td>1186000777T</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Kimble</td><td>14000250</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>22 G x 1 מחט מזרק</td><td>BD</td><td></td><td>305155 או שווה ערך</td></tr><tr><td>12 סמ"ק</td><td>Coviden</td><td>8881512878</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>לזין עצירה תלת כיווני</td><td>Smith Medical</td><td>MX5311L</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>PE50 צינורות</td><td>BD קליי אדמס אינטרמדיק</td><td>427411</td><td>חייב להיות ניתן לעיצוב על ידי חום. מומלץ פוליאתילן.</td></tr><tr><td>1% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>מומלץ בדרגת Ultrapure . הכינו תמיסה טרייה וסננו לעקר לפני השימוש.</td></tr><tr><td>1% טריטון X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>איפור תמיסה טרייה ממלאי של 10% ועיקור מסנן לפני השימוש.&nbsp;</td></tr><tr>מים מטוהרים <td>סטריליים dH2O</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td>או מערכת MilliQ.</td></tr><tr><td>1x עט/סטרפטוקוקוס</td><td>Corning CellGro</td><td>30-001-Cl</td><td>או שווה ערך &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>3. חומרים לכימות DNA</חזק></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>Fisher</td><td>BP1700</td><td>>30 U/mg</td></tr><tr><td>פעילות KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>MgCl2&#183; 6H2O</td><td>Mallinckrodt</td><td>5958-04</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Tris base/hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503/T5941</td><td>או</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת Pico-Green dsDNA</td> שווה ערך <td>Life Technologies&nbsp;</td><td>P7589</td><td>דורש פלואורמטר לקרוא</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>4. שיטה לקיבוע וחתך של רקמה</חזקה></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>או</td></tr><tr><td>ג'לטין שווה ערך מסוג A מעור חזיר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>חייב להיות 300 פריחה ומעלה</td></tr><tr><td colspan="4">5. שיטה להיסטולוגיה של רקמות</חזקה></td></tr><tr><td>Cryomolds 10 x 10 x 5 מ"מ</td><td>Tissue-Tek</td><td>4565</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Hacker/Bright</td><td>Model OTF</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ&nbsp; 25 x 75 x 1 מ"מ</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-19</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Hematoxylin 560&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3801570</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Define</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>מאגר כחול 3803590</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3802915</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>אלכוהולי Eosin Y 515&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>תחליף 3801615</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>לפורמולה 83 קסילן&nbsp;</td><td>CBG ביוטק&nbsp;</td><td>CH0104B</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>מדיום הרכבה Permount&nbsp;</td><td>פישר כימיקלים&nbsp;</td><td>SP15-500</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>נוגדן קולגן IV</td><td>רוקלנד</td><td>600-401-106.1</td><td>או שווה ערך</td></tr> &<tr><td>אלפא;-נוגדן אקטינין</td><td>Abcam</td><td>AB9465</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>mCherry Antibody</td><td>Abcam</td><td>AB205402</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>NKX2.5 נוגדן</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8697</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>חמור נגד עכבר AF488 נוגדן</td><td>Life Technology</td><td>A21202</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>חמור נגד עוף AF594 נוגדן</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-585-155&nbsp;</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>חמור נגד עזים CY5 נוגדן</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>705-175-147</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-587-003</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Mountant עם DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td colspan="4">6. בידוד של קרדיומיוציטים חדריים בילודים באמצעות ציפוי מקדים</חזק></td></tr><tr><td>HBSS (Ca, Mg Free)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30031.02</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Corning CellGro</td><td>25-060-Cl</td><td>או</td></tr><tr><td>מסננת תאים</td> שווה ערך <td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>או שווה</td></tr><tr><td>ערך 50 מ"ל שפופרת</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Primeria 100 מ"מ צלחות</td> משטח <td>Corning</td><td>353803</td><td>Primeria משפר את ההתקשרות הפיברובלסטים ומקדם טוהר מיוציטים גבוה יותר</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Difco</td><td>215240</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8764</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>DMEM (המדיה החיונית המינימלית של Delbecco)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>ויטמין B12&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6629</td><td>או צלחות מצופות</td></tr><tr><td>פיברונקטין שוות ערך&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>354501</td><td>או סרום</td></tr><tr><td>בקר עוברי שווה ערך&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>או שווה ערך</td></tr> כלי <tr><td>זכוכית ביו-ריאקטור לב</td><td>Radnoti Glass Technology</td><td>120101BEZ</td><td>חייב להיות ניתן לעיקור על ידי חיטוי או גז.</td></tr></tbody></table>

neonatal לב פיגומים: מטריצות novel ללימודי הרגנרציה

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

הטיפול הסופי היחיד לאי ספיקת לב בשלב הסופי הוא השתלת לב אורתוטופית. מדי שנה, ההערכה היא כי יש צורך ביותר מ-100,000 לבבות תורמים להליכי השתלת לב בארצות הברית1-2. בשל מספרם המוגבל של התורמים, רק כ-2,400 השתלות מבוצעות מדי שנה בארה"ב. גישות רבות, החל ממחקרי תרפיה תאית ועד השתלת מכשירי עזר מכניים, ננקטו, לבד או בשילוב, בניסיון לשדל את הלב לתקן את עצמו או לנוחאת הלב הכושל. למרות מאמצים אלה, מכשירי עזר לחדר עדיין משמשים בעיקר לצורך גישור להשתלה והתועלת של טיפולים תאיים, למרות שהם טומנים בחובם הבטחה מרפאת, עדיין מוגבלת לניסויים קליניים. בנוסף, נעשה ניסיון להשתלה ישירה אך ההצלחה הוגבלה עקב דחייה חיסונית. ברור שנדרשת אסטרטגיה אחרת כדי לייצר איברים נוספים להשתלה, ובאופן אידיאלי, איברים אלה יהיו אוטולוגיים כדי למנוע את הסיבוכים הקשורים לדחייה ודיכוי חיסוני לכל החיים. דה-סלולריזציה היא תהליך של הסרת תאים תושבים מרקמות כדי לחשוף את המטריצה החוץ-תאית המקורית (ECM) או הפיגום. דה-סלולריזציה של פרפוזיה מציעה שימור מלא של המבנה התלת מימדי של הרקמה, תוך השארת עיקר התכונות המכניות של הרקמה שלמות4. ניתן להשתמש בפיגומים אלה לאכלוס מחדש עם תאים בריאים כדי ליצור מודלים מחקריים ואולי איברים נחוצים מאוד להשתלה. חשפנו את הפיגומים מעכברים יילודים (P3), הידועים כבעלי יכולות התחדשות לב יוצאות דופן,5-8 לדה-סלולריזציה בתיווך חומרי ניקוי ואכלסנו מחדש את הפיגומים הללו בתאי לב של עכברים. מחקרים אלה תומכים בהיתכנות של הנדסת מבנה לב יילודים. הם גם מאפשרים לחקור האם ה-ECM של לבבות מוקדמים לאחר הלידה עשוי להכיל רמזים שיביאו לאסטרטגיות משופרות של התאה.

<html> decellularization בממוצע, זמן decellularization של לב P3 באמצעות פרוטוקול זה הוא כ 14 שעות. מקבלת משקל לב ממוצע של 23 מ&quot;ג עבור ילוד P3. Acellularity איור 3 א מדגימים לב בילוד P3 במלואו ללא פגם (הר שלם). איור 3B מראה את אותו בלב הבא decellularization. איורי 4 א ו -4<...

במחקרים אלה, אנו מספקים מתודולוגיה חדשנית, בילוד, פיגומי לב בעכברים לשימוש במחקרים רגנרטיבית.

Neonatal לב פיגומים: מטריצות Novel ללימודי הרגנרציה

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא לייצר פיגומים (scaffolds) חדשניים מרקמת לב של תינוקות ש newborns לשימוש במחקרי רגנרציה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בקרדיולוגיה רגנרטיבית, ולהביאה מודל חדשני לחקר אינטראקציות בין תאים למטריצה, שכן המטריצה החוץ-תאית מופקת מרקמת לב בעלת יכולת שגשוג.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לגלות מרכיבים חדשים במטריקס החוץ-תאי של היילוד. את התהליך ידגים סטפן קרן, טכנאי במעבדתי. לפני תחילת הפעולה, עברו על מקטע של 4 ס"מ של צינור PE 50 מעל להבת אלכוהול קטנה כדי ליצור קטטר קטן ודק יותר.יש לקצץ את הקצוות לממדים המתאימים כדי לקבל שני קטטרים סימטריים מכל צד של ה-PO, ולהניח לזמן קצר קצה חתוך של הפרוייקציה בתוך הלהבה כדי להמיס פלנג' אחת על הפתח בקצה הדק. לאחר מכן, מלא מזרק של 12 milliliter ב-PBS והרכב ברז תלת-כיווני (three-way stopcock) על המזרק. חבר מחט במידה 22 gauge לברז והחדר את המחט דרך הספטום.לאחר מכן, החליקו את קטטר צינור ה-PE על המחט ושטפו את המכלול ב-PBS. כאשר מכלול הקטטר מוכן, נגבו את בית החזה של היילוד ב-70% ethanol. לאחר מכן, השתמשו במספריים סטנדרטיים כדי לחתוך את העור מהחזה, תוך כדי משיכה לצדדים של הרקמה בעזרת פינצטה מספר חמש.בשלב הבא, בצעו נקב בדופן הבטן ממש מתחת לעצם הסטרנום ותפסו את התהליך החרב (xyphoid process) בעזרת הפינצטה. משכו את הסטרנום לכיוון הראש (רוסטרלית) מהגוף תוך כדי חיתוך הצלעות משני צידי בית החזה, והסיטו את כלוב הצלעות כלפי מעלה. כאשר הלב נראה, משכו את התימוס לצדדים כדי להפריד בין שתי האונות הראשיות, ובכך תחשפו את קשת האורטה ואת הוורידים החלולים והריאתיים.באמצעות מספרי קפיץ באורך 10 סנטימטר, חתכו את העורקים הראשיים היוצאים מקשת האורטה, וכן את האורטה עצמה. אחזו את הקצוות של כלי הדם החתוכים כדי להסיט את הלב קדימה, תוך הפרדתו מהקנה וממסוע המזון (oesophagus), וחתכו בין הריאות ללב ובשני צידי הלב כדי לחתוך את כלי הדם הריאתיים וורידים ראשיים אחרים. לאחר מכן, אחזו את הקצוות החתוכים של כלי הדם הראשיים והוציאו את הלב מהמדיאסטינום, והניחו את הלב בצלחת תרבית של 60 מילימטר המכילה PBS סטרילי.כדי לבצע דסילולריזציה של הלב, מקמו את צלחת התרבית תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי והחדירו את מחט מכלול הקטטר אל תוך האאורטה עד לשסתום האאורטי, אך מבלי לחרוג ממנו. קבעו את המחט באמצעות קשירה אחת של תפר 7-0, כאשר פלנג'ת הקטטר נשענת פרוקסימלית אל הקשירה ליצירת אטימה הדוקה, ובצעו פרפוזיה עדינה של הלב עם PBS. אם אין דליפות, הרקמה תלבנה באופן הומוגני ככל שהדם הלטנטי יוסר.הניחו את המחיצה (septum) לתוך צווארו של מתאם הכניסה וקפלו את דפאות המחיצה מעל הזכוכית. לאחר מכן, חברו מאגר המכיל 60 milliliters של 1%Sodium dodecyl sulfate במים מזוקקים באמצעות צינור באורך מספיק ליצירת עמוד שיוביל ללחץ של 20 millimeters of mercury, ובצעו פרפוזיה של הלב עם SDS למשך 14 שעות. בסיום הפרפוזיה, הלב יהיה שקוף ללא רקמה נראית שנותרה.שטפו את המערכת עד לברז העצירה (stopcock) עם תמיסת ה-SDS שנותרה ומלאו את המאגר ב-10 milliliters של מים דאיוניים. לאחר מכן, שטפו את הלב באמצעות פרפוזיות עוקבות של 10 milliliters של 1% Triton X-100, 10 milliliters של מים דאיוניים, ו-60 milliliters של PBS המכיל פניצילין וסטRepartitionפטומיצין. לאחר הפרפוזיה האחרונה, אחסנו את הלב ב-PBS ואנטיביוטיקה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס.כדי לבצע רחלוצלציה (recellularization) של הרקמה, העבירו את מטריצת הלב עם הקטטר לתוך צלחת תרבית של 60 מילימטר תחת מיקרוסקופ דיסקציה, וחברו לקטטר מזרק של 1 מיליליטר המצויד במחט 22 gauge ומטוען בתאי העניין המתאימים. ודאו שההרכבה נקייה מבועות ובצעו פרפוזיה עדינה של 20 µL מדחלי התאים לדקה אל תוך מטריצת הלב דרך העורקים הכליליים. לאחר שהעברתם 100 µL מהתאים, נתקו את המזרק והשחילו את הקטטר על גבי stub קהה במידה של 22 gauge המחובר למחבר ה-lure בחלק התחתון של מכסה צנצנת הלב בביוראקטור.כעת, הפעילו את המשאבה הפריסטלטית ואשרו שהזרימה ממשיכה מהמאגר דרך המשאבה, דרך מלכודת הבועות אל הקטטר, וכי זרימת הדם הלבבית יוצאת מהורידים ומטפטפת מהשיא (apex), תוך מחזור חוזר למאגר המדיה. בתמונות אלו מוצגת צביעת המטוקסילין ואאוזין של לבבות שלמים ולבבות לאחר הסרת תאים (decellularized). שימו לב להיעדר גרעינים חיוביים להמטוקסילין ולהפחתה במבנים אאוזינופיליים בלב לאחר הסרת התאים.כדי להעריך את הרכב המטריקס ה extracellulal של לבבות רכים, צביעה אימונוהיסטוכימית מדגימה כי קולגן IV מובע בעוצמה הן בלב השלם והן בלב שעבר דה-צלולריזציה, וכי מיקומו של חלבון זה נשמר לאחר הסרת התאים, בעוד שגרעינים חיוביים ל-DAPI הוסרו ביעילות. תכולת ה-DNA פחתה אף היא בלבבות רכים לאחר דה-צלולריזציה מבוססת דטרגנט, בדומה לדיווחים על שימוש בדה-צלולריזציה מבוססת דטרגנט ברקמות אחרות. בתמונות אלו ניתן להבחין בתאי שריר לב (cardiomyocytes) שעברו רה-צלולריזציה ונדדו אל דופן החדר השמאלי.עד 23 ימים לאחר הפרפוזיה, תאים נודדים אלו עשויים להיות חיוביים לסממני תאי אב קרדיאליים, mCherry, סממני קרדיומיוציטים מובחנים או DAPI, כאשר רוב התאים מבטאים את כל ארבעת הסממנים. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בתוך 34 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להבטיח שלא תתרחש תסחיף בלב עקב הכנסת אוויר דרך מכשיר הפרפוזיה.בעקבות פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בייצור ג'ל ובהדפסה בתלת-ממד כדי ליצור השתלות פרוליפרטיביות או אפילו לבבות בתלת-ממד in vitro. טכניקה זו עשויה לסלול את הדרך עבור חוקרים לקידום רגנרציה של השריר הלבבי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן הדה-צלולציה (decellularize) והרי-צלולציה (recellularize) של לב עכבר ניאונטלי.יש לזכור כי עבודה עם Sodium dodecyl sulfate עלולה להיות מסוכנת, ויש להשתמש תמיד באמצעי זהירות כגון מסכת N-95 או מכסוף כימיים בעת טיפול ברכיב בצורת אבקה יבשה.

neonatal-cardiac-scaffolds-novel-matrices-for-regenerative-studies

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שיטות להכנת ג'ל מטריצה ​​בזריקות מרקמות decellularized והזרקת אותו לתוך שריר הלב...

ייצור של חומרים בזריקות נגזר ביולוגית של הנדסת רקמות שריר הלב

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים ייצור של שכבות תרבית תאי לב ביומימטיות העשויות משני חומרים פולימריים נפרדים באמצעות ליתוגרפיה של כוח נימי.  השיטות המתוארות מספקות טכניקה ניתנת להרחבה וחסכונית להנדסת המבנה והתפקוד של רקמות לב מקרוסקופיות ליישומי in vitro ו-in vivo.

נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

ליצירת מבנים מאורגנים מאוד של רקמה מורכבת, יש להרכיב מספר חומרים וסוגי תאים לכדי קומפוזיט משולב.  עיצוב קומבינטורי זה משלב יריעות תאים שכבתיות ספציפיות לאיבר עם שני חומרים נפרדים שמקורם ביולוגית המכילים בסיס מטריצה סיבי חזק, ותאי אנדותל לשיפור היווצרות כלי דם חדשים.

הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות

פרוטוקול זה מתאר מודל הניתן לשחזור של התחדשות הלב על ידי אינדוקציה כירורגית של אוטם שריר הלב בחדר השמאלי של עכברי יום 1 לאחר הלידה. השיטה כוללת אינדוקציה של הרדמה היפותרמית וקשירה של העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי.

אוטם שריר לב עכברים ילודים, מודל התחדשות לב

פרוטוקול זה מתאר את decellularization מלא של שריר הלב האנושי תוך שמירה על מרכיביו מטריצה חוץ-תאית. עיבוד נוסף של התוצאות מטריצה חוץ-תאית בייצור של microparticles ו הידרוג וההספק עצמית של cytoprotective.

עיבוד של רקמת הלב האנושי כלפי עצמי בהרכבת הידרוג במבחנה ויישומים In Vivo מטריצה חוץ-תאית

מטריצה חוץ-תאית הלב (ECM) היא רשת מורכבת של מולקולות שננהל את מפתח בתהליכי רקמות ואיברים שתישא את שיפוץ פיזיולוגיים לאורך החיים. Decellularization מתוקננת לב העובר, למבוגרים היתרי השוואתי ניסיוני של שתי רקמות בהקשר תלת-ממד על-ידי לכידתו ארכיטקטורה מקורית ומאפיינים ביו-מכני.

דומה Decellularization של רקמת הלב העוברי ומבוגרים Explants כמו פלטפורמות דמויי תלת-ממד עבור לימודי חוץ גופית

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת-עובש נטו ליצירת רקמות לגרדום ללא לב תלת מימדי עם המבנית משביע רצון והתנהגות מכות סינכרוני.

שיטה המבוססת על עובש נטו הבריאה ברקמת הלב לגרדום ללא תלת מימדי

פיגומים הסחוס, נגזר decellularized יכול לשמש בדומה לפיגום כדי לתקן סחוס מדריך וכאמצעי לחדש רקמות osteochondral. מאמר זה מתאר את התהליך decellularization בפירוט ומספק הצעות להשתמש פיגומים אלו בהגדרות במבחנה.

ייצור של מטריקס הסחוס, נגזר Decellularized פיגומים

מוצגת כאן סדרה של פרוטוקולים ליצירה ושימור בהקפאה של ספרואידים לבביים (CSs) מקרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם שמקורם בתאי גזע בתרבית בפורמט רב-ממדי בעל תפוקה גבוהה. מודל תלת מימדי זה מתפקד כפלטפורמה חזקה למידול מחלות, הקרנות בתפוקה גבוהה, ושומר על הפונקציונליות שלו לאחר שימור בהקפאה.

ייצור, סינון בתפוקה גבוהה וביו-בנקאות של ספרואידים לבביים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע המושרים על ידי בני אדם

עבודה זו מציגה מודל חייתי של פיברוזיס המושרה על ידי מעבר אנדותל למזנכימלי, כפי שניתן לראות במומים לבביים מולדים כגון היצרות קריטית של אבי העורקים או תסמונת לב שמאל היפופלסטית, המאפשרת הערכה היסטולוגית מפורטת של רקמות, זיהוי מסלולי איתות רגולטוריים ובדיקת אפשרויות טיפול.

מודל השתלת לב חולדה הטרוטופי בילוד לחקר המעבר מאנדותל למזנכימלי

פיברובלסטים שבודדו מהלב האנושי הבוגר תורבתו למפגש על צלחות מצופות ג'לטין כדי לייצר את המטריצה החוץ תאית הספציפית לשריר הלב. לאחר דה-צלולריזציה, מצע זה יכול לשמש לתרבית ומחקר של תאי לב אחרים ואינטראקציות בין תאים למטריצה.

ייצור מטריצה חוץ-תאית לבבית מפיברובלסטים אנושיים בוגרים לציפוי צלחת תרבית

למד ליצור פיגומים לבביים מרקמת לב ניאונטלית של עכברים לחקר קרדיולוגיה רגנרטיבית. השיטה מאפשרת חקירת אינטראקציות תא-מטריצה והבנת תכונות המטריצה החוץ-תאית הייחודיות.

Neonatal לב פיגומים: מטריצות Novel ללימודי הרגנרציה

גלה סרטונים נוספים