בשלב הדמיה כמוני מולטימודליות עם דיגיטלי הולוגרפי מיקרוסקופי מדויקת מעריך דלקת מעיים ו אפיתל ריפוי פצעים

המטרה הכוללת של מחקר זה היא להשתמש במיקרוסקופיה הולוגרפית דיגיטלית או DHM כדי לספק הדמיית ניגודיות פאזה כמותית אוטומטית ללא כתמים של דלקת מעיים דגימות רקמת המעי הגס להערכה רב-מודאלית של ריפוי פצעי אפיתל במבחנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הדלקת במערכת העיכול וריפוי פצעים על פעילות המחלה באדם ובים היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת זיהוי וכימות של תאים ורקמות על ידי פרמטרים פיזיקליים בצורה אובייקטיבית ונטולת כתמים. מי שידגים את ההליכים יהיה Fittest Ketelhut, טכנאי, מהמרכז לטכנולוגיה ביו-רפואית.

הקימו את תרבית התאים, דגרו ארבע פעמים עשר עד החמישית, קאקו שני תאים לסנטימטר בריבוע בצלחות פטרי של 35 מילימטר המצוידות בתוספות תרבית גבוהות במדיום RPMI בתוספת FBS ואנטיביוטיקה ב-37 מעלות צלזיוס ב-95% לחות וחמישה אחוז פחמן דו חמצני. לאחר יומיים יש לטפל בתאים עם הסוכן המעניין ולהחזיר את התרביות לחממה למשך 24 שעות נוספות. למחרת, שאפו את הסופרנטנט והשתמשו בפינצטה כדי להסיר את התוספות.

שטפו את התרבית פעם עד פעמיים עם מיליליטר אחד של מדיום תרבית תאים חוצץ HEPES כדי להסיר את כל התאים המתים וכל הרכיבים התאיים שנותרו מאזור הפצע. לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר של מדיום HEPES טרי וסגרו את המנה. כעת הניחו את צלחת הפטרי במיקרוסקופ ההולוגרפי הדיגיטלי ובחרו את המטרה פי 10.

פתח את תוכנת רכישת התמונות ובחר את מצב ההדמיה של השדה הבהיר. הגדר את תא החימום ל -37 מעלות צלזיוס והנח את התרבית בתא החימום. לאחר מכן, הזיזו את שדה הצפייה עד שניתן יהיה לדמיין פצע מתאים עם שכבת תאים ענקית אחת וגבולות ישרים משני הצדדים ללא תאים מתים או סרום בחלון הניטור החי.

צלם תמונה באור לבן של אזור הפצע הראשוני. לאחר מכן, סובב את תאורת האור הלבן ובחר במצב מיקרוסקופיה הולוגרפית דיגיטלית. הפעל את תאורת הלייזר ובחר זמן חשיפה של פחות משלוש אלפיות השנייה עבור הקלטת ההולוגרמה.

אם שולי ההפרעות ההולוגרפיים מחוץ לגישה מופיעים עם ניגודיות נאותה, צלם הולוגרמה לדוגמה ושחזר תמונת פאזה כמותית עם תוכנת השחזור כדי לבדוק את איכות התמונה. לאחר מכן, התחל תצפית DHM שחלפה זמן על הפצע ועוצר את ההקלטה בנקודת הקצה המתאימה וקבל תמונה סופית של הדגימה תחת תאורת אור לבן. עבור אינדוקציה אקוטית של Dextran Sodium Sulfate, או השראת קוליטיס DSS, ספקו שלושה גרם של DSS מומס ב-100 מיליליטר של מים אוטוקלאבים לעכברים.

לאחר שבעה ימים, השג מקטעים בעובי שבעה מיקרומטר של דגימות מעי גס מגולגל שוויצרי מבעלי החיים הביקורת והמטופלים. טבלו כל חלק ב-50 עד 100 מיקרו ליטר PBS וכסו את הדגימות בהחלקות כיסוי זכוכית בודדות. ודא שתחתית המגלשות נקייה מאבק וזיהום אחר.

לאחר מכן, הנח את השקופית הראשונה על במת המיקרוסקופ והתאם את שדה הראייה עד שאזור העניין של הרקמה נראה לעין. הבא את הדגימה למיקוד חד וצלם תמונת שדה בהיר בתוכנת רכישת התמונה. לאחר מכן, בחר את מצב הדמיית DHM ועבור לתאורת אור הלייזר.

הגדר זמן חשיפה של פחות משלוש אלפיות השנייה וודא ששולי הפרעות הגישה ההולוגרפיות מופיעים עם ניגודיות נאותה בחלון ההדמיה החיה. לאחר מכן, צלם הולוגרמה דיגיטלית של הרקמה. מבחינה אנדוסקופית העדויות לקוליטיס בינונית עד חמורה כוללות עיבוי דופן המעי הגס, שינויים בתבנית כלי הדם, חידוש סיבים וגרגיריות פני השטח הרירית.

הערכה היסטולוגית קונבנציונלית של חתכי המעי הגס מגלה בצקת ניכרת בדופן המעי הגס של DSS שטופל לעומת חיות הביקורת הממוקמות בעיקר בתת-הרירית. תמונות ניגודיות פאזה כמותיות תואמות של DHM ומפות מקדם שבירה קשורות גם כן, מדגימות כי שינויים ברקמות אלה ללא הבדלים נראים לעין בצפיפות של מנסטרומת האפיתל ניכרים במיוחד בדגימות הרקמה המקומיות הלא מוכתמות. מקדם השבירה מופחת משמעותית באפיתל, תת-רירית וסטרומה של עכברי הקוליטיק, בהשוואה לקבוצת הביקורת הבריאה עם מתאם מובהק בין הירידה היחסית במשקל הגוף לבין מקדם השבירה בחיות הניסוי.

כאן מוצג הניטור הרציף המייצג של בדיקת ריפוי פצעים על ידי מיקרוסקופיה הולוגרפית דיגיטלית במשך 45 שעות. מאפשר חישובים של שטח הפנים המכוסה בתא, עובי התא הממוצע והמסה היבשה של התא במהלך תהליך הריפוי. הראינו כי DHM מאפשר ניטור רציף של ריפוי פצעי אפיתל ובמקביל מספק מידע ביולוגי על שינויים בתאים המושרים על ידי ציטוקינים.

יתר על כן, אנו מדגימים את ההערכה המדויקת של נזק היסטולוגי במודלים של קוליטיס ודגימות רקמת מעי גס אנושיות על ידי DHM באמצעות מדידת שינויים במקדם השבירה. מכיוון ש-DHM מבוסס על זיהוי עיכוב אורכי הנתיב האופטי, ניתן לנתח פרמטרים ביופיזיקליים מוחלטים, כגון צפיפות רקמה, מסה יבשה או עובי תאי, על ידי הדמיית ניגודיות פאזה כמותית ללא כתמים. שיאו של DHM עם מיקרוסקופי מחקר נפוצים וחוסנה של הטכניקה סולל את הדרך ליישומים שגרתיים של שיטה זו בביולוגיה של התא ובפתולוגיה דיגיטלית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במיקרוסקופיה הולוגרפית דיגיטלית לניתוח רקמות של תרביות תאים חיות בסביבת המעבדה הביו-רפואית. לסיכום, DHM יוצר כלי בעל ערך, חדשני וכמותי להערכת פרמטרים מוחלטים של דלקת, כמו גם לכימות פשוט של אפיתל מרצון במבחנה עם פוטנציאל גבוה לשימוש אבחנתי תרגומי.