אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור, לעצב ולעטוף תאים בתוך מטריצות תאיות נוספות מבוססות פולימר סינתטי. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות ביולוגיות קריטיות הקשורות לזיהוי רמזים תאיים נוספים המווסתים את תגובות התאים בתוך מיקרו-סביבות הטרוגניות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שנוצרת מטריצה סינתטית חזקה למעטפת תאים ותרבית באמצעות פרוטוקולים וחומרים נגישים.

ניתן להשתמש בשיטה זו לתרבית תאים מבוקרת ולחקר תגובת התאים במבחנה. ניתן ליישם אותו על מערכות אחרות כולל אספקת תרופות והנדסת רקמות. הכן חומרים להיווצרות הידרוג'ל כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

חבר עדשת קולימציה לקצה מוביל האור המלא בנוזל כדי להבטיח עוצמת אור אחידה יחסית בכל הדגימות. התאם את המרחק של מוביל האור מהדגימות כדי להשיג גודל נקודה שיכסה את הדגימות המעניינות. להכנת הידרוג'לים ללא דוגמה, הכינו הידרוג'לים עבים יצוקים בקצות המזרק על ידי פיפטינג של 10 עד 20 מיקרוליטר מתמיסת מבשר הג'ל לקצה מזרק חתוך סטרילי.

הכינו ג'ל בודד לכל מזרק בעובי של כ-0.5 עד 1.5 מילימטרים, בהתבסס על נפח וקוטר המזרק. הכן הידרוג'לים דקים בתבניות שקופיות זכוכית על ידי הנחת אטם הגומי סביב הקצוות של מגלשת הזכוכית הלא מצופה. לאחר מכן, פיפטה חמישה עד 10 מיקרוליטר מתמיסת מבשר הג'ל על מגלשת הזכוכית הלא מצופה.

והנח את מגלשת הזכוכית המצופה באנטי דבק על גבי תמיסת הג'ל. אבטח את מגלשות הזכוכית בעזרת קליפסים קלסר קטנים לייצוב. הגדר את עוצמת המנורה כדי להשיג 10 מילי-וואט לסנטימטר מרובע במשטח הג'ל עבור תבניות קצה מזרק או תבניות שקופיות זכוכית.

שימוש ברדיומטר לזיהוי עוצמה. והניחו את התבניות מתחת למנורה. מרחו אור למשך דקה עד חמש דקות כדי לאפשר פילמור מלא של ג'לים.

השתמש בזמן פילמור קצר יותר עבור ג'לים עם תכולת פוליאתילן גליקול טרפתלט גבוהה יותר. וזמן ארוך יותר לג'לים עם תכולה נמוכה יותר לייצור הידרוג'לים מפולימרים לחלוטין עם מודולים בטווח הרקמות הרכות. מניחים את הג'לים מתבניות קצה המזרק לצלחת סטרילית של 48 בארות שאינה מטופלת, ומניחים שקופיות זכוכית לכלי סטרילי.

להכנת הידרוג'לים בדוגמה, הכינו את תמיסת הפרקורסור כמתואר בפרוטוקול הטקסט ושפכו את התמיסה במרץ כדי להבטיח ערבוב אחיד של התמיסה. לאחר מכן, מכסים ג'לים מוכנים מראש עם פפטיד פנטון בתמיסת פוטו-יוזם ליתיום פוספט, ודוגרים למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הסר תמיסה עודפת.

אם ג'לים מעוצבים בקצה מזרק, השתמשו במרית כדי להעביר בזהירות מצלחת 48 הבאר למגלשת זכוכית סטרילית לדוגמא. הניחו מסכת צילום עם הדוגמה הרצויה ישירות על גבי מזרק וג'לים יצוקים של זכוכית. ודא שהחלק המודפס של המסכה נוגע בג'ל לנאמנות דפוס אופטימלית.

מניחים את הדגימות מתחת למנורה ומקרינים למשך דקה. לאחר הדפוס, הניחו ג'לים יצוקים במזרק לצלחת סטרילית 48 שטופלה היטב שאינה מטופלת בתרבית רקמות. מניחים את הג'לים המעוצבים של מגלשת הזכוכית המודבקים לשקופיות הזכוכית לתוך צלחת סטרילית.

יש לשטוף שלוש פעמים, 15 דקות עם מדיום מתורבת או המאגר המתאים על סמך הניסויים המתוכננים. כדי להתכונן לזיהוי וכימות של תיולים חופשיים בהידרוג'לים עם תבניות פוטו, הכינו תחילה את התמיסות ובצעו את החישובים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. צרו הידרוג'לים דקים לדוגמא כמו קודם.

באופן ספציפי, הכינו ג'לים עם עודף תיולים חופשיים ודפוס מחצית מהדגימות הללו עם פפטיד הפנטון באמצעות החלקת כיסוי שקופה כדי לחשוף את כל הג'ל באור. מניחים ג'לים מעוצבים ולא מעוצבים בבארות של צלחת 48 בארות. שטפו במשך 15 דקות, שלוש פעמים עם מאגר התגובה של אלמן, כדי לאפשר דיפוזיה של המינים המגיבים הסופיים מתוך הג'ל ונפיחות בשיווי משקל.

הוסף מאגר תגובה נוסף של אלמן לג'לי השטיפה, כך שנפח הג'ל הנפוח עם מאגר התגובה יהיה כפולה של 20 מיקרוליטר. לדוגמה, אם נפח הג'ל הנפוח החזוי הוא 15 מיקרוליטר, הוסף חמישה מיקרוליטר של מאגר תגובה. ואם נפח הג'ל הנפוח החזוי הוא 30 מיקרוליטר, הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר תגובה.

פיפטה את הסטנדרטים הסיסטיניים לבארות בודדות של צלחת 48 בארות בכפולות של 20 מיקרוליטר. תלוי בנפח ששימש בשלב הקודם. לדוגמה, אם לשלב הקודם היה נפח ג'ל נפוח, בתוספת מאגר תגובה נוסף השווה ל-40 מיקרוליטר, הוסף 40 מיקרוליטר מכל תקן לבארות ריקות בודדות.

לאחר מכן, יש לדלל את המגיב ואת מאגר התגובה של אלמן. הוסף את המגיב המדולל של אלמן לבארות המכילות תקנים ודגימות. עבור 20 דגימות מיקרוליטר, הוסף 183.6 מיקרוליטר תמיסה לכל באר.

יש לדגור או להניח על שייקר למשך שעה ושלושים דקות, או עד שצבע התמיסה תואם את צבע הג'לים על ידי בדיקה ויזואלית, כדי להבטיח דיפוזיה מספקת של הדיאניון הצהוב 2-ניטרו-5-תיובנזואיקון, שנוצר עם תגובה של המגיב של אלמן עם תיולים חופשיים מהג'ל. קח 100 מיקרוליטר תמיסה מהדגימות והתקנים והניח לבארות של צלחת 96 בארות. קרא את הספיגה ב-405 ננומטר בקורא צלחות.

כדי לדמיין את דפוסי הצילום, הסר את מאגר התגובה העודף על ידי ניגוב עדין סביב שולי ההידרוג'ל עם טישו. המגיב של פיפטה אלמן ישירות על פני הג'ל. תמונה מיידית במיקרוסקופ אור ב-10x או במיקרוסקופ סטריאו עם מצלמה צבעונית.

אסוף את התאים והכן אותם לאנקפסולציה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מיד לאחר שאיבת PBS, השעו את התאים הגלולים בתמיסת המבשר לריכוז סופי של חמשת אלפים תאים למיקרוליטר. השאירו ריכוז מתאים של תיולים חופשיים לתגובה מאוחרת יותר עם פפטיד הפנטון.

אם רצוי דפוס תמונות. עובש, מתפלמר ומעצב הידרוג'לים כמו קודם. שוטפים את הג'לים במשך 10 דקות, שלוש פעמים, במצע גידול לאחר הדפוס כדי להסיר מינים שלא הגיבו ועודף פוטו-יוזם ליתיום פוספט.

דגרו את הג'לים במצע הגידול ב-37 מעלות צליוס וחמישה אחוזי CO2 עד לנקודת הזמן הרצויה להמשך ניתוח. יש לחדש את המדיום כל 48 שעות, או כפי שנקבע על ידי היישומים. כדי לקבוע את כדאיות התאים העטופים, הסר תחילה את מצע הגידול מהג'לים ושטוף במשך 15 דקות, שלוש פעמים, עם PBS כדי לאפשר דיפוזיה של המדיום מהג'לים.

הוסף שני מיקרוליטרים של שני מילי-מולרי אתידיום הומודימר-1 מופשר, ו-0.5 מיקרוליטר של תמיסות סידן AN מופשרות של ארבעה מילי-מולרים, למיליליטר אחד של PBS סטרילי. מערבולת כדי להבטיח ערבוב מלא. הוסף 300 מיקרוליטר של תמיסה עומדת לכל ג'ל תבנית מזרק ב-48 צלחות הבאר, או מספיק כדי לכסות את פני הג'ל על מגלשת זכוכית בכלי סטרילי.

ודוגרים במשך 45 דקות. הסר עודפי תמיסה עומדת ושטוף כדי להסיר עודפי צבע מהג'לים. דמיין את התאים במיקרוסקופ קונפוקלי.

או במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם יכולת של פי 10. ועירור של 488 ננומטר ופליטה של 525 ננומטר. ריכוז התיול החופשי של הידרוג'לים ללא דוגמאות ודוגמאות שכומת עם אלמן הראה כי הידרוג'לים בתחילה פולימריים למשך דקה אחת ולמשך חמש דקות הם בעלי ריכוזי תיול חופשי דומים סטטיסטית, מה שמעיד על תגובה מהירה וג'לציה מלאה תוך דקה אחת.

דפוס בתפזורת שלאחר מכן של הג'לים שהודגרו עם פפטידי פנטון למשך 30 דקות, ולמשך שעה ו-30 דקות, יש הפחתה של 60 עד 80 אחוז בריכוז התיול החופשי, מה שמעיד על שינוי יעיל של עודף התיול. ניתן להבחין בתבניות צילום שנוצרו על ידי אור מאיר דרך דגימות מכוסות במסכות, המודפסות כאן בקווים, בשני ממדים עם יישום המגיב של אלמן. או, בתלת מימד עם שילוב של פפטידים פלואורסצנטיים בהדמיה שלאחר מכן.

תאי גזע אנושיים בוגרים עטופים בתוך hyrogels טופלו בכתמי כדאיות והידרוטוקסיות. וצולם במיקרוסקופיה קונפוקלית. תאים ברי קיימא ללא נזק לממברנה מסומנים בירוק ומעידים על הישרדות התאים יום לאחר האנקפסולציה.

תאים מתחילים להתפשט בתוך המטריצה שישה ימים לאחר האנקפסולציה. כפי שמוצג בתמונה הפנימית. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על נהלי טיפול סטריליים וזהירים כדי למנוע נזק לתאים לאחר אנקפסולציה באמצעות הכנסת מזהמים או שקוף מכני.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ציטומטריית זרימה חיסונית וביטויי גנים כדי לחקור את תפקוד התא וגורלו בתגובה לסביבה התאית הנוספת. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחומי הביולוגיה, הביו-הנדסה והרפואה, לחקור שחיקת אזור רקמה או התקדמות מחלה במטריצות חוץ-תאיות סינתטיות עם בקרת תכונות מוגדרות על ידי המשתמש, לקראת פיתוח אסטרטגיות טיפול חדשות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעטוף תאים, ולעצב מטריצות רכות למחקרי תרבית תאים מבוקרים.