Name: לייזר בסיוע cytoplasmic Microinjection ב משק חי zygotes (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: למדו הזרקה ציטופלזמית בסיוע לייזר בזיגוטות של בעלי חיים מבויתים. שיטה זו מאפשרת מסירת כלים לעריכת גנום כמו CRISPR Cas9 ליצירת בעלי חיים טרנסגניים וחקר פונקציית גנים בצורה יעילה ואמינה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה הקשורה לטכניקה זו נתמכת על ידי NIH/NICHD RO1 HD070044 ו-USDA/NIFA Hatch פרויקטים W-3171 ו-W-2112.

1. ייצור Micropipette <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> micropipette הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח זכוכית נימי בורוסיליקט (קוטר חיצוני (OD): 1.0 מ&quot;מ, קוטר פנימי (ID): 0.75 מ&quot;מ) ב חולץ micropipette (במרכז מחזיקי ימין ושמאל נימים) ונעל אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנית המתאימה למשוך את נימי זכוכית כך התוצאה היא קצה דק עם טאפר ארוך. (דוגמה: חום: 825; משוך: 30; מהירות: 120; זמן: 200; לחץ: 500). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את טפטפות משך מהמכשיר והנח אותו על microforge במצב מאוזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא פיפטה משכה נימת דוד microforge עם חרוז הזכוכית שלה אל מוקד. השתמש reticle העינית כדי למדוד את העובי הרצוי ולעבור פיפטה אופקית עד נימת הדוד מגיעה הקוטר הפנימי היעד (5 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את החום לכ -45% ובעדינות להביא את פיפטה למטה כך הוא בא במגע עם הנימה. הפעל את החימום בקצרה. w זהחולה מעט להמס את פיפטה כך שומר על הנימה ו בקירור, פיפטה תשבור בנקודת מגע יצירת חתך ישר. הערה: הגדרת הטמפרטורה המתאימה היא המפתח בשלב זה מאז בטמפרטורות גבוהות מדי יגרום העיקול פיפטה ובכך חתך ישר לא ניתן יהיה וטמפרטורות נמוכות מדי לא יספיקו כדי להמיס את פיפטה (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן זווית משוערת 30 ° ליד קץ פיפטה ידי מיקומה על 10 מיקרומטר הרחק נימת הדוד. כוונו את הטמפרטורה ל -60% ולהפעיל את החימום. הערה: זה יהיה לכופף את פיפטה על הנימה. זווית זו היא רצויה כך קצה המחט הוא במקביל לפני השטח של צלחת ההזרקה כאשר רכובים לתוך המזרק (האיור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפל טפטפות microinjection בזהירות כפי שהם מאוד חדים ושבריר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> micropipette החזקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים borosilicזכוכית נימי אכלו (OD: 1.0 מ&quot;מ, מזהה: 0.75 מ&quot;מ) ב חולץ micropipette (במרכז מחזיקי נימי ימין ושמאל) ונעל אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנית המתאימה למשוך את נימי זכוכית כך התוצאה היא קצה דק עם ארוך אפילו להתחדד ו קירות מקבילים (דוגמה: חום: 815; משוך: 20; מהירות: 140; זמן: 175; לחץ: 200). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את פיפטה משך מהמכשיר חולץ ומניחים אותו על בעל microforge במצב מאוזן. התאם את המיקוד על נימת חימום פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש reticle העינית כדי למדוד את קוטר פיפטה ולהעביר את פיפטה עד קוטרו מעל הנימה מגיע 180 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו הגודל המצוין, לסמן את נימי זכוכית עם עט בעל חוד יהלום, ולאחר מכן לחץ בעדינות על קצה המשך לשבור את הכוס. זה אמור לגרום חתך ישר (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את פיפטה לתנוחה אנכית עם קצו קרוב הנימה. הגדר את הטמפרטורה<html> של microforge ל -60%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אש-פולני קצה פיפטה באמצעות טכניקות סטנדרטיות 7 עד שהוא מגיע מזהה של 40 מיקרומטר. השתמש reticle העינית יבדוק את התעודה (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן זווית על פיפטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו פיפטה בחזרה למצב אופקי על 10 מיקרומטר הרחק נימה ו -5 מ&quot;מ הרחק קצהו. הגדר את הטמפרטורה לכ 60% ולהפעיל את החימום כדי לכופף את פיפטה על הנימה. המשך חימום עד לזווית רצויה (של כ -30 o) הוא הגיע. בדוק את זווית ראייה (1E איור). הערה: פיפטה בדרך כלל רכובה על microinjector בזווית של כ -60 o ביחס לחלק התחתון של מנת ההזרקה. הטיפ של פיפטה מכופף כך שהוא מקביל התחתון של המנה, אשר הוא הכרחי עבור הזריקה הנכונה של העובר מטוס באמצע שלה. </li></ol></li></ol></li></ol>le &quot;&gt; 2. הגדרת Micromanipulator <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כי microinjectors נטענים באופן מלא עם שמן וכי אין בועות אוויר במערכת (בועות microinjector למנוע בקרה טובה של הזרקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כי micromanipulators נמצא בעמדת המרכז. זה יאפשר מגוון רחב של תנועה של טפטפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס פיפטה מחזיק לתוך מחזיק micromanipulator השמאל פיפטה הזריקה לתוך מחזיק המיקרומניפולציה התקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שמן להיכנס טפטפות ידי קפילריות ולבדוק כי המערכת פועלת כראוי על ידי העברת הנפט מעלה ומטה בתוך פיפטה באמצעות הפקדים microinjector. הערה: אם אין תנועה של שמן בתוך המחטים, ייתכן שיש לסתום. במקרה זה, השתמש מחט חדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפקדים micromanipulator להביא את טפטפות למרכז השדה של מיקרוסקופ מבט. באמצעות הגדלה 4X, לבדוק כי טיפים micropipette נמצאים בזווית הנכונה (עמ &#39;arallel אל החלק התחתון של המנה). הערה: התקנה נכונה של המחטים היא מפתח עבור זריקה מוצלחת ועל עקביות תוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את מערכת הלייזר הבאים במדריך כיול של היצרן. </li></ol> 3. הכנת צלחת הזרקה (איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה 50 μl של התחמם (37 ° C) SOF-HEPES (הרכב המפורטים בסעיף חומרים) בתוספת 20% עוברי בסרום שור (FBS) על במרכז המכסה של צלחת פטרי 100 מ&quot;מ. מניחים 1 - ירידה μl 2 של הפתרון להיות מוזרק קרוב עד טיפת ההזרקה. ודא כי עוברי לא להתקרר מתחת RT. הערה: בפרוטוקול זה נוסיף את צבען אדום-Dextran לפתרון ההזרקה כדי להיות מסוגל לדמיין באתר ההזרקה ולעקוב אחר זה מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את טיפות בצלחת ההזרקה באמצעות כ 10 מ&quot;ל של שמן מינרלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את צלחת ההזרקה על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה ולהביא החרצןettes לתוך ירידת ההזרקה. בדוק כי המחטים הן בפוקוס בתוך הטיפה. וכוון את גובהם לפי הצורך באמצעות הפקדים micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות microdispenser, לטעון על 20 - 30 zygotes (17 - 20 שעות לאחר ההפריה (hpf)) בצד העליון של ירידה ההזרקה. בצע הזרקה בטמפרטורת חדר כך את מספר העוברים בירידת ההזרקה נקבע לפי המהירות שבה האדם יכול להזריק אותם. אל תטען יותר עוברים יותר מאלה שיכולים להיות מוזרק 30 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטעון את העוברים לתוך microdispenser, לוחץ על המתג לחלוטין לטבול את הקצה לתוך התמיסה המכילה את העוברים. געו העוברים שיאספו אותו עם הקצה של נימי הזכוכית (אחד בכל הפעם) ולאט לאט לשחרר את הבוכנה כך כל עובר נכנסה לתוך הנימים. חזור על פעולה זו עד שכל העוברים נאספים או יכולת microdispenser מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשחרר את העוברים הטעונים, לוחץ על המתג בעדינות עד שיתוף כל הנפחntaining עובר הוא שוחרר מן הנימים. </li></ol></li></ol> 4. Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מטרת 4X, טען את הפתרון להיות מוזרק לתוך פיפטה ההזרקה ידי הפעלת לחץ שלילי (aspirating). טען פתרון מספיק להזריק 2 - 3 zygotes. לאחר מכן להעביר עד טיפת ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך טיפת ההזרקה, להזיז את פיפטה מחזיק כך שהקצה מתקרב קרוב זיגוטה. החל לחץ שלילי (לשאוב) עם microinjector ההחזקה כך הזיגוטה מקבל קבוע פיפטה מחזיקה ותיקונים לבוא מטרה 20X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזיגוטה מחוברת פיפטה מחזיקה, לבדוק את איכותו בעזרת פיפטה ההזרקה כדי להזיז את העובר בעדינות ממקום למקום מבלי לנתק אותו. זיגוטה באיכות טובה צריכה שני גופים הקוטביים (אם כי לפעמים רק אחד נתפס) ו הציטופלסמה הומוגנית. אין להזריק zygotes נורמלי (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, לשנות את מיקום העובר עבור זריקה נכונהמקום. מיצוב טוב יהיה זה שבו יש קצת מקום בין ZP וראש הממשלה, כך ראש הממשלה אינו ולהינזק ידי לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כי פיפטה ההזרקה ממוקמת על-המטוס באמצע של העובר על ידי נגיעת הזיגוטה בעדינות באתר הזרקה. אם זה לא על אמצע המטוס שלה, המחט תהיה נוטה להפוך את העובר לסובב במקום לנקב. התאם את הגובה של פיפטה הזריק לפי צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך חור ZP באמצעות לייזר (איור 3 ב). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך שימוש במקום התוכנה של לייזר צלב הכיוון לייזר ZP איפה החור ייעשה (בצד הנגדי למקום שבו העובר מחוברת פיפטה מחזיקה). באמצעות קליק חלון בקרת לייזר על כפתור האש. ודא כי גודלו של החור הוא גדול מספיק כדי ליצור פתח ZP עבור המחט לעבור מבלי לפגוע PM (דוגמה: 0.662 רוחב פולס msec / 6.9 מיקרומטר גודל חור). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את מחט הזריקהדרך חור ZP וליצור קשר עם ראש הממשלה. המשך לדחוף פיפטה קדימה עד שהמחט נמצאת ¾ של הדרך אל העובר (איור 3 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את המיקום של המניסקוס על שלבי פתרון-שמן, כמו זה ישמש לשלוט נפח הזרקה בעקביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לחץ שלילי (לשאוב) על פיפטה ההזרקה, אשר תגרום PM ו הציטופלסמה להיות aspirated לתוך מחט הזריקה. המשך עד שהתנועה של הציטופלסמה לתוך המחט מאיצה או כאשר תוכן הציטופלסמה ערבוב עם פתרון הזרקה ניתן לראות. אלה יציינו שבירה של ראש הממשלה (איור 3D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק בחזרה התוכן ציטופלסמית ואחריו הפתרון לתוך הציטופלסמה של הביצית המופרית על ידי הפעלת לחץ חיובי (הזרקה), עד המניסקוס על שלבי פתרון-שמן התקדם מקביל בקוטר של הזיגוטה אחד בעבר לנקודת ההתחלה. הערה: בתנאים שלנו, repre זהsents כ 7 pl של פתרון מוזרק (איור 3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי מטרת 4X להזיז את העובר / הים המוזרק אל הצד התחתון של ירידת ההזרקה. שחרר את העובר על ידי הפעלת לחץ חיובי על microinjector ההחזקה. שמור את העוברים הלא מוזרק בצד העליון ואת אלה מוזרקים בצד התחתון של הירידה כדי לסייע במעקב אחר של עוברים המוזרקים / הלא מוזרק ולעבוד ביעילות. </li></ol> 5. שחזור העובר תוצאות הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 3 טיפות של כ 200 μl בצלחת חדשה עם טרום חימם SOF-HEPES. אסוף את העוברים מוזרק באמצעות microdispenser (כמתואר לעיל). לשטוף את העוברים מוזרק על ידי העברתם דרך 3 SOF-HEPES טיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את העוברים lysed במהלך microinjection וזורקים אותן. הערה: זיגוטה lysed ניתן להבחין בקלות מתוך אחד שלם מאז הראשון מופיע שקוף, מלא את כל ZP, וזה בדרך כלל יש cytoplasmicתוכן דולף החוצה של העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, סמן את יעילות microinjection באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עליך להיות מודע לכך חשיפה לאור UV יכול לגרום נזק לעובר שיכולים להשפיע על התפתחות שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוצות התרבות של 25 עוברים מוזרק 50 טיפות μl של המדיום אופטימיזציה סימפלקס אשלגן (KSOM) השלימו עם 4 מ&quot;ג / אלבומין בסרום שור מ&quot;ל (BSA) תחת שמן מינרלי על 38.5 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באוויר, והלחות לרוויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים את תרבות התקשורת עם 5% FBS יומיים לאחר ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק הבלסטוציסט (BL) מחירים 7 ימים לאחר ההזרקה. חישוב שיעורי BL כמו מספר כולל של עוברי הבלסטוציסט / מספר כולל של עוברים בתרבית הטיפה. </li></ol>

<ol><li>McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+lipids+in+immature+cattle%2C+pig+and+sheep+oocytes+with+intact+zona+pellucida%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida.</a> J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li>
<li>Ross, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parthenogenetic+activation+of+bovine+oocytes+using+bovine+and+murine+phospholipase+C+zeta%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta.</a> BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).</li>
<li>Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumonji+domain-containing+protein+3+regulates+histone+3+lysine+27+methylation+during+bovine+preimplantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).</li>
<li>Bogliotti, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4+Developmental+outcomes+and+effiency+of+two+CRISPR%2FCas9+microinjection+methods+in+bovine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes.</a> Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).</li>
<li>Bakhtari, A., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DPPA3+prevents+cytosine+hydroxymethylation+of+the+maternal+pronucleus+and+is+required+for+normal+development+in+bovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos.</a> Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+process+of+polishing+borosilicate+glass+capillaries+used+for+fabrication+of+in-vitro+fertilization+%28iVF%29+micro-pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes.</a> Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).</li>
<li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pipette+Cookbook+2015+P-97+%26+P-1000+Micropipette+Pullers%22">Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers</a>. , Sutter Instrument. 
 <a target="_blank" href="www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf">www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf</a> (2015).</li>
<li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22P-97+Flaming%2FBrownTM+Micropipette+Puller+Operation+Manual+Rev.+2.30+-+DOM+%2820140825%29%22">P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825)</a>. , 
 <a target="_blank" href="www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf">www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf</a> (2014).</li>
<li>Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCibelli%2C+JB+%22Principles+of+cloning%22">Principles of cloning</a>. , Academic Press. (2002).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+reporter+gene+after+microinjection+of+mammalian+artificial+chromosomes+into+pronuclei+of+bovine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes.</a> Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

Microinjection של zygotes הוא שיטה מבוססת היטב מציגים פתרונות לעוברי יונקים. עם כמה וריאציות תלויות המין ואת מטרת הניסוי, טכניקה זו יכולה להיות בשימוש נרחב. אנו מראים כיצד לבצע microinjection intracytoplasmic באמצעות לייזר כדי לסייע בכניסה של micropipette בוטה לקצה. Zygotes של כמה מיני בעלי חיים (כמו בקר, כבשים, חזירים) יש הציטופלסמה כהה, שימנע את להדמיה של פיפטה בזריקה אחת בתוך העובר. כמו כן, ממברנות הפלזמה שלהם הן מאוד אלסטי, מה שהופכים החדירה שלהם עם מחט משופע ממוסמר (בדרך כלל ...

microinjection cytoplasmic של עוברי 1 תאים היא טכניקה רבת עוצמה. זה יכול לשמש להעברת כל פתרון לתוך העובר, למשל, לייצר הגן לדפוק-outs ללמוד תפקוד הגן או כדי ליצור חיות הגן בעריכה. רוב חקלאי-רלוונטי zygotes חוות חיות יש רכב חומצות שומן מאוד גבוה שגורם הציטופלסמה שלהם אטום וחשוך 1. יש להם גם קרום פלזמה אלסטי למדי (PM). תכונות אלו הופכות את microinjection באמצעות pronuclear קונבנציונלי / הזרקת ציטופלסמית כפי שמוצגת במינים מכרסמים מאתגרים ולעתים קרובות לא מדויקים. יש microinjection cytoplasmic יתרונות על פני microinjection pronuclear שכן הוא קל יותר לבצע וגם גורם פחות נזק את העוברים מוזרק, וכתוצאה מכך כדאיות גבוהה 2. המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להדגים שיטה מוצלחת לאספקת פתרונות לתוך הציטופלסמה של zygotes חיות משק. כדי להיות מסוגל לבצעmicroinjection cytoplasmic עם יעילות גבוהה על עוברי בעלי חיים, לייזר משמש כדי ליצור חור המעטפת השקופה (ZP) ולאחר מכן מחט זכוכית קהה-end משמש microinjection. אסטרטגיה זו שואפת להקטין את נזק מכני המוטבע על העובר במהלך ההזרקה. לאחר מכן, שאיפה של תוכן ציטופלסמית בתוך המזרק מאפשרת שבירה יעילה ובטוחה של ראש הממשלה להבטיח כי הפתרון מועבר לתוך הציטופלסמה של העובר. טכניקה זו כבר נוצלה בהצלחה בעוברי שור לספק siRNA לתוך הציטופלסמה zygotic 3,4 וליצור מוטציות באמצעות חזרות palindromic קצרות interspaced התקבצו באופן קבוע (CRISPR) / קשור CRISPR מערכת 9 (Cas9) מערכה 5. זה גם מתאים (עם שינויים קלים) להזרקת ביציות קומולוס סגורה שור 6. כאן אנו מתארים פרוטוקול ההזרקה שלנו ומספק צבע, שיכול לחול על הזרקת כל desפתרון IRED לתוך הזיגוטה, ולהראות כי באמצעות טכניקה זו גורמת תמוגה מינימלי ואינו להשפיע על התפתחות העובר המוקדם.

<table><tbody><tr><td>חולץ מיקרופיפטות</td><td>מכשיר סאטר</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>מכשירי סאטר</td><td>נימי זכוכית</td><td>B100-75-10</td><td>נימים אלו משמשים לייצור פיפטות האחיזה וההזרקה. ניתן להשתמש בכל צינורות בורוסיליקט בקיר עבה/סטנדרטי ללא נימה.</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td>מצויד בעדשת הגדלה פי 10.</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>Nikon / Narishige</td><td>NT88-V3</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon</td><td>TE2000-U</td><td>מצויד בעדשות 4X, 20X ובמערכת לייזר.</td></tr><tr><td>מכשירי מחקר</td> <td>לייזר</td><td>7-47-500</td><td>שבתאי 5 לייזר פעיל.</td></tr><tr><td>מיקרו-דיספנסר</td><td>דראמונד</td><td>3-000-105</td><td>המיקרו-דיספנסר משמש להזזת העוברים. ניתן להשתמש גם בפיפטה p10 אך לטעון נפח מינימלי ככל האפשר.</td></tr><tr><td>צלחת תרבית 100 על 15 מ"מ</td><td>פלקון</td><td>351029</td><td>השתמש במכסה הכלי כדי ליצור את צלחת ההזרקה מכיוון שיש להם קירות נמוכים יותר ויקלו על המיקום וההזזה של המיקרומניפולטור. ניתן להשתמש גם במכסה של צלחת תרבות 60 מ"מ.</td></tr><tr><td>צלחת תרבית 35 מ"מ</td><td>קורנינג</td><td>430165</td><td>כלים אלה משמשים לתרבית העוברים ב-50 &mu; l טיפות מכוסות בשמן מינרלי. לחלופין, ניתן להשתמש גם בצלחת 4 בארות. ללא קשר למנה שנבחרה לתרבית העוברים, הם תמיד צריכים להיות מאוזנים באינקובטור לפחות 4 שעות לפני העברת העוברים אליהם.</td></tr><tr><td>חממה</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td>כל חממה שניתן להגדיר ל-38.5 מעלות; C, 5% CO2 ניתן להשתמש בתנאי פחמן.</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td>SMZ800</td><td>משמש להדמיית העוברים בטיפות התרבית ובמהלך שטיפות. ניתן להשתמש בכל סטריאומיקרוסקופ עם הגדלה פי 10.</td></tr><tr><td>יחידת בקרה HT</td><td>Minitube</td><td>12055/0400</td><td>מערכת חימום מחוברת לסטריאומיקרוסקופ.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מחומם שלב</td><td>Minitube</td><td>12055/0003</td><td>מערכת חימום מחוברת לסטריאומיקרוסקופ.</td></tr><tr><td>Dextran-Red</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1828</td><td>תמיסה סטרילית של 10 מ"ג/מ"ל משמשת להזרקה.</td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>סיגמא</td><td>M8410</td><td>שמור את השמן המינרלי בטמפרטורת החדר ומוגן מפני אור באמצעות נייר נייר כסף.</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve Bovine</td><td>Zenit</td><td>ZEBV-100</td><td>בתוספת של 4 מ"ג/מ"ל BSA. יש לאזן את צלחות KSOM לתרבית עוברים בחממה למשך 4 שעות לפחות לפני השימוש.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-525</td><td>השתמש ב-FBS מוסמך לתאי גזע.</td></tr><tr><td>זיגוטות זיגוטות</td><td></td><td></td><td>מוזרקות 17 - 20 hpf וניתן להפיק אותן in-vitro- או in-vivo.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>ריכוז סופי: 107.7 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>ריכוז סופי: 7.16 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>ריכוז סופי: 1.19 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>ריכוז סופי: 0.49 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>נתרן DL-לקטט</td><td>סיגמא</td><td>L4263</td><td>ריכוז סופי: 5.3 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>CaCl2-2H2O&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>C7902</td><td>ריכוז סופי: 1.71 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>D-(&מינוס;)-פרוקטוז&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>F3510</td><td>ריכוז סופי: 0.5 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>H4034</td><td>ריכוז סופי: 21 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>ריכוז סופי: 1x. רכיב של מדיום SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>BME-EAA</td><td>Sigma</td><td>B6766</td><td>ריכוז סופי: 1x. רכיב של מדיום SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>ריכוז סופי: 4 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>סיגמא</td><td>P4562</td><td>ריכוז סופי: 0.33 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>ריכוז סופי: 1 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-3311</td><td>ריכוז סופי: 1 מ"ג/מ"ל. רכיב של מדיום SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G-1397</td><td>ריכוז סופי: 5 &mu; גרם/מ"ל. רכיב של מדיום SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>מים להעברת עוברים</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td>רכיב של מדיום SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>מדיום SOF-HEPES</td><td>מיוצר במעבדה</td><td></td><td>pH 7.3 - 7.4, 280 ו-plusmn; 10 mOs. מסנן מעוקר דרך 22 &mu; ניתן לאחסן מסנן M במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות; C למשך חודש. חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש.</td></tr></tbody></table>

לייזר בסיוע cytoplasmic microinjection ב משק חי zygotes

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

מיקרו-הזרקה ציטופלזמית לעוברים חד-תאיים היא טכניקה חזקה מאוד. כדוגמה, הוא מאפשר העברת כלים לעריכת גנום שיכולים ליצור שינויים גנטיים שיהיו נוכחים בכל תא של אורגניזם בוגר. זה יכול לשמש גם להעברת siRNA, mRNA או נוגדנים חוסמים לחקר תפקוד גנים בעוברים טרום השרשה. הטכניקה המקובלת להזרקת מיקרו עוברים המשמשת במכרסמים מורכבת ממיקרופיפטה דקה מאוד החודרת ישירות לקרום הפלזמה כאשר היא מתקדמת לעובר. כאשר טכניקה זו מיושמת על בעלי חיים היא בדרך כלל מביאה ליעילות נמוכה. הסיבה העיקרית לכך היא שבניגוד לעכברים וחולדות, לזיגוטות בקר, בקר וחזיר יש ציטופלזמה כהה מאוד וממברנת פלזמה אלסטית מאוד המקשה על הדמיה במהלך הזרקה וחדירה של קרום הפלזמה. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטת מיקרו-הזרקה מתאימה להעברת תמיסות לציטופלזמה של זיגוטות בקר שהוכחה כמוצלחת גם עבור עוברי כבשים וחזירים. ראשית, לייזר משמש ליצירת חור ב-zona pellucida. לאחר מכן מוחדר מיקרופיפט זכוכית קהה דרך החור ומתקדם עד שקצה המחט מגיע לכ-3/4 לתוך העובר. לאחר מכן, קרום הפלזמה נשבר על ידי שאיבת תוכן ציטופלזמי בתוך המחט. לבסוף, התוכן הציטופלזמי הנשאף ואחריו תמיסת העניין מוזרק בחזרה לציטופלזמה העוברית. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לאספקת פתרונות שונים לזיגוטות בקר ובקר עם יעילות של 100%, ליזה מינימלית ושיעורי התפתחות בלסטוציסטים תקינים.

ליזר בסיוע microinjection cytoplasmic הוא פרוטוקול חזק ואמין כדי לספק פתרונות לתוך הציטופלסמה של zygotes בעלי החיים. איור 3 מראה בקווים כלליים את zygotes לפני ואחרי ההזרקה כמו גם את קווי המתאר הכלליים של הטכניקה. Dextran-אדום משמש הזרקת פתרון ולאפשר לאתר מעקב של יעילות הזרקת הזרקת ודיוק. משלוח מוצלח של הפתרון מתואר באיור 4 מראה עובר מוזרק לאחרונה שבה לצבוע מופץ בצורה הומוגנית בציטופלסמה. באמצעות טכניקה זו 100% מן ה...

פרוטוקול זה מראה כיצד לבצע מיקרו-הזרקה ציטופלזמית בזיגוטות של חיות משק. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לספק כל פתרון לעובר של תא אחד, כגון כלי עריכת גנום ליצירת בעלי חיים נוקאאוט.

לייזר בסיוע cytoplasmic Microinjection ב משק חי zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להחדיר תמיסות ביעילות אל תוך הציטופלזמה של זיגוטים מבעלי חיים מסוג livestock באמצעות מחט בעלת קצה קהה ובסיוע לייזר. שיטה זו משמשת במחקר ובתחום הטרנס-גנזה של בעלי חיים; מאחר שניתן לשלב אותה עם כלי לעריכה גנומית, כגון מערכת CRISPR Cas9, היא מאפשרת ליצור פרות חדשות לצורך חקר תפקוד גנים ובעלי חיים טרנסגניים בדרך פשוטה ואמינה מאוד. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה להחדרת כל תמיסה אל תוך הציטופלזמה של זיגוטים מבעלי חיים גדולים.יעילות הזרקה של מיומן ממזערת את שיעורי הלומוטיל בכבד של בעלי חיים. ראשית, הכין את מיקרופיפטת ההזרקה על ידי הנחת קפילרה מזכוכית בורוסיליקט בתוך שובך מיקרופיפטות (micropipette puller) ונעילה במקומה. השתמש בתוכנית מתאימה כדי למתוח את הקפילרה כך שתיווצר קצה דק עם היטערות ארוכה.לאחר מכן, הוצא בזהירות את הפ pipette-ים שנמשכו מהמכשיר והנח אותם על microforge במצב אופקי. כוון את המיקוד של ה-pipette שנמשכה ושל חוט החימום של ה-microforge, יחד עם חרוז הזכוכית שבו. השתמש בסרגל העינית (eyepiece reticle) כדי למדוד את העובי הרצוי, והזז את ה-pipette אופקית עד שחוט החימום מגיע לקוטר פנימי של 5 µm.כווננו את החום לכ-45% והורידו בעדינות את הפיפטה כך שתגע בסיב. לאחר מכן, הפעילו את המחמם לזמן קצר. פעולה זו תמיס מעט את הפיפטה כך שתהיה דבוקה לסיב, ובזמן הקירור, הפיפטה תישבר בנקודת המגע, מה שייצור חיתוך ישר.קביעת הטמפרטורה הנכונה היא קריטית בשלב זה. טמפרטורות גבוהות מדי יכופפו את הפיפטה, בעוד שטמפרטורות נמוכות מדי לא יספיקו כדי לחתוך אותה. לאחר מכן, צרו זווית של כ-30 מעלות ליד קצה הפיפטה על ידי מיקום הקצה במרחק של כ-10 µm מסיב החימום.הגדירו את הטמפרטורה ל-60% והפעילו את המחמם כך שהפיפטה תתכופף מעל חוט התיל לזווית הרצויה. באמצעות ההגדרות המוצגות כאן, משכו קפילרה מזכוכית כדי ליצור מיקרו-פיפטה בעלת קצה דק עם היטרויות ארוכה ואחידה ודפנות מקבילות. הוציאו בזהירות את הפיפטה שנמשכה ממכשיר המשיכה והניחו אותה על תושבת המיקרופורג' (microforge) במצב אופקי.השתמשו בסימני הכוונת העינית (reticle) כדי למדוד את קוטר הפיפטה והזיזו את הפיפטה עד שקוטרה מעל הסיב יגיע ל-180 micrometers. סמנו את הקפילרה מזכוכית באמצעות עט עם חוד יהלום ולאחר מכן לחצו בעדינות על הקצה המתוח כדי לשבור את הזכוכית. פעולה זו אמורה להוביל לחיתוך ישר.בשלב הבא, העבירו את הפפיטה למצב אנכי, כאשר הקצה שלה קרוב לסיב החימום. הגדירו את הטמפרטורה של המיקרופורג' (microforge) ל-60% ובצעו ליטוש באש (fire-polish) לקצה הפפיטה, תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות עד שהקוטר הפנימי יגיע לגודל המטרה. מדדו את הקוטר הפנימי של הפפיטה, אשר צריך להיות 40 micrometers.באמצעות אותו הליך כפי שבוצע קודם לכן, כופפו את הקצה לזווית של 30 מעלות. הכניסו את פיפטת ההחזקה למחזיק המיקרו-מניפולטור השמאלי ואת פיפטת ההזרקה למחזיק המיקרו-מניפולטור הימני. לאחר מכן, מלאו את פיפטת ההזרקה בשמן.השתמשו בבקרים של המיקרו-מניפולטור כדי להביא את הפפיטות למרכז שדה הראייה של המיקרוסקופ. באמצעות הגדלה של 4X, ודאו שקצות המיקרו-פפיטות נמצאות בזווית נכונה כך שיהיו מקבילות לתחתית הצלחת. הניחו טיפה של 50 µL של תמיסת SOF-HEPES בטמפרטורה של 37 °C, המועשרת ב-20% FBS, במרכז המכסה של צלחת פטרי בקוטר 100 mm.לאחר מכן, הנח טיפה של 1 עד 2 µL מהתמיס להזרקה בסמיכות לטיפת ההזרקה. לאחר מכן, כסה את הטיפות ואת פלטת ההזרקה באמצעות כ-10 mL של שמן מינרלי. הנח את הפלטה עלבמת המיקרוסקופ והשתמש במיקרו-דיספנסר כדי להעביר כ-20 עד 30 זיגוטים לחלק העליון של טיפת ההזרקה.בעזרת עדשה של 4X, טענו את התמיסה להזרקה לתוך פיפטת ההזרקה על ידי הפעלת לחץ שלילי במיקרו-מזרק. טענו כמות מספקת של תמיסה להזרקה לשני עד שלושה זיגוטים, ולאחר מכן עברו לטיפת ההזרקה. בתוך טיפת ההזרקה, הניעו את פיפטת התמיכה כך שהקצה יתקרב לזיגוט.הפעילו לחץ שלילי באמצעות המיקרו-מזרק המעגן כדי שהזיגוט יקבע לפפיפטת העיגון. לאחר שהזיגוט מעוגן, עברו לעדשה עם הגדלה של 20X. ודאו שפפיפטת ההזרקה ממוקמת במישור המרכזי של העובר על ידי נגיעה עדינה בזיגוט באתר ההזרקה.אם המחט אינה נמצאת במישור המרכזי, היא תגרום לעובר להסתובב במקום לחדור אותו. לאחר מכן, השתמשו בתוכנה כדי למקם את הלייזר בצורה אנכית ב-zona pellucida במקום שבו ייחורר החור. לאחר המיקום הנכון, השתמשו בחלון הבקרה של הלייזר ולחצו על כפתור ה-FIRE.ודאו שגודל החור מספיק גדול כדי ליצור פתח ב-zona pellucida שיאפשר למחט לעבור ללא פגיעה בממברנת הפלזמה. העבירו את מחט ההזרקה דרך החור ב-zona pellucida וצרו מגע עם ממברנת הפלזמה. המשיכו לדחוף את הפ pipette קדימה עד שהמחט חודרת ל-3/4 מעומקו של העובר.עקבו אחר מיקום המניסקוס בממשק שבין התמיסה לשמן. נתון זה ישמש לשליטה עקבית בנפח ההזרקה. הפילו לחץ שלילי על פיפטת ההזרקה כדי לשאוב את ממברנת הפלזמה והציטופלזמה לתוך מחט ההזרקה.המשיכו עד שתנועת הציטופלזמה בתוך המחט תאיץ, או כאשר ניתן יהיה להבחין בתוכן הציטופלזמה מתערבב עם תמיסת ההזרקה. אלו יהוו אינדיקציה לפריצה של ממברנת הפלזמה. הזריקו חזרה את תוכן הציטופלזמה, ולאחריו את התמיסה, אל תוך הציטופלזמה של הזיגוטה, על ידי הפעלת לחץ חיובי עד שהמניסקוס בממשק שבין התמיסה לשמן יתקדם מעבר לנקודת ההתחלה במרחק השווה לקוטר של זיגוטה אחת.לאחר מכן, העבירו לעדשה באגד של 4X, והזיזו את העובר המוזרק לצד התחתון של טיפת ההזרקה. שחררו את העובר על ידי הפעלת לחץ חיובי במיקרו-מזרק התמיכה. אספו את העוברים המוזרקים באמצעות מיקרו-דיספנסר.שטפו את העוברים המוזרקים על ידי העברתם דרך שלוש טיפות של SOF-HEPES וגודלו אותם, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. הזרקה מוצלחת של התמיסה נראית בתמונה הפלואורסצנטית, שבה נעשה שימוש ב-dexion red כדי לעקוב אחר אתר ההזרקה ואת יעילות ודיוק ההזרקה. כאן, הצבע מפוזר באופן הומוגני בציטופלזמה, דבר האופייני לשימוש בטכניקה זו.פרוטוקול זה מציג שיעורי ליזיס מינימליים בזיגוטים של בקר וכבשים. רק מספר קטן של העוברים המוזרקים בבקר או בכבשים עברו ליזיס כתוצאה מהמיקרו-הזרקה. כמו כן, אין הבדלים מובהקים סטטיסטית בשיעורי ההתפתחות לבלסטוציסט בין קבוצות הביקורת לקבוצות המוזרקות, הן עבור עוברים של בקר והן עבור עוברים של כבשים.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בקצב של שני עוברים לדקה. יעילות הזרקה של אדם מיומן ממזערת את שיעורי הבלסטוציסטות בבעלי חיים. לאחר צפייה בסרטון זה, עליך להבין כיצד לבצע מיקרו-הזרקה תוך-ציטופלזמית בסיוע לייזר בזיגוטים של בעלי חיים חקלאיים.וכן כיצד להשתמש בלחץ שאיבה חיובי ושלילי כדי להבטיח את קריעת ממבנה הפלזמה למסירה יעילה.

laser-assisted-cytoplasmic-microinjection-in-livestock-zygotes

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

Microinjection היא שיטה מבוססת ויעילה החדרת חומרים זרים לתוך עוברי דג הזברה מופרית. כאן, אנו להפגין טכניקה microinjection חזקים לביצוע overexpression mRNA, ואת הגן morpholino oligonucleotide מציאה מחקרים דג הזברה.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

וידאו זה מראה כיצד morpholino או mRNA יהיה ניתן להזריק לתוך עוברי דג הזברה בשלב אחד התא כדי להגדיל או להקטין את רמת המוצרים גן מסוים במהלך ההתפתחות הבאים.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

סרטון זה מתאר טכניקה של מיקרו-הזרקה של עוברים כדי להעביר תרכובות לתוך שק החלמון של דג הזברה.

מיקרו-הזרקה עוברית: טכניקה להעברת תרכובת לחלמון דג הזברה

בסרטון זה, אנו מדגימים חדירה בסיוע לייזר של שכבת ההגנה של zona pellucida בביציות מופרות של עכברים כדי להקל על העברת גנים lentiviral. לנטיוירוס מאפשר יצירת בעלי חיים טרנסגניים עם גן מעניין המשולב ביציבות בגנום שלהם.

העברת גנים לנטי-ויראליים בסיוע לייזר: טכניקה לחלחול ביציות מופרות של עכברים כדי להקל על העברת גנים לנטי-ויראליים

Microinjection הוא טכניקה נפוצה בשימוש כדי לספק בונה DNA, mRNAs, אנטיסנס morpholino או טיפולים אחרים לביציות, עובר, ותאים של מינים שונים.

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

שיטות המייצרות עוברי morphant חיוניות ללמוד מנגנוני התפתחות ורשתות רגולציה גן. כוכב הים Patiria miniata הוא מערכת מודל מתעורר ללימודים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול לקבלת תאי רבייה, בהפקת תרבויות של עוברים, וmicroinjection המהיר של zygotes ממין זה.

שיטה לMicroinjection של Minata Patiria Zygotes

זבוב הפירות הים תיכוני (Diptera: Tephritidae) הוא מזיק חקלאי עולמי. הבנה מעמיקה יותר של הביולוגיה שלו היא המפתח לשליטה באוכלוסיות הזבוב הים-תיכוני ובכך להפחית את ההשפעה הכלכלית. מיקרו-הזרקת עובר היא כלי בסיסי המאפשר הן טרנספורמציה של קו הנבט והן מחקרי גנטיקה הפוכה במין זה.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

Microinjection של דג זברה עוברי וזחלים היא טכניקה חיונית ומאתגרת המשמשים דגמים רבים של דג זברה. כאן, אנו מציגים מגוון רחב של כלים microscale כדי לסייע ייצוב והכיוון של דג זברה הן microinjection והן הדמיה.

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

עכבר הביצים, העוברים בשלב מוקדם מוגנים על-ידי zona pellucida, מטריצה גליקופרוטאין המהווה מחסום נגד המסירה הגן. מאמר זה מתאר עבור לנקב את zona עם לייזר כדי מגלי תאים עובריים עם וקטורים lentiviral וכדי ליצור העכברים הטרנסגניים פרוטוקול.

המסירה הגן Lentiviral לייזר בסיוע העכבר מופרית ביצים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיקרו-הזרקה של זיגוטה של CRISPR-Cas9 ודנ"א של תורם כדי לייצר ביעילות קלטות גנים ועכברים פלוקסים.

מיקרו-הזרקה של זיגוטה ליצירת קלטות גנטיות ואללים של פלוקס בעכברים

למדו הזרקה ציטופלזמית בסיוע לייזר בזיגוטות של בעלי חיים מבויתים. שיטה זו מאפשרת מסירת כלים לעריכת גנום כמו CRISPR Cas9 ליצירת בעלי חיים טרנסגניים וחקר פונקציית גנים בצורה יעילה ואמינה.

לייזר בסיוע cytoplasmic Microinjection ב משק חי zygotes

גלה סרטונים נוספים